UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO ESCOLA DE NUTRIÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E NUTRIÇÃO BIOQUÍMICA E FISIOPATOLOGIA DA NUTRIÇÃO

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO ESCOLA DE NUTRIÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E NUTRIÇÃO BIOQUÍMICA E FISIOPATOLOGIA DA NUTRIÇÃO Dissertação ATIVIDADE ANTI-QUORUM SENSING DE EXTRATOS DE GRUMIXAMA (EUGENIA BRASILIENSIS) E PITANGA (EUGENIA UNIFLORA L.) Adeline Conceição Rodrigues OURO PRETO – MG 2015

(2) ADELINE CONCEIÇÃO RODRIGUES ATIVIDADE ANTI-QUORUM SENSING DE EXTRATOS DE GRUMIXAMA (EUGENIA BRASILIENSIS) E PITANGA (EUGENIA UNIFLORA L.) Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Saúde e Nutrição, como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Saúde e Nutrição, área de concentração: Bioquímica e Fisiopatologia da Nutrição. Orientador: Prof. Dr. Uelinton Manoel Pinto OURO PRETO – MG 2015

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(5) AGRADECIMENTO ESPECIAL Ao Prof. Dr.Uelinton Manoel Pinto pela orientação, disponibilidade, sabedoria, dedicação, empenho, motivação e ensinamentos que levarei por toda a vida. Sou grata a você por ter me dado à oportunidade de desenvolver este trabalho, pelo exemplo de profissional que é e que foi durantes esses anos.

(6) AGRADECIMENTOS A Deus. A Universidade Federal de Ouro Preto, ao Programa de Pós Graduação em Saúde e Nutrição pela oportunidade. A CAPES pela concessão da bolsa. Ao CNPq pelo financiamento do projeto. Aos meus pais e minha irmã Aline por serem a melhor parte da minha vida. A minha família de Ouro Preto, Juliana, Vanessa, Eric, Poly, Carla, Angélica, Décio, pela amizade e aconchego familiar. As minhas queridas Anitas, Camila, Karem, Karol e Poly pela amizade. A Michele Cristina Vieira e Caetano, pela paciência e conhecimento. Aos colegas de laboratório pela ajuda, amizade e companhia. A Brígida, Elis, Nayara, Ana Luisa, Bárbara e Flávia pela grande contribuição nos trabalhos. A Profa Michele Bertoldi pela contribuição ao trabalho. A Professora Maria Cristina Dantas Vanetti e o Professor Maurílio Lopes Martins por participarem da banca de defesa e pelas contribuições. A todos que contribuíram com esse trabalho, meus agradecimentos.

(7) RESUMO Muitas bactérias regulam a expressão gênica em resposta a sinais difusíveis produzidos de forma dependente da densidade celular, em um processo denominado quorum sensing. Esse processo ocorre por meio da produção, liberação e detecção de moléculas sinalizadoras. Os fenótipos regulados pelo quorum sensing estão envolvidos nos processos de virulência, esporulação, motilidade, produção de enzimas, bioluminescência, produção de pigmentos, entre outros. A interrupção de qualquer das etapas do sistema quorum sensing pode provocar consequências prejudiciais à virulência bacteriana. Alguns trabalhos evidenciam que extratos à base de plantas apresentam ação anti-quorum sensing, com possíveis aplicações no controle de infecções. Grumixama (Eugenia brasiliensis) e pitanga (Eugenia uniflora L.) são frutas da família das mirtáceas, nativas do Brasil, ricas em compostos fenólicos e apresentam atividade antioxidante e antimicrobiana. Foi objetivo do estudo detectar a atividade anti-quorum sensing dos extratos bruto e fenólico obtidos das frutas grumixama e pitanga em concentrações que não inibem o crescimento microbiano. Os compostos fenólicos das polpas foram extraídos e purificados utilizando extração em fase sólida (mini-coluna C18) e quantificados por espectrofotometria. A atividade anti-quorum sensing dos extratos bruto e fenólico foi avaliada empregando diferentes bactérias e a detecção de diferentes fenótipos. Chromobacterium violaceum foi avaliado pelo ensaio qualitativo de difusão em ágar e pelo teste de quantificação da inibição da produção de violaceína. Em Aeromonas hydrophila e Serratia marcescens foram avaliadas a motilidade tipo swarming e swimming e em C. violaceum, S. marcescens, A. hydrophila e Escherichia coli foi avaliada a formação de biofilme. Os extratos de ambas as frutas apresentaram inibição significativa na produção de violaceína por C. violaceum. Houve também inibição da motilidade bacteriana do tipo swarming e swimming em A. hydrophila e S. marcescens. Os extratos de ambas as frutas aumentaram a formação de biofilme em C. violaceum, A. hydrophila, S. marcescens e E. coli. Esses resultados indicam que os extratos bruto e fenólico de grumixama e pitanga apresentam atividade anti-quorum sensing sugerindo potenciais aplicabilidades nas indústrias alimentícia e farmacêutica, inibindo fenótipos regulados pelo quorum sensing.

(8) Palavras-chave: Quorum sensing. Anti-quorum sensing Extratos fenólicos. Grumixama. Pitanga. ABSTRACT Many bacteria regulate gene expression in response to diffusible signals produced dependently on cell density, in a process called quorum sensing. This process occurs by means of producing, releasing and detecting signaling molecules. The phenotypes regulated by quorum sensing are involved in processes related to virulence, sporulation, motility, production of enzymes, bioluminescence, production of pigments, among others. Interrupting any stage of the quorum sensing system can cause detrimental effects to bacterial virulence. Some studies have shown that plant based extracts have quorum quenching effects, with possible applications in infection control. Grumixama (Eugenia brasiliensis) and pitanga (Eugenia uniflora L.) are fruits that belong to the family Myrtaceae, native to Brazil, rich in phenolic compounds and have antioxidant and antimicrobial activity. The purpose of this study was to evaluate the quorum quenching activity of crude and phenolic extracts obtained from grumixama (Eugenia brasiliensis) and pitanga (Eugenia uniflora L.) in concentrations that do not inhibit microbial growth. Phenolic compounds from the pulps were extracted and purified using solid-phase extraction (C18 mini-column) and quantified by using spectrophotometry. Quorum quenching activity of crude and phenolic extracts was evaluated using different bacteria and the detection of different phenotypes. For instance, Chromobacterium violaceum was evaluated in agar diffusion assay as well as through the quantification of violacein production; for A. hidropyla and Serratia marcescens, swarming and swimming motilities were tested and for C. violaceum, S. marcescens, A. hydrophila and Escherichia coli biofilm formation was assayed. Extracts from both fruits showed significant inhibition of violacein production by C. violaceum. There was also inhibition of bacterial swarming and swimming motilities for A. hydrophila and S. marcescens. The extracts of both fruits increased biofilm formation in C. violaceum, A. hydrophila, S. marcescens, and E. coli. These results indicate that crude and phenolic extracts from grumixama and pitanga present quorum quenching activity suggesting a potential aplication in the food and pharmaceutical industries inhibiting phenotypes regulated by quorum sensing.

(9) Keywords: Quorum sensing. Quorum quenching. Phenolic extracts. Grumixama. Pitanga. LISTA DE FIGURAS Figura 1- Estrutura química da AHL, que consiste em um anel homoserina-lactona, ―n‖ representa as cadeias laterais com variação acila, podendo ir de dois a dezoito carbonos. ―R‖ indica moléculas de H, OH ou O. ............................................................................................ 20 Figura 2 – A) e B) Grumixama vermelha e amarela. C) Grumixama vermelha. D) Grumixama amarela. E) Sementes de grumixama. ...................................................................................... 34 Figura 3 – A) Grumixameira. B) Grumixameira vermelha florida. C) Grumixameira amarela florida. ...................................................................................................................................... 34 Figura 4 – A) Pitangas em diferentes estágios de maturação. B) e C) Sementes de pitanga. .. 35 Figura 5 – A) Pitangueira. B) Florescência da pitangueira e pitangueira com frutos. ............. 36 Figura 6 - Ensaio qualitativo da inibição do quorum sensing em C. Violaceum com extrato bruto de grumixama. A) Placa com todos os resultados. B-H) Resultados discriminados por pocinho. B) Canamicina (100 µg/ml) – Controle da inibição do crescimento, C) Controle negativo - Água destilada estéril, D) 2520,5 mg AGE/L, E) 504,10 mg AGE/L, F) 252,05 mg AGE/L, G) 168,03 mg AGE/L e H) 126,02 mg AGE/L de extrato bruto de grumixama....... 43 Figura 7 - Ensaio qualitativo da inibição do quorum sensing em C. Violaceum com extrato fenólico de grumixama. A) Placa com todos os resultados. B-H) Resultados discriminados por pocinho. B) Canamicina (100 µg/ml) – Controle da inibição do crescimento, C) Controle negativo - Água destilada estéril, D) 2998,5 mg AGE/L, E) 599,70 mg AGE/L, F) 299,85 mg AGE/L, G) 199,9 mg AGE/L e H) 149,92 mg AGE/L de extrato fenólico de grumixama. ... 43 Figura 8 - Ensaio qualitativo da inibição do quorum sensing em C. Violaceum com extrato bruto de pitanga. A) Placa com todos os resultados. B-H) Resultados discriminados por pocinho. B) Canamicina (100 µg/ml) – Controle da inibição do crescimento, C) Controle negativo - Água destilada estéril, D) 1472,3 mg AGE/L, E) 294,46 mg AGE/L, F) 147,23 mg AGE/L, G) 98,15 mg AGE/L e H) 58,98 AGE/L de extrato bruto de pitanga. ...................... 44

(10) Figura 9 - Ensaio qualitativo da inibição do quorum sensing em C. Violaceum com extrato fenólico de pitanga. A) Placa com todos os resultados. B-H) Resultados discriminados por pocinho. B) Canamicina (100 µg/ml) – Controle da Inibição do crescimento, C) Controle negativo - Água destilada estéril, D) 2315,2 mg AGE/L, E) 463,04 mg AGE/L, F) 231,15 mg AGE/L, G) 154,35 e H) 115,76 mg AGE/L de extrato fenólico de pitanga. .......................... 44 Figura 10 - Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato bruto de grumixama em diferentes concentrações e avaliação do crescimento microbiano (Log UFC ml -1) após 24 horas de incubação na presença dos extratos. O controle consistiu do meio LB adicionado de 200 µl de água destilada esterilizalada. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem estatisticamente entre si (p<0,05). ........................................................................................... 48 Figura 11 - Inibição da produção de violaceína pelo extrato bruto de grumixama. A) Controle, B) Furanona na concentração de 39,4 µm, C) Extrato bruto de grumixama na concentração de 100,82 mg AGE/L, D) Extrato bruto de grumixama na concentração 50,41 mg AGE/L, E) Extrato bruto de grumixamana concentração 33,61 mg AGE/L e F) Extrato bruto de grumixama na concentração de 25,21 mg AGE/L. .................................................................. 49 Figura 12 - Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de grumixama em diferentes concentrações e avaliação do crescimento microbiano (Log UFC ml-1) após 24 horas de incubação na presença dos extratos. O controle consistiu do meio LB adicionado de 200 µl de água destilada esterilizada. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem estatisticamente (p<0,05). ........................................................................................... 50 Figura 13 - Inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de grumixama. A) Controle, B) Furanona na concentração de 39,4 µm, C) Extrato fenólico de grumixama na concentração de 119,94 mg AGE/L, D) Extrato fenólico de grumixama na concentração 59,97 mg AGE/L, E) Extrato fenólico de grumixama na concentração 39,98 mg AGE/L e F) Extrato fenólico de grumixama na concentração de 29,99 mg AGE/L. ............................................... 50 Figura 14 - Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato bruto de pitanga em diferentes concentrações e avaliação do crescimento microbiano (Log UFC ml -1) após 24 horas de incubação na presença dos extratos. O controle consistiu do meio LB adicionado de 200 µl de água destilada esterelizada. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem estatisticamente (p<0,05). ........................................................................................................ 51 Figura 15 - Inibição da produção de violaceína pelo extrato bruto de pitanga. A) Controle, B) Furanona na concentração de 39,4 µm, C) Extrato bruto de pitanga na concentração de 58,89 mg AGE/L, D) Extrato bruto de pitanga na concentração de 29,44 mg AGE/L, E) Extrato

(11) bruto de pitanga na concentração de 19,66 mg AGE/L e F) Extrato bruto de pitanga na concentração de 14,72 mg AGE/L. .......................................................................................... 52 Figura 16 - Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de pitanga em diferentes concentrações e avaliação do crescimento microbiano (Log UFC ml -1) após 24 horas de incubação na presença dos extratos. O controle consistiu do meio LB adicionado de 200 µl de água destilada esterelizada. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem estatisticamente (p<0,05). ........................................................................................................ 52 Figura 17 - Inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de pitanga. A) Controle, B) Furanona na concentração de 39,4 µm, C) Extrato fenólico de pitanga na concentração de 92,61 mg AGE/L, D) Extrato fenólico na concentração de 46,30 mg AGE/L, E) Extrato fenólico de pitanga na concentração de 30,87 mg AGE/L e F) Extrato fenólico de pitanga na concentração de 23,15 mg AGE/L. .......................................................................................... 52 Figura 18 - Efeito do extrato de grumixama sobre a motilidade tipo swimming em S. Marcescens e A. Hydrophila IOC/FDA110-36. A-C) Testes com S. Marcescens e D-E) Testes com A. Hydrophila IOC/FDA110-36. A) Controle: S. Marcescens, B) Extrato bruto de grumixama na concentração de 101,02 mg AGE/L, C) Extrato fenólico de grumixama na concentração de 119,94 mg AGE/L. D) Controle: A. Hydrophila IOC/FDA110-36, E) Extrato bruto de grumixama na concentração de 252,05 mg AGE/L, F) Extrato fenólico de grumixama na concentração de 299,85 mg AGE/L. ................................................................ 56 Figura 19 - Efeito do extrato de grumixama sobre a motilidade tipo swarming em S. Marcescens e A. Hydrophila IOC/FDA110-36. A-C) Testes com S. Marcescens e D-E) Testes com A. Hydrophila IOC/FDA110-36. A) Controle: S. Marcescens, B) Extrato bruto de grumixama na concentração de 101,02 mg AGE/L, C) Extrato fenólico de grumixama na concentração de 119,94 mg AGE/L. D) Controle: A. Hydrophila IOC/FDA110-36, E) Extrato bruto de grumixama na concentração de 252,05 mg AGE/L, F) Extrato fenólico de grumixama na concentração de 299,85 mg AGE/L. ................................................................ 56 Figura 20 - Efeito do extrato de pitanga sobre a motilidade tipo swimming em S. Marcescens e A. Hydrophila IOC/FDA110-36. A-C) Testes com S. Marcescens e D-E) Testes com A. Hydrophila IOC/FDA110-36. A) Controle: S. Marcescens, B) Extrato bruto de pitanga na concentração de 58,89 mg AGE/L, C) Extrato fenólico de pitanga na concentração de 92,61 mg AGE/L. D) Controle: A. Hydrophila IOC/FDA110-36, E) Extrato bruto de pitanga na concentração de 58,82 mg AGE/L, F) Extrato fenólico de pitanga na concentração de 213,52 mg AGE/L. ............................................................................................................................... 57

(12) Figura 21- Efeito do extrato de pitanga sobre a motilidade tipo swarming em S. Marcescens e A. Hydrophila IOC/FDA110-36. A-C) Testes com S. Marcescens e D-E) Testes com A. Hydrophila IOC/FDA110-36. A) Controle: S. Marcescens, B) Extrato bruto de pitanga na concentração de 58,89 mg AGE/L, C) Extrato fenólico de pitanga na concentração de 92,61 mg AGE/L. D) Controle: A. Hydrophila IOC/FDA110-36. E) Extrato bruto de pitanga na concentração de 58,82 mg AGE/L, F) Extrato fenólico de pitanga na concentração de 213,52 mg AGE/L. ............................................................................................................................... 58 Figura 22 - Formação de biofilme na presença do extrato bruto de grumixama. A) C. Violaceum ATCC6357. B) S. Marcescens. C) A. Hydrophila IOC/FDA110. E) E. Coli ATCC10536. ............................................................................................................................ 60 Figura 23 - Formação de biofilme na presença do extrato fenólico de grumixama. A) C. Violaceum ATCC6357. B) S. Marcescens. C) A. Hydrophila IOC/FDA110. E) E. Coli ATCC10536. ............................................................................................................................ 61 Figura 24 - Formação de biofilme na presença do extrato bruto de pitanga. A) C. Violaceum ATCC6357. B) S. Marcescens. C) A. Hydrophila IOC/FDA110 E) E. Coli ATCC10536. ... 62 Figura 25 - Formação de biofilme na presença do extrato fenólico de pitanga. A) C. Violaceum ATCC6357. B) S. Marcescens. C) A. Hydrophila IOC/FDA110. E) E. Coli ATCC10536. ............................................................................................................................ 63

(13) LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Exemplos de moléculas sinalizadoras e fenótipos regulados pelo sistema quorum sensing em bactérias................................................................................................................. 24 Tabela 2 - Quorum sensing em bactérias deterioradoras de alimentos. ................................... 26 Tabela 3 - Compostos naturais com atividade anti-quorum sensing. ...................................... 29 Tabela 4 - Concentração Inibitória Mínima expressa em quantidade de compostos fenólicos totais (mg AGE/L) obtidas dos extratos bruto e fenólico de grumixama. ............................... 45 Tabela 5 - Concentração Inibitória Mínima expressa em quantidade de compostos fenólicos totais (mg AGE/L) obtidas dos extratos bruto e fenólico de pitanga. ...................................... 45

(14) LISTA DE ABREVIAÇÕES AGE/L - Ácido Gálico Equivalente/Litro AHL -Acil Homoserina Lactona AI-1 -Autoindutor 1; Acil Homoserina Lactona AI-2 - Autoindutor-2 AI-3 - Autoindutor-3 AIP - Peptídeos autoindutores CV026 - Estirpe mutante de Chromobacterium violaceum biossensora de AHL DFS - Fator de sinal difusível DMSO - Dimethylsulfoxide, diluente ou solvente LB - Luria Bertani, meio de cultura bacteriano MIC - Concentração inibitória Mínima PQS - Heptil-3-hidroxi-4-quinolona, sinalizador encontrado em Pseudomonas aeruginosa RPM - Rotações por minuto UFC -Unidades Formadoras de Colônia

(15) SUMÁRIO 1 – INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 17 2 – REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................... 18 2.1 - Quorum sensing ........................................................................................................... 18 2.1.1 - Mecanismo de comunicação ................................................................................. 18 2.1.2 – Principais fenótipos regulados pelo sistema quorum sensing............................... 22 2.1.3 - Sistema quorum sensing e sua relação com a deterioração dos alimentos ............ 26 2.1.4 - Mecanismo de inibição do sistema quorum sensing ............................................. 27 2.2 - Produtos naturais inibidores do quorum sensing ......................................................... 28 2.3 - Compostos fenólicos .................................................................................................... 31 2.3.1 - Definição, formação e função ............................................................................... 31 2.4 - Grumixama (Eugenia brasiliensis) .............................................................................. 33 2.5 - Pitanga (Eugenia uniflora L.) ...................................................................................... 35 3 – OBJETIVOS ..................................................................................................................... 37 3.1 - Objetivos ...................................................................................................................... 37 4 – MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................... 37 4.1 - Material vegetal............................................................................................................ 37 4.1.2. Preparo do material vegetal .................................................................................... 37 4.2 - Extração e purificação de compostos fenólico ............................................................. 38 4.3 - Compostos fenólicos totais .......................................................................................... 38 4.4. - Estirpes bacterianas utilizadas .................................................................................... 38 4.5 - Determinação in vitro da atividade anti-quorum sensing dos extratos brutos e fenólicos .............................................................................................................................................. 39 4.5.1 - Teste qualitativo da inibição do quorum sensing em C. violaceum ...................... 39 4.5.2- Teste da concentração inibitória mínima (MIC) .................................................... 39 4.5.3 - Quantificação da inibição da produção de violaceína por C. violaceum............... 40 4.5.4 - Efeito anti-quorum sensing na motilidade tipo swimming e swarming em A. hydrophila e S. marcescens .............................................................................................. 40 4.5.5- Determinação in vitro da inibição da formação de biofilme em C. violaceum, S. marcescens, A. hydrophila e E. coli ................................................................................. 41 4.6 - Análises estatísticas...................................................................................................... 41 5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................................... 42 5.1 - Compostos fenólicos totais .......................................................................................... 42

(16) 5.2 - Teste qualitativo de inibição do quorum sensing em C. violaceum ............................. 43 5.3 - Concentração Inibitória Mínima (MIC) ....................................................................... 45 5.4 - Quantificação da inibição da produção de violaceína por C. violaceum ATCC 6357. 47 5.4.1 - Quantificação da inibição da produção de violaceína pelos extratos obtidos de grumixama ........................................................................................................................ 47 5.4.2 - Quantificação da inibição da produção de violaceína pelos extratos obtidos de pitanga............................................................................................................................... 50 5.5 - Efeito dos extratos de grumixama sobre a motilidade tipo swimming e swarming em S. marcescens e A. hydrophila IOC/FDA110-36 ..................................................................... 55 5.6 – Efeito dos extratos sobre a formação de biofilme em C. violaceum ATCC6357, S. marcescens, A. hydrophila IOC/FDA110-36 e E. coli ATCC10536 ................................... 59 6 - CONCLUSÃO ................................................................................................................... 65 7 - REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 66

(17) 1 – INTRODUÇÃO Com o objetivo de trazer benefícios à comunidade microbiana, as bactérias possuem um comportamento individual e também cooperativo. O comportamento cooperativo envolve a comunicação dependente da densidade celular denominada quorum sensing. Esse sistema envolve a produção, a detecção de moléculas sinalizadoras e a ativação de genes específicos. Moléculas sinalizadoras são produzidas pelas bactérias, normalmente se difundem livremente pela membrana e acumulam no ambiente circulante. O aumento da população microbiana leva ao acúmulo dessas moléculas sinalizadoras até atingirem um limiar basal, necessário para a sua detecção por receptores específicos. O complexo sinalizador/receptor regula a expressão de genes modulando fenótipos bacterianos. Este sistema normalmente atua na forma de um feedback positivo para a produção de moléculas sinalizadoras, por isso, essas moléculas são comumente denominadas de autoindutores. Os fenótipos regulados pelo quorum sensing envolvem motilidade, formação de biofilme, resistência a antibióticos, melhora na absorção de nutrientes, bioluminescência, produção de pigmentos, funções de virulência e deterioração de alimentos. O sistema quorum sensing opera principalmente por sinalizadores denominados Acil Homoserina Lactonas (AHLs) em bactérias Gram-negativas, oligopeptídeos em bactérias Gram-positivas e Autoindutor 2 (AI-2) que pode ser usado por ambos grupos bacterianos. A comunicação pode ocorrer entre a mesma espécie e entre espécies distintas, dependendo do tipo de sinalizador utilizado. O AI-2 é responsável pela sinalização interespecífica. Existe também a comunicação mediada pelo Autoindutor 3 (AI-3) utilizada no mecanismo de comunicação de Escherichia coli entero-hemorragica e Salmonella enterica sorotipo Typhimurium. A interferência no sistema quorum sensing pode impedir as células de expressassem fenótipos como fatores de virulência, entre outros regulados por esse sistema. O controle da ativação dessas características é de grande interesse para saúde pública e indústria de alimentos, considerando o aumento da resistência bacteriana a antibióticos e o uso excessivo de conservantes de alimentos. Os inibidores do quorum sensing podem ter sua ação na produção de moléculas sinalizadoras, na sua inativação ou interferência na ligação de seus respectivos receptores. Alguns estudos têm mostrado que os inibidores do sistema quorum sensing podem ser sintéticos ou naturais. 17

(18) Existem várias espécies de plantas com comprovadas propriedades terapêuticas, incluindo atividade antimicrobiana. Os fitoquímicos presentes nas plantas também podem apresentar atividade anti-quorum sensing, conforme mostram alguns trabalhos. Os inibidores naturais do sistema quorum sensing podem ser uma alternativa para o uso de antibióticos no tratamento de infecções e aos conservantes sintéticos em alimentos. É conhecida uma vasta gama de plantas brasileiras que apresentam atividade antimicrobiana, porém, pouco se sabe sobre a inibição do sistema de comunicação quorum sensing por essas plantas, reforçando a necessidade de pesquisas nessa área. Grumixama (Eugenia brasiliensis) e pitanga (Eugenia uniflora L.) são frutos da grumixameira e pitangueira, árvores nativas do Brasil. A atividade antimicrobiana de folhas de grumixameira e da pitangueira, assim como de frutos da pitangueira já foi demonstrada em alguns estudos. Embora trabalhos envolvendo atividade antimicrobiana dos frutos de pitanga (Eugenia uniflora L.) tenham sido demonstrados, conhecer a atividade antimicrobiana especialmente sobre a inibição do sistema quorum sensing desses frutos poderia gerar alternativas ao controle microbiano pelo uso de agentes naturais de frutos nativos brasileiros e aumentar o conhecimento científico relacionado ao assunto. 2 – REVISÃO DE LITERATURA 2.1 - Quorum sensing 2.1.1 - Mecanismo de comunicação As bactérias podem apresentar um comportamento cooperativo, tendo suas atividades realizadas de forma mais eficiente quando em uma população suficientemente grande. Esses micro-organismos monitoram sua densidade populacional pela detecção de moléculas sinalizadoras e regulam a expressão gênica em função da densidade celular em um mecanismo denominado quorum sensing (FUQUA, WINANS e GREENBERG, 1994; FUQUA e GREENBERG, 1996; FUQUA e GREENBERG, 2003; TAGA e BASSLER, 2003; PLATT e FUQUA, 2010). O sistema quorum sensing foi primeiramente descrito por Nealson e Hastings (1979) para a bactéria Vibrio fischeri, uma bactéria marinha que pode viver de forma simbiótica colonizando órgãos luminosos de peixes e lulas e em vida livre na água do mar. Em alta 18

(19) densidade celular, Vibrio fischeri produz luz pela ativação do sistema quorum sensing que regula positivamente os genes responsáveis pela bioluminescência (BOSGELMEZ-TINAZ, 2002; FUQUA e GREENBERG, 2003; MARCH e BENTLEY, 2004). Em baixas densidades populacionais, o sinal produzido por V. fischeri não se acumula e a bioluminescência não é induzida (BOSGELMEZ-TINAZ, 2002; FUQUA e GREENBERG, 2003). A coordenação da expressão gênica mediada pela comunicação quorum sensing ocorre através da produção, liberação e detecção de moléculas sinalizadoras (RUMJANEK, FONSECA, e XAVIER, 2004; GONZALEZ e KESHAVA, 2006). Os sinalizadores, também denominados autoindutores, são moléculas produzidas por bactérias, compostos difusíveis de baixo peso molecular, empregados na regulação quorum sensing (TAGA e BASSLER, 2003; PLATT e FUQUA, 2010). Eles podem ser classificados em três grupos principais: O autoindutor-1 (AI-1) que engloba as moléculas de acil homoserina lactona (AHL) usadas por bactérias Gram-negativas, os peptídeos autoindutores (AIP) que são usados por bactérias Gram-positivas e o autoindutor-2 (AI-2) que engloba as moléculas usadas por ambos os grupos bacterianos (RUMJANEK, FONSECA, e XAVIER, 2004; NAZZARO, FRATIANNI, e COPPOLA, 2013). Além destas moléculas, diversas outras já foram descritas na literatura com função de sinalização no sistema quorum sensing (TSAI e WINANS, 2010), como o AI3 utilizado por S. enterica sorotipo Typhimurium e E. coli entero-hemorrágica (MOREIRA, WEINSHENKER e SPERANDIO, 2010). O mecanismo de comunicação quorum sensing por bactérias Gram-negativas se faz principalmente por meio de moléculas autoindutoras conhecidas como AHL ou AI-1 (RUMJANEK, FONSECA, e XAVIER, 2004; WATERS e BASSLER, 2005; NAZZARO, FRATIANNI, e COPPOLA, 2013). As AHLs contêm em sua estrutura um anel lactona com uma cadeia acila lateral variável (Figura 1). Com base no comprimento da cadeia acila, as AHLs podem ser classificadas como moléculas de cadeia curta ou longa (GONZALEZ e KESHAVA, 2006). 19

(20) Figura 1- Estrutura química da AHL, que consiste em um anel homoserina-lactona, ―n‖ representa as cadeias laterais com variação acila, podendo ir de dois a dezoito carbonos. ―R‖ indica moléculas de H, OH ou O. Fonte: Pinto (2005). O mecanismo de comunicação envolve primariamente as proteínas LuxI e LuxR e suas homólogas. A proteína LuxI ou suas homólogas sintetiza as AHLs, catalisando uma ligação amida entre o S –adenosilmetionina (SAM) e o grupamento acila (GONZALEZ e KESHAVA, 2006). A proteína LuxR ou suas homólogas funciona como receptores citoplasmáticos de AHLs (WATERS e BASSLER, 2005), e normalmente são ativadores transcricionais. LuxR apresenta dois domínios: um conjunto de resíduos conservados no domínio amino-terminal compreende a região de ligação a AHL, além de mediar dimerização, e um domínio carboxi-terminal responsável pela ligação a sítios específicos no DNA alvo. A interação da AHL com o domínio amino-terminal provoca mudanças conformacionais que modula a expressão gênica (ZHU e WINANS, 1999; FUQUA e GREENBERG, 2003; WATERS e BASSLER, 2005; GONZALEZ e KESHAVA, 2006; PINTO e WINANS, 2009). As moléculas de AHL sintetizadas pela LuxI se difundem livremente pela membrana citoplasmática aumentando sua concentração, de acordo com o aumento da densidade celular. Ao atingir uma concentração limiar crítica, essas moléculas são capazes de voltar ao citoplasma da célula e se ligarem ao receptor LuxR. O complexo LuxR-AHL ativa ou mais esporadicamente reprime a transcrição de genes e em alguns casos ativa a expressão do próprio gene luxI por um sistema de feedback positivo (RUMJANEK, FONSECA e XAVIER, 2004; WATERS e BASSLER, 2005). Cada proteína LuxI produz o sinal de alta especificidade para o seu receptor LuxR e essas proteínas receptoras também possuem sítio de ligação específico, permitindo que LuxR seja ativado somente por seu ligante cognato. Dessa forma, cada espécie pode responder primariamente ao acúmulo de seu próprio sinal, em um ambiente que contenha várias espécies (WATERS e BASSLER, 2005). Alguns mecanismos podem evitar a ativação prematura do sistema quorum sensing e a ligação de AHL a proteína receptora LuxR. Um dos mecanismos está relacionado a estabilidade da proteína LuxR que é dependente da presença do autoindutor, onde na ausência desse, a proteína receptora tem meia-vida de poucos minutos, enquanto que essa meia-vida 20

(21) aumenta para mais de 200 minutos na presença de AHL (ZHU e WINANS, 1999; PINTO e WINANS, 2009). O segundo mecanismo é a difusão de AHL para o meio extracelular. Somente quando uma concentração significativa de sinal se acumula, indicando elevada densidade celular, a concentração intracelular é capaz de ativar o circuito quorum sensing (WATERS e BASSLER, 2005). As bactérias Gram-negativas também podem se comunicar utilizando diversas outras moléculas sinalizadoras como, por exemplo, as dicetopiperazinas (DKPS), fator de sinal difusível (DFS); 2-heptil-3-hidroxi-4-quinolona (PQS), AI-3, entre outros (TSAI e WINANS 2010). As bactérias Gram-positivas utilizam oligopeptídeos modificados como autoindutores, conhecidos como AIP (autoinducer peptides), no processo de comunicação célula-célula. Esses autoindutores são ativamente exportados para fora da célula, por meio de transportadores do tipo ABC. Quando sua concentração aumenta a um limiar, estes oligopeptídeos se ligam a um sensor de membrana denominado histidina quinase, pertencente a um sistema de sinalização de dois componentes. Essa ligação provoca uma cascata de fosforilação onde um ativador transcricional atua diretamente no DNA, influenciando a transcrição de genes específicos (FUQUA, STEPHEN e GREENBERG, 1994; TAGA e BASSLER, 2003; WATERS e BASSLER, 2005; NAZZARO, FRATIANNI, e COPPOLA, 2013; YARWOOD et al., 2004; BALABAN et al., 2007; RUMJANEK, FONSECA e XAVIER, 2004). Moléculas denominadas AI-2, também conhecidas como furanosil borato diéster, são sinalizadores utilizados por bactérias Gram-positivas e Gram-negativas para comunicação intra e interespécies. A combinação da utilização destes sinalizadores permite a bactéria fazer censo de sua densidade populacional e de outras espécies presentes na vizinhança (NAZZARO, FRATIANNI e COPPOLA, 2013). Outro sinalizador utilizado na comunicação quorum sensing é o AI-3, de estrutura ainda desconhecida, utilizado no mecanismo de comunicação de E. coli O157:H7 e S. enterica sorotipo Typhimurium. Esse sinalizador está envolvido na comunicação cruzada entre essas bactérias e o hormônio epinefrina e norepinefrina demostrando semelhança a esses devido ao seu reconhecimento pelo receptor QseC (SPERANDIO et al., 2003; MOREIRA, WEINSHENKER e SPERANDIO, 2010). 21

(22) 2.1.2 – Principais fenótipos regulados pelo sistema quorum sensing Em função do sistema quorum sensing, as bactérias são capazes de coordenar diversas funções coletivas como a migração para ambientes favoráveis, busca de nutrientes e a proteção pela formação de biofilmes (SKANDAMIS e NYCHAS, 2012). Esse sistema também está envolvido nos processos de virulência, competência, esporulação, conjugação, produção de bacteriocinas, síntese de antibióticos, enzimas, bioluminescência, produção de pigmentos, entre outros (MARCH e BENTLEY, 2004; SKANDAMIS e NYCHAS, 2012; NAZZARO, FRATIANNI, e COPPOLA, 2013). Além desses fatores, as bactérias podem controlar pelo sistema quorum sensing, a manipulação da resposta imune do hospedeiro durante a fase da infecção, tendo esse sistema papel importante na proteção contra a ação antimicrobiana do sistema imune humano (BJARNSHOLT et al., 2005). O biofilme bacteriano é um dos fenótipos importantes regulados pelo mecanismo quorum sensing e é caracterizado como sendo um crescimento agregado de micro-organismos sobre uma superfície. O biofilme é um mecanismo que as bactérias desenvolveram para aderir a superfícies formando comunidades, como estratégia de sobrevivência em ambientes adversos como a mudanças de temperatura, dessecação, raios ultravioletas e no estabelecimento de infecções. Suas células mais expostas podem formar uma barreira física que impede ou diminui o contato dos agentes antimicrobianos com suas células mais profundas. Dessa forma, são altamente tolerantes a antibióticos, podendo levar a seleção de estirpes resistentes (HOIBY et al., 2010; SREY, JAHID e HÁ, 2013). No biofilme, podem estar presente uma ou várias espécies, gêneros e estirpes microbianas podendo ser formado em superfície biótica e abiótica (O’TOOLE, KAPLAN e KOLTER, 2000). Sua formação é um processo dinâmico envolvendo cinco etapas, incluindo fixação reversível, fixação irreversível, formação de microcolônias, maturação e dispersão (SREY, JAHID e HÁ, 2013; GU e REN, 2014). Na primeira fase, fixação reversível, as bactérias livres são apresentadas a uma superfície sólida por fluídos ou pela motilidade bacteriana. Estruturas extracelulares, como flagelos, curli, fímbrias ou pili e proteínas de membrana ajudam as bactérias a interagirem com as superfícies (FERREIRA, PEREIRA e MELO, 2010). Este processo é influenciado pelas propriedades das células bacterianas e a superfície, como a carga, hidrofobicidade e rigidez 22

(23) (PALMER, FLIN e BROOKS, 2007) e as células bacterianas ainda podem ser removidas pela força de cisalhamento (STOODLEY et al., 2002). Na fase de fixação irreversível, as células aderidas iniciam a produção de substâncias poliméricas extracelulars (EPS) que consistem em polissacáridos, DNA, proteínas e lipídeos, promovendo a transição de fixação bacteriana reversível para irreversível (RENNER e WEIBEL, 2011). As células se multiplicando, acumulam EPS e crescem em estruturas tridimensionais (3D) formando biofilmes maduros. Em um biofilme maduro, o EPS adere às células bacterianas para apoiarem a estrutura 3D, permitindo o transporte de nutrientes e remoção de resíduos. A maturação é uma etapa em que o biofilme se desenvolve em uma estrutura organizada podendo ser plana ou em forma de cogumelo. Células de alguns biofilmes maduros podem ser liberadas na fase de dispersão aderindo a uma nova superfície e formando um novo biofilme (GU e REN, 2014; SOLANO, ECHEVERZ e LASA, 2014). O quorum sensing está envolvido na regulação das fases de crescimento do biofilme, principalmente na fase de maturação, regulando a densidade populacional (SKANDAMIS e NYCHAS, 2012), a produção de EPS, a motilidade e a produção de metabólitos secundários (GU e REN, 2014). Várias espécies bacterianas também podem crescer sobre superfícies em meio semi-sólido, utilizando o mecanismo de motilidade celular (LINDUM et al., 1998; (KEARNS, 2010). Trata-se de uma forma de adaptação bacteriana às mudanças adversas nutricionais e físicas garantindo vantagem de sobrevivência sob uma variedade de ambientes, possibilitando migração para locais favoráveis a sua colonização (AN et al., 2006). Esse mecanismo é considerado um importante fator de virulência (KIM et al., 2003; LAI, TREMBLAY e DÉZIEL, 2009), sendo essencial para a patogenicidade bacteriana nas fases iniciais de adesão aos tecidos do hospedeiro (MCCARTER, 2001). Henrichsen (1972) descreveu os vários tipos de motilidade bacteriana, entre eles, as do tipo swarming e swimming. A motilidade tipo swarming foi definida como sendo a translocação em superfície pela ação de flagelos, apresentando padrão micromorfológico organizado em giros e bandas, caracterizando-se como um rápido movimento bacteriano organizado, contínuo e regular ao longo do eixo das células agregadas em feixes. Já a motilidade do tipo swimming ocorre por meio da translocação de flagelos rotativos, porém com padrão 23

(24) micromorfológico desorganizado onde as células se movem individualmente e de forma aleatória em meio líquido (HENRICHSEN, 1972; KEARNS, 2010). Muitas bactérias que apresentam motilidade secretam surfactantes, moléculas anfipáticas que agem reduzindo a tensão superficial entre o substrato e a célula bacteriana para permitir o espalhamento sobre a superfície (KEARNS, 2010). A produção de surfactante por algumas bactéria é um mecanismo regulado pelo sistema quorum sensing (LINDUM et al., 1998; EBERL et al, 1996). Além da produção de surfactante, o quorum sensing regula o sistema flagelar, onde a expressão hierárquica de cerca de 50 genes (MACNAB, 2004; MCCARTER, 2006) e sua cascata de regulação é controlada por esse sistema, que regula a transdução de genes envolvidos nesta característica (LINDUM et al.,1998; MCCARTER, 2006; YANG e DEFOIRDT, 2014). A Tabela 1 apresenta os fenótipos regulados pelo quorum sensing e as moléculas sinalizadoras empregadas nesse processo. Tabela 1 – Exemplos de moléculas sinalizadoras e fenótipos regulados pelo sistema quorum sensing em bactérias. Bactéria Aeromonas hydrophila Sinalizador N-butanoil-Lhomoserina lactona Protease extracelular, formação de biofilme N-hexanoil-Lhomoserina lactona Chromobacteri um violaceum N-hexanoil-Lhomoserina lactona E. coli AI-2, AI-3 Erwinia carotovora Fenótipo Antibiótico, exoenzimas, cianeto, violaceína Divisão celular Antibiótico, fatores de virulência: proteases, celulases, pectinases, síntese de exopolissacarídeo, N-3(oxohexanoil)-Lhomoserina lactona 24 Referências Bosgelmeztinaz (2002) Rumjanek, Fonseca e Xavier (2004), 2004; Bosgelmeztinaz (2002) Gonzalez e Keshava (2006); Bosgelmeztinaz (2002) Bosgelmeztinaz (2002)

(25) carbapenem Ciclo(L-PheL-Pro), Pseudomonas fluorescens* Ciclo(L-TyrL-Pro) Antibiótico fenazina Gonzalez e Keshava (2006) DKPS C4-HLS; 3-oxo-C12HLS; Pseudomonas aeruginosa Fatores de virulência, exoenzimas, cianeto, RpoS, lecitina, piocianina, ramnolipídeo, pili, Xcp, formação de Biofilme, RhIR, N-butanoil-Lhomoserina lactona N-3(oxododecanoil)L-homoserina lactona Serratia liquefaciens Serratia marcescens spp. ATCC 39006 Yersinia Antibiótico carbapenem, pigmento (prodigiosina), protease N-butanoil-Lhomoserina lactona N-butanoil-Lhomoserina lactona N-hexanoil-Lhomoserina lactona N-hexanoylL- homoserina lactona N-3(oxohexanoil)-Lhomoserina lactona Rumjanek, Fonseca e Xavier (2004) Bosgelmeztinaz (2002) Bosgelmeztinaz (2002) Motilidade tipo Swarming Bosgelmeztinaz (2002) Motilidade, aglomeração Bosgelmeztinaz (2002) Virulência Rumjanek, Fonseca e 3-oxo-C6-Acil homoserina lactona S.aureus AIP 25

(26) Bacillus subtilis Competência para aquisição de DNA, esporulação AIP Xavier (2004) Rumjanek, Fonseca e Xavier (2004) * Algumas estirpes de P. fluorescens não produzem AI-1 (Pinto et al., 2010; Martins et al., 2014). 2.1.3 - Sistema quorum sensing e sua relação com a deterioração dos alimentos O sistema quorum sensing regula comportamentos bacterianos em ecossistemas alimentares e sua compreensão é importante podendo ser usada para criar novas alternativas para preservação de alimentos (PINTO et al., 2007). Esse sistema regula várias enzimas com atividade na deterioração de alimentos (SKANDAMIS e NYCHAS, 2012; BAI e RAI, 2012). Compostos de sinalização quorum sensing foram identificados em alimentos deteriorados como leites, carnes, frutas e legumes (BAI e RAI, 2012) e em carnes armazenadas a vácuo e aerobiamente (BLANA e NYCHAS, 2013). Também foram identificadas diferentes moléculas sinalizadoras de quorum sensing, como as AHLs produzidas por estirpes proteolíticas psicrotróficas isoladas de leite cru (PINTO et al., 2007). A Tabela 2 apresenta bactérias deterioradoras de alimentos, os principais alimentos acometidos por elas, os fenótipos de deterioração regulados pelo quorum sensing e os sinalizadores envolvidos. Tabela 2 - Quorum sensing em bactérias deterioradoras de alimentos. Bactéria Produto Fenótipo Pseudomonas fluorescens 395 Leite Deterioração proteolítica do leite S. marcescens proteamaculans strain B5a Leite Deterioração proteolítica e lipolítica do leite Leite Deterioração proteolítica do leite Pseudomonas fluorescens Pseudomonas phosphoreum e Aeromonas spp. Erwinia carotovora Pectobacterium Filetes de bacalhau Vegetais Brotos Atividade quitinolítica Deterioração celulolítica e proteolítica Deterioração 26 Molécula de Sinalização C4-HSL and 3OC8-HSL Referências Liu et al., (2007) 3-oxo-C6HSL Christensen et al., (2003) L-HSL αamino-γ butyrolactones Dunstall et al., (2005) 3-hydroxyC8-HSL Flodgaard et al., (2005) 3-oxo-C6HSL Jones et al., (1993) 3-oxo-C6- Rasch et al.,

(27) ssp. A2JM S. marcescens plymuthica RVH1 Hafnia alvei Serratia marcecens spp. Pseudomonas spp. Photobacteriu m phosphoreum e Aeromonas spp. de feijão Vegetais Embalag ens a vácuo Carne Filetes de bacalhau pectinolítica eproteolítica Atividade quitinase e protease Deterioração proteolítica HSL 3-oxo-C6HSL e C6-HSL 3oxohexanoyl HSL Formação de biofilme em carnes Deterioração quitinolítica (2005) Van Houdt et al., (2007) Bruhn et al., (2004) AHLs Jay et al., (2003) 3-hydroxyC8-HSL Flodgaard et al., (2005) Fonte: Bai e Rai (2012), modificado. 2.1.4 - Mecanismo de inibição do sistema quorum sensing A estratégia de controle de micro-organismos por meio da interferência no sistema quorum sensing é ampla (RUMJANEK, FONSECA e XAVIER, 2004) onde a capacidade de perturbar o sistema quorum sensing pode conferir a uma determinada espécie bacteriana, vantagens sobre outra (BASSLER, 2005). A interrupção de qualquer um dos passos da comunicação quorum sensing pode ter consequências prejudiciais na sobrevivência e patogenia microbiana (PAN e REN, 2009). Os mecanismos de inibição podem ser vários, como a inibição da síntese, transporte ou secreção de AHL e da proteína receptora de AHL (LuxR) (KALIA, 2012; NAZZARO, FRATIANNI, e COPPOLA, 2013). Os inibidores quorum sensing podem bloquear a expressão de virulência sem afetar o crescimento microbiano (PAN e REN, 2009; YEO e THAM, 2012; KALIA, 2012; BAI e RAI, 2012; NAZZARO, FRATIANNI, e COPPOLA, 2013) diminuindo o risco de desenvolvimento de resistência bacteriana (KALIA, 2012; NAZZARO, FRATIANNI e COPPOLA, 2013). Podem atuar causando enfraquecimento dos biofilmes para a exposição a antibióticos e o sistema imunológico (GIVSKOV, 2012). Sua administração juntamente com medicamentos pode impedir a formação de biofilmes resistentes sobre dispositivos médicos, aumentando a sensibilidade desses a tratamentos antimicrobianos melhorando a atividade dos antibióticos. Tem sido mostrado também que biofilmes tratados com inibidores quorum sensing ficam mais susceptíveis a ação do sistema imune (BJARNSHOLT et al., 2005). 27

(28) Para ser eficaz, um inibidor quorum sensing deve ser uma molécula pequena, com capacidade de redução na expressão de genes regulados por quorum sensing, além de não apresentar nenhum efeito adverso sobre as bactérias ou o hospedeiro e ser quimicamente estável e resistente à degradação pelos sistemas metabólicos dos hospedeiros (PAN e REN, 2009). 2.2 - Produtos naturais inibidores do quorum sensing A atividade anti-quorum sensing de produtos naturais é mais presente do que se imagina e sua inibição pode ser tão importante quanto ao efeito antibacteriano, podendo contribuir ao uso tradicional de medicamentos (ADONIZIO, KONG, MATHEE, 2009; SULTANBAWA, 2011). As substâncias inibidoras são ferramentas promissoras para a redução de doenças, pois a disposição de antibióticos eficazes pode não ser garantida (DEFOIRDT, BRACKMAN e COENYE, 2013). Além da atividade sobre a saúde humana, o uso de inibidores quorum sensing presentes em compostos naturais pode melhorar a segurança de alimentos proporcionando regulação negativa da atividade de deterioração, alterando a atividade e sobrevivência microbiana (NAZARRO et al., 2013). A combinação desses inibidores e outros agentes antimicrobianos pode gerar efeitos sinérgicos sobre a redução bacteriana (GIVSKOV, 2012), sendo uma estratégia eficaz para controle de infecções causadas por bactérias patogênicas em plantas, animais e seres humanos. Compostos presentes em produtos naturais apresentaram inibição do sistema quorum sensing por possuírem compostos com semelhança estrutural a moléculas sinalizadoras, pela capacidade de interferir com a atividade de AHL, modulando sua síntese, e pela interferência com a produção de AI-2 (NOVAK e FRATAMICO, 2004; CHOO, RUKAYADI e HWANG, 2006; VATTEM et al., 2007; YEO e THAM, 2012; GANIN et al., 2012; TRUCHADO et al., 2012; BLANA E NYCHAS, 2013; ALVAREZ, MOREIRA E PONCE, 2013; TAN E YIN, 2013; NAZZARO, FRATIANNI, e COPPOLA, 2013). Alguns estudos também mostraram que polifenóis são capazes de estimular a expressão da enzima AHL lactonase e interferirem na sinalização mediada por AHL, bloqueando a comunicação celular e inibindo os sinalizadores AI-1 e AI-2 e a formação de biofilme (NAZZARO, FRATIANNI e COPPOLA, 2013; KALIA, 2012). A Tabela 3 apresenta alguns compostos naturais com atividade antiquorum sensing. 28

(29) Tabela 3 - Compostos naturais com atividade anti-quorum sensing. Fonte Natural Antagonista Melicope lunu-ankenda (folhas) Syzygium aromaticum (broto) Alho (bulbos) Vanilla planifolia (feijões) Tremella fuciformis (inteira) Panax notoginseng (flores e raízes) Areca catechu (sementes) Prunus armeniaca (kernel de sementes) Prunella vulgaris (inteira) Nelumbo nucifera (folhas) Punica granatum (casca) Imperata cylindrical (haste) P. ginseng (raízes) Extrato de plantas Moringa oleifera (folhas e frutos) Capparis spinosa (fruits) Laurus nobilis (frutos, flores, folhas, cascas) Acacia nilotica (vagens verdes) Quercus virginiana (folhas) Bactérias Inibidas E. coli [pSB401] E. coli [pSB1075] C. violaceum CV026 P. aeruginosa PA01 P. aeruginosa lecA::lux P. aeruginosa C. violaceum CV026 C. violaceum CV026 C. violaceum CV026 P. aeruginosa PA01 C. violaceum ATCC 12472 C. violaceum CV026 P. aeruginosa E. coli Proteus mirabilis S. marcescens C. violaceum ATCC 12427 C. violaceum ATCC 12472 Chamaesyce hypericifolia (aereas) C. violaceum ATCC 12472 Tetrazygia bicolor (folhas) C. violaceum CV026 Conocarpus erectus (folhas) Agrobacterium tumefaciens Bucida burceras (folhas) Callistemon viminalis (folhas, inflorescencia) Vaccinium macrocarpon V. angustifolium Rubus idaeus 29 NTL4 C. violaceum CV026 C. violaceum 31532 P. aeruginosa PA01

(30) R. eubatus Fragaria sp. Vitis sp. Origanum vulgare Rosemarinus officinalis Ocimum basilicum Thymus sp. Brassica oleracea Curcuma longa Zingiber officinale Lonicera alpigena Castanea sativa Juglans regia Ballota nigra R.officinalis Leopoldia comosa Malva sylvestris Cyclamen hederifolium Rosa canina R. ulmifolius Ananas comosus Musa paradiciaca Manilkara zapota Ocimum sanctum Scutellaria baicalensis Scorzonera sandrasica Óleos essenciais Metabólitos Bioativos E. coli O157:H7 S. aureus C. violaceum ATCC 12472 C. violaceum CV026 P. aeruginosa PA01 C. violaceum CV026 C. violaceum ATCC 12472 C. violaceum CV026 Laranja Yersinia enterocolitica Árvore do chá Alecrim C. violaceum CV026 Lippia alba Ocotea sp. Elettaria cardamomum Swinglea glutinosa Myntotachys mollis Zingiber officinale Piper bredemeyeri (folhas) P. brachypodom (folhas) P. bogotence (inteiro) Phellinus igniarius Exudatos de pea (Pisum sativum) Sulforafano Erucin Malabaricone C Catechin 30 P. putida [pRK-C12) E. coli [pJBA132] C. violaceum CV026 C. violaceum CV026 S. marcecens liquefaciens MG44 S. faciens MG44 P. aeruginosa P. aeruginosa PA01 C. violaceum CV026

(31) Fonte: KOH et al., 2013. 2.3 - Compostos fenólicos 2.3.1 - Definição, formação e função Compostos fenólicos são fitoquímicos presentes em vegetais que apresentam atividade biológica (TIVERON et al., 2012). São metabólitos secundários encontrados em plantas, úteis na ação defensiva contra patógenos, radiação e envolvidos na função antioxidante (COWAN, 1999; MANACH et al., 2004; TIVERON et al., 2012), estando presentes em folhas, tecidos floridos, caules e casca de plantas (KAHKONEN et al., 1999). Os compostos fenólicos foram identificados em plantas superiores e comestíveis e podem estar envolvidos na resposta das plantas ao estresse contribuindo para a cura por lignificação de áreas danificadas. Possuem propriedades antimicrobianas e suas concentrações podem aumentar após a infecção da planta (KAHKONEN et al., 1999; COWAN, 1999). Uma molécula fenólica pode ser característica de uma planta ou mesmo de uma espécie, órgão ou tecido da planta a qual pertence (SCALBERT e WILLIAMSON, 2000). Os compostos fenólicos são agentes redutores que atuam para proteger os tecidos do corpo contra estresse oxidativo. Têm sua atividade atribuída às propriedades redox, doadores de hidrogênio e supressores de oxigênio, além de apresentarem potencial de quelação de metais (KAHKONEN et al., 1999; SCALBERT e WILLIAMSON, 2000). Além da atividade antioxidante e antimicrobiana, os compostos fenólicos podem apresentar atividade anticarcinogênica e antiproliferativa (KAHKONEN et al., 1999), contudo apresentam ações biológicas específicas que ainda não foram bem compreendidas (MANACH et al., 2004). Os mecanismos responsáveis pela inibição microbiana dos compostos fenólicos incluem a inibição da atividade enzimática, na alteração da solubilidade lipídica da membrana celular ou por meio de interações com proteínas não específicas de micro-organismos (KAHKONEN et al., 1999; MANACH et al., 2004). As principais fontes de compostos fenólicos são frutas, chás e vinho tinto. As frutas contêm uma grande variedade de flavonóides e ácidos fenólicos que apresentam atividade antioxidante (KAHKONEN et al., 1999). Em vários produtos vegetais, a composição de fenólicos é pouco conhecida ou limitada a algumas variedades ou não está localizada as partes comestíveis desses vegetais. Alguns alimentos, principalmente frutas exóticas e alguns 31

(32) cereais, ainda não foram analisados quanto ao perfil e teor de compostos fenólicos (COWAN, 1999). Fatores como sazonalidade, disponibilidade de água, radiação UV, nutrientes do solo, poluição, ataque de patógenos, maturação no momento da colheita, processamento industrial, armazenamento e exposição à luz podem alterar a concentração de polifenóis em plantas (TIVERON, 2012). Métodos de preparação culinária também podem afetar os teores de compostos fenólicos dos alimentos que podem ser eliminados com a retirada da casca dos frutos e vegetais, pois estas substâncias estão em concentrações mais elevadas nas partes exteriores dos frutos do que na parte interna (MANACH et al., 2004). Os compostos fenólicos podem ser classificados em diferentes grupos, em função do número de anéis de fenol e do tipo de elementos que ligam esses anéis uns aos outros. Podem também estar associados a hidratos de carbono e ácidos orgânicos (KAHKONEN et al., 1999). Sua estrutura química afeta propriedades como disponibilidade, atividade antioxidante, interações específicas com receptores celulares, enzimas e outras (SCALBERT e WILLIAMSON, 2000). As principais classes de compostos fenólicos são: ácidos fenólicos, flavonóides, estilbenos e lignanas (MANACH et al., 2004; SCALBERT e WILLIAMSON, 2000). Os ácidos fenólicos são divididos em dois grupos derivados do ácido benzóico e do ácido cinâmico. A concentração de ácido hidroxibenzóico em plantas comestíveis é baixa e este pode ser encontrado em frutos vermelhos, rabanete preto e cebola (MANACH et al., 2004). Ácidos hidroxicinâmicos são mais comuns que ácidos hidroxibenzóicos e consistem principalmente de ácido p-cumárico, caféico, ferúlico e sinápico. O ácido caféico se combina para formar o ácido clorogênico, encontrado em muitos tipos de frutas e em concentrações elevadas no café. As frutas com o maior teor de ácido clorogênico são amoras, kiwis, ameixas, cerejas e maçãs. O ácido caféico é o ácido fenólico mais abundante nas frutas representando 75% a 100% do ácido hidroxicinâmico (MANACH et al., 2004, KAHKONEN et al., 1999; COWAN, 1999). Ácidos hidroxicinâmicos são encontrados em todas as partes do fruto, porém as concentrações mais elevadas estão na parte exterior do fruto. Suas quantidades diminuem com o amadurecimento e aumentam com o tamanho do fruto (MANACH et al., 2004). 32

(33) Os flavonóides são compostos fenólicos hidroxilados nas unidades C6- C3 ligado a um anel aromático. São os compostos fenólicos com maior frequência em alimentos e são representados pelos grupos das flavonas, flavononas, catequinas e antocianinas (VOLP et al., 2008). Suas fontes mais ricas são cebola, couve encaracolada, alho poró, brócolis e mirtilos e também se encontram presentes em vinhos tintos e chás. As concentrações de flavonóides são maiores na parte externa das plantas e frutos que mais recebem luz solar (COWAN, 1999). Os componentes principais do grupo das flavonas são apigenina, chrisina, kaempferol, luteolina, miricetina, rutina, sibelina e a quercetina e suas fontes alimentares são cascas de maçãs, cerejas, brócolis, peles de frutas, frutas como cranberries, uvas, alfaces, oliva e alho. As flavonas têm como componentes fisetina, hesperetina, narigina, naringenina e taxifolina e suas fontes principais são frutas cítricas e peles de frutas cítricas. Os componentes das catequinas são catequinas, epicatequina e epigalocatequinagalato e a fonte alimentar são os vinhos e chás. As antocianinas, pertencentes ao grupo dos flavonóides, são o grupo de pigmentos naturais tendo como principais componentes a cianidina, delfinidina, malvidina, pelargonidina, peonidina e petunidina e suas fontes alimentares são cerejas, uvas, franboesas, morangos, chá e peles de frutas com pigmentos escuros. Lignanas são formadas por duas unidades de fenilpropanos, sendo a linhaça sua fonte mais rica. São metabolizados em enterodiol e enterolactona pela microbiota intestinal. A classe dos estilbenos, encontrados em baixas concentrações em dietas humanas, é representada pelo resveratrol presentes em vinhos, apresentando um efeito anticancerígeno (MANACH et al., 2004). 2.4 - Grumixama (Eugenia brasiliensis) Grumixama (Eugenia brasiliensis) é uma fruta da família das Mirtáceas, ainda pouco conhecida. No Brasil, a grumixameira ocorre nas regiões da mata litorânea do sul da Bahia até Santa Catarina. Floresce no final do mês de setembro até novembro, com amadurecimento dos frutos em novembro e dezembro (THITILERTDECHA, TEERAWUTGULRAG e RAKARIYATHAM, 2008). Foram identificadas três variedades de grumixameira, de acordo com as cores de seus frutos: roxa, mais comum; vermelhas e brancas ou amarelas (MORENO et al., 2007). Seus frutos são saborosos, com bom potencial para consumo in natura quanto para a industrialização (KOHAMA et al., 2006). A grumixama é também conhecida como cereja 33

(34) brasileira e pode apresentar atividade antidiarréica, antipirético, antirreumática e seus óleos essenciais revelaram potencial antibacteriano (MAGINA, 2007) e anti-inflamatório (DONATO e MORRETES, 2007). As Figuras 2 e 3 apresentam grumixamas e sua árvore frutífera. Figura 2 – A) e B) Grumixama vermelha e amarela. C) Grumixama vermelha. D) Grumixama amarela. E) Sementes de grumixama. Fonte: próprio autor. Figura 3 – A) Grumixameira. B) Grumixameira vermelha florida. C) Grumixameira amarela florida. Fonte: próprio autor. As variedades de cores de frutas têm uma distinta regulação bioquímica. A via fenólica parece ser diferente nas duas variedades, onde na variedade roxa está presente uma via bioquímica que leva ao acúmulo de antocianidinas, notado pela cor roxo escuro do fruto, e no fruto amarelo, esses metabolitos não estão aparentemente presentes (MORENO et al., 2007). Um estudo feito por Reynertson em 2007 analisou os componentes fitoquímicos e bioativos de 14 frutas da família das Mirtáceas. Foram quantificados os compostos fenólicos 34

(35) totais (24,80 ± 1,06 mg equivalentes de ácido gálico/g de peso seco) na grumixama, assim como compostos antociânicos totais (8,37 ± 0,23 mg equivalentes de cianidina 3-glicosídeo/g de peso seco). Também foram identificados seus compostos fenólicos mais importante sendo eles as antocianinas cianidina 3-glicosídeo (10,24 ± 0,42 mg/g da matéria seca) e delfinidina 3-glicosídeo (2,58 ± 0,13 mg/g da matéria seca), além de pequenas concentrações de ácido elágico, miricetina, quercetina e rutina. Em outro estudo Abe, Lajolo e Genovese (2011) identificaram frutos da família das Myrtaceas contendo ácido elágico, onde os maiores teores foram encontrados em grumixama, jabuticaba e cambuci. Na fruta de grumixama foram identificados derivados de quercetina na quantidade de 0,20g kg-1 da amostra, elevado teor de antocianinas 1,69 g kg -1 da amostra e flavonóides 1,91g kg -1 da amostra. Poucos estudos sobre os efeitos biológicos e antimicrobianos da polpa de grumixama foram reportados na literatura até o momento. Alguns estudos, porém, com plantas ricas em antocianinas comumente encontradas na grumixama, identificaram capacidade antimicrobiana dos extratos antociânicos contra Salmonella enteritidis, Staphylococcus aureus e Candida albicans. 2.5 - Pitanga (Eugenia uniflora L.) A pitanga (Eugenia uniflora L.), também pertencente à família das Mirtáceas, é nativa da Mata Atlântica. Pode ser usada na alimentação in natura, para fazer sucos e doces, e também na medicina popular, pelo uso de chás de suas folhas. As pitangueiras frutificam de outubro a janeiro, e podem ser encontradas variações em sua coloração, desde o laranja, vermelhas e roxas (PIO et al., 2005). As Figuras 4 e 5 apresentam pitangas em seus estágios de maturação e sua árvore frutífera, pitangueira. Figura 4 – A) Pitangas em diferentes estágios de maturação. B) e C) Sementes de pitanga. Fonte: Lira Junior et al. (2007). 35

(36) Figura 5 – A) Pitangueira. B) Florescência da pitangueira e pitangueira com frutos. Fonte: Lira Junior et al. (2007). A pitanga é uma fonte rica em compostos fenólicos, tendo a fruta roxa maior capacidade antioxidante quando comparada às frutas de outras cores, principalmente devido à maior presença de antocianinas (BAGETTI et al., 2011). Os compostos fenólicos presentes na pitanga foram identificados por Karwowski (2012), sendo eles o ácido gálico, ácido clorogênico, ácido caféico, ácido ferúlico e ácido p-cumárico, além de flavonóides totais como rutina, miricetina e quercetina. Vendruscolo (2005) identificou espécies de plantas utilizadas na medicina tradicional popular, entre elas E. uniflora L. (Myrtaceae). Foi verificado que as folhas são ricas em taninos, glicosídeos de flavonóides e óleo volátil. Entre várias funções foi descrito atividade antimicrobiana do óleo volátil. Estudos sobre potencial antimicrobiano da pitanga, encontrados na literatura, avaliaram os extratos de frutos e partes não comestíveis, como folhas e hastes. Holetz et al. (2002) testaram treze extratos hidroalcoólicos de plantas, incluindo o extrato de folhas de pitanga, encontrando atividade antimicrobiana moderada contra S. aureus e E. coli no extrato de pitanga. Outro estudo verificou atividade inibitória dos frutos de E. uniflora L. sobre E. coli, Streptococcus pyogenes, Providencia spp, Proteus mirabilis, Shigella sonnei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus spp. coagulase - (GONÇALVES, ALVES FILHO, MENEZES, 2005). Também foram encontrados efeitos do extrato hidroalcoólico de folhas de E. uniflora L. contra S. aureus, Salmonella Choleraesuis, Pseudomonas aeruginosa e Candida albicans, 36

(37) sugerindo que os componentes do extrato responsáveis pela atividade antimicrobiana poderiam ter sido os compostos fenólico, particularmente os taninos (AURICCHIO et al., 2007). Os estudos apresentados acima fornecem um indicativo do potencial antimicrobiano dos frutos e folhas da pitanga (Eugenia uniflora L.). Reconhecer a atividade anti-quorum sensing desses frutos poderia trazer uma alternativa para seu uso como agente antimicrobiano natural. 3 – OBJETIVOS 3.1 - Objetivos Detectar a atividade de inibição do quorum sensing bacteriano pelos extratos bruto e fenólico das frutas tropicais brasileiras grumixama e pitanga. 4 – MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 - Material vegetal As frutas grumixama e pitanga foram colhidas na região de Ouro Preto – MG na época de suas respectivas frutificações. Grumixama e pitanga foram colhidas entre setembro a novembro de 2013 e outubro de 2013 a janeiro de 2014, respectivamente. As espécies foram coletadas, herborizadas e depositadas no Herbário Professor José Badini, da Universidade Federal de Ouro Preto, com a seguinte identificação: (OUPR). Eugenia brasiliensis Lam., M.C.T.B.Messias & F.G. Zola, 2481 e Eugenia uniflora L.M.C.T.B.Messias & F.G. Zola, 2482. 4.1.2. Preparo do material vegetal As frutas foram colhidas e armazenadas a -20°C até atingirem a quantidade suficiente para extração da polpa. As frutas foram posteriormente lavadas em água corrente, folhas e talos foram removidos e foram sanitizadas com solução de hipoclorito de sódio a 50mg/L por 15 minutos. Após sanitização, as sementes foram removidas manualmente e a polpa separada e homogeneizada em multiprocessador doméstico e congelada a -20°C. 37

(38) 4.2 - Extração e purificação de compostos fenólicos Os compostos fenólicos foram extraídos com solvente e purificados utilizando extração em fase sólida (SPE), conforme Bertoldi (2009) com adaptações. As polpas das frutas foram descongeladas e misturadas com solução de etanol: metanol: acetona 1:1:1 (v/v/v), seguida de filtração em papel Whatman n° 1. Posteriormente, os solventes foram evaporados em rotavapor a 40°C (Büchi, Switzerland) e o extrato aquoso, chamado de extrato bruto foi eluído em minicoluna C18 Sep-Pak Vac 35cc 10g 20 cm3 (Waters Corporation, Milford, MA) para purificação dos compostos fenólicos. Os compostos fenólicos adsorvidos no cartucho foram eluídos com metanol (fração adsorvida) e a fração aquosa não adsorvida foi descartada. O metanol foi completamente evaporado em rota-vapor a 40° C e água destilada foi adicionada até volume conhecido para obter o extrato fenólico. 4.3 - Compostos fenólicos totais O teor de compostos fenólicos totais foi determinado pelo ensaio do reagente FolinCiocalteu (SHAHIDI e NACZK, 1996). Uma alíquota de 0,6 ml do extrato fenólico foi diluída em 3,0 ml de reagente Folin-Ciocalteu diluído em água destilada (1:10; v/v). Depois de 3 minutos de repouso na ausência de luz, foram adicionados 2,4 ml de solução saturada de Na2CO3 (7,5 %; m/v). A absorbância foi determinada a 760 nm por espectrofotometria de absorção (UV-1601 PC Shimadzu, Tokyo, Japão), após 2 horas de repouso em ausência de luz. O índice de compostos fenólicos totais (IPT) foi determinado utilizando-se a curva padrão de ácido gálico (0-200 mg/L) e os resultados foram expressos em mg de ácido gálico equivalente por litro de extrato (AGE/L). 4.4. - Estirpes bacterianas utilizadas As estirpes bacterianas utilizadas neste trabalho foram C. violaceum ATCC 6357, A. hydrophila IOC/FDA 110-36, S. marcescens (parte da coleção de culturas do Laboratório de Microbiologia de Alimentos da Universidade Federal de Ouro Preto) e E. coli ATCC 10536. C. violaceum ATCC 6357 foi cultivada a uma temperatura de 28 a 30 °C, A hydrophila IOC/FDA 110-36 e E. coli ATCC 10536 a 37 °C e S. marcescens a 30 °C. As estirpes foram cultivadas em caldo Luria-Bertani (LB) contendo peptona 1 %, extrato de levedura 0,5 %, NaCl 0,5 %, ao invés de 1.0 % (RAVN et al., 2001). 38

(39) 4.5 - Determinação in vitro da atividade anti-quorum sensing dos extratos brutos e fenólicos 4.5.1 - Teste qualitativo da inibição do quorum sensing em C. violaceum O teste foi realizado conforme Tan, Yin e Chan (2012), com modificações. As culturas de C. violaceum foram crescidas em caldo LB por, aproximadamente, 18 horas (overnight) a 30 °C e uma alíquota de 1 ml dessa cultura foi misturada a 20 ml de ágar LB fundido em placa de Petri estéril. O ágar foi deixado em repouso por 30 minutos e, posteriormente, poços equidistantes de 5 mm de diâmetro foram feitos em cada placa, com o auxílio de ponteiras estériladas. A cada poço, foram adicionados 20 µl dos extratos bruto e fenólico de grumixama e pitanga em diferentes concentrações. O teste foi realizado com cinco concentrações dos extratos das duas frutas. As placas foram incubadas a 30 °C por 24 horas. Água destilada esterilizalada e o antibiótico Canamicina (100 µg/ml - Sigma Aldrich) foram utilizada como controles. A atividade de inibição do sistema quorum sensing em C. violaceum foi verificada pela formação de um halo turvo, indicativo de crescimento bacteriano, porém sem pigmentação, em fundo roxo, ao redor do poço contendo extrato. 4.5.2- Teste da concentração inibitória mínima (MIC) O teste para determinação da Concentração Inibitória Mínima (MIC) foi realizado pelo método de diluição em ágar, segundo a metodologia sugerida por Wiegand, Hilpert e Hancock (2008) com modificações. O teste MIC é usado para determinar a susceptibilidade das bactérias a uma droga alvo ou avaliar a atividade de novos agentes antimicrobianos. O teste em ágar determina a concentração mais baixa do agente antimicrobiano, definida nas condições de teste, que causa inibição visível do crescimento bacteriano. Uma população de 104 UFC de cada micro-organismo foi inoculada em forma de microgotas de 5 microlitros (spot) em ágar Mueller-Hinton, adicionado de diferentes concentrações dos extratos bruto ou fenólico de cada fruta. As placas foram incubadas por 24 horas a temperatura ótima de crescimento de cada micro-organismo e a MIC foi determinada como sendo a concentração mínima em que não foi observado crescimento microbiano. A atividade anti-quorum sensing é evidenciada por uma inibição da comunicação, não havendo morte bacteriana. Dessa forma, testes feitos com os extratos de grumixama e pitanga 39

(40) utilizam valores sub-MIC determinados previamente, garantindo que os resultados não fossem devidos a morte microbiana. 4.5.3 - Quantificação da inibição da produção de violaceína por C. violaceum O teste foi feito segundo Tan, Yin e Chan (2012) com modificações. C. violaceum foi cultivada por 18 h a 30 °C e inoculada a uma densidade óptica de 0,1 a 600 nm (aproximadamente 108 UFC/ml) em tubos de ensaio contendo caldo LB e caldo LB suplementado com extratos de ambas as frutas nas concentrações testadas. Os tubos foram incubados por 24 horas a 28 °C em incubadora de agitação a 150 rotações por minuto (rpm). A quantificação de violaceína foi obtida utilizando 1 ml de cultura de cada tubo, centrifugada a 13.000 rpm durante 10 minutos para precipitar a violaceína insolúvel. Em seguida, o sobrenadante da cultura foi descartado e o pellet solubilizado em 1 ml de Dimetilsulfóxido (DMSO), que foi agitado vigorosamente em um agitador de tubos e centrifugado novamente a 13.000 rpm durante 10 minutos para remover as células. A absorbância foi medida em espectrofotômetro de luz vizível a 585 nm. O controle negativo foi feito com caldo LB sem adição dos extratos e o controle positivo para inibição do sistema quorum sensing foi feito com a adição de furanona ((Z-)-4-Bromo-5(bromomethylene-2(5h)-furanone) adquiridos da Sigma Aldrich a uma concentração de 39,4 µM. Após o período de incubação de 24 horas, foram realizados plaqueamentos e contagem de C. violaceum (UFC ml-1) em culturas contendo cada concentração dos extratos testados para comprovar que tais concentrações não influenciaram o crescimento microbiano. Os testes foram realizados em triplicata, e o controle negativo sem adição do extrato, foi considerado como 100% para produção de violaceína. O percentual de inibição da produção de violaceína foi calculado usando a seguinte fórmula: % de inibição de violaceína = (Densidade Ótica do Controle 585 nm – Densidade Ótica do teste 585 nm/ Densidade Ótica do Controle 585 nm)×100 4.5.4 - Efeito anti-quorum sensing na motilidade tipo swimming e swarming em A. hydrophila e S. marcescens Para o teste de avaliação da motilidade, ágar LB foi preparado contendo 0,3% de ágar-ágar para testar o movimento tipo swimming e 0,4% para testar a motilidade tipo swarming 40

(41) (HUBER et al., 2003). Alíquotas de extrato foram adicionadas ao ágar e vertidas em placas de Petri esteriladas. As placas foram deixadas em repouso por 30 minutos e alíquotas de 2 µL de cada micro-organismo, crescido overnight, foram inoculadas em forma de ponto (spot), no centro do ágar. As placas foram incubadas a temperatura ótima para cada micro-organismo por 24 horas. Os resultados de efeito dos extratos bruto e fenólico na motilidade tipo swimming e swarming foram observados por meio da comparação visual com controle. O controle negativo foi realizado com ágar, sem adição dos extratos. 4.5.5- Determinação in vitro da inibição da formação de biofilme em C. violaceum, S. marcescens, A. hydrophila e E. coli Para a avaliação do efeito dos extratos fenólicos sobre a formação de biofilmes, alíquotas de 20 μL (2% da cultura ajustada para DO 0,1 a 600nm) da suspensão de células em estudo, 7 -1 contendo cerca de 10 UFC/ml , foram inoculadas em 180 μL de meio LB em microplacas de poliestireno de 96 poços. Concentrações previamente determinadas dos extratos bruto e fenólico de ambas as frutas foram adicionados aos poços. A incubação foi feita a temperatura ótima de crescimento de cada micro-organismo por 72 horas. Após esse período, o meio de cultura foi removido, invertendo-se a microplaca sobre papel absorvente. As células aderidas às microplacas foram coradas por 30 minutos com 200 μL de cristal violeta a 0,1 % (p/v) em água. Em seguida, o corante foi descartado e os poços das microplacas foram lavados, por três vezes consecutivas, com 200 μL de água destilada. As placas foram secas em estufa a 40ºC, por 15 minutos. O cristal violeta retido pelas células aderidas foi dissolvido em 200 μL de etanol (95 %) e a absorbância medida a 630 nm em leitor de microplacas (CONWAY, 2012). Os testes foram feitos em triplicata. 4.6 - Análises estatísticas As análises foram feitos em triplicata, obtendo-se a média e desvio padrão. A significância dos dados foi avaliada pelo teste ANOVA, empregando-se o teste de Tukey, utilizado o software GraphPad Prism versão 5.00 para Windows (San Diego, Califórnia, USA). As diferenças foram consideradas significativas para p < 0,05. 41

(42) 5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 - Compostos fenólicos totais A quantidade de compostos fenólicos do extrato bruto se grumixama foi de 2520,5 mg AGE/L e do extrato fenólico foi obtidos de 2998,5 mg AGE/L. Em relação à pitanga, o conteúdo de compostos fenólicos totais do extrato bruto foi de 1472,3 mg AGE/L, enquanto que do extrato fenólico foi de 2315,2 mg AGE/L. Guedes (2012), Mercadante (2012), Infante (2013) e Abe, Lajolo e Genovese (2012) encontraram valores de compostos fenólicos totais da grumixama variando entre 10,40 a 26,69 mg AGE/g da matéria seca. Os trabalhos citados acima mostram a composição de compostos fenólicos expressos em mg AGE/g da matéria seca, já os resultados desse trabalho são expressos em mg AGE/L, dessa forma não sendo possível comparar os os resultados, mas de observar sua identificação na grumixama. Silva et al. (2014) identificaram na polpa de grumixama uma maior quantidade das antocianinas delfinidina 3-glicosídeo e cianidina 3glicosídeo. Também foram identificadas cianidina 3-galactosídeo e cianidina 3-acetilhexosídeo, quercetina glicuronídeo, quercetina galoil-hexosídeo, quercetina desoxi-hexosídeo, quercetina hexosídeo, quercetina pentosídeo, eriodictiol hexosídeo, quercetina desoxihexosilhexosídeo, quercetina, ácido sinápico dihexosídeo hidroxi benzoil, ácido gálico dihexosídeo sinapoil e ácido sinápico dihexosídeo benzoil. Infarte (2013) caracterizou os principais compostos fenólicos encontrados nos extratos vegetais de grumixama, sendo eles as catequina, epicatequina e ácido gálico e Guedes (2012) identificou flavonoides e antocianinas. Reynertson (2007) identificou as antocianinas cianidina 3-glicosídeo e delfinidina 3-glicosídeo, além de ácido elágico, miricetina, quercetina e rutina presentes na grumixama. Na pitanga, a concentração de compostos fenólicos totais foi quantificada por Bagetti et al. (2011), Jacques et al., (2009); Abe, Lajolo e Genovese (2012) que obtiveram resultados variando entre 95,0 e 201,8 mg AGE/100 g de polpa fresca. Os resultados obtidos no presente estudo quando expressos em mg AGE/100 g de polpa fresca de pitanga foram 126,1 mg AGE no extrato bruto e 104,6 mg AGE/100g de fruta no extrato fenólico e estes valores se encontram próximos aos encontrados por esses autores. O composto fenólico predominante determinado por Prado (2009) foi acido gálico, enquanto Karwowski (2012) identificou ácido 42

(43) gálico, ácido clorogênico, ácido caféico, ácido ferúlico, ácido p-cumárico, rutina, miricetina e quercetina na pitanga. A quantificação e determinação dos compostos fenólicos é importante na classificação da fruta quanto ao teor desses e na elucidação de quais os compostos que poderiam estar desempenhando as atividades. 5.2 - Teste qualitativo de inibição do quorum sensing em C. violaceum As Figuras 6, 7, 8 e 9 apresentam os resultados de inibição qualitativa do quorum sensing em C. violaceum pelos extratos bruto e fenólico de grumixama e pitanga, em diferentes concentrações. Ambos os extratos de grumixama e pitanga apresentaram atividade antiquorum-sensing contra C. violaceum. Esta atividade pode ser observada pela formação de uma zona clara e turva, em fundo roxo ao redor do poço, resultante da inibição da produção de violaceína. O teste qualitativo demostrou o potencial de ambos os extratos em interferirem com a comunicação quorum sensing nesta bactéria. Figura 6 - Ensaio qualitativo da inibição do quorum sensing em C. violaceum com extrato bruto de grumixama. A) Placa com todos os resultados. B-H) Resultados discriminados por pocinho. B) Canamicina (100 µg/ml) – Controle da inibição do crescimento, C) Controle negativo - Água destilada estéril, D) 2520,5 mg AGE/L, E) 504,10 mg AGE/L, F) 252,05 mg AGE/L, G) 168,03 mg AGE/L e H) 126,02 mg AGE/L de extrato bruto de grumixama. Figura 7 - Ensaio qualitativo da inibição do quorum sensing em C. violaceum com extrato fenólico de grumixama. A) Placa com todos os resultados. B-H) Resultados discriminados por pocinho. B) Canamicina (100 µg/ml) – Controle da inibição do crescimento, C) Controle 43

(44) negativo - Água destilada estéril, D) 2998,5 mg AGE/L, E) 599,70 mg AGE/L, F) 299,85 mg AGE/L, G) 199,9 mg AGE/L e H) 149,92 mg AGE/L de extrato fenólico de grumixama. Figura 8 - Ensaio qualitativo da inibição do quorum sensing em C. violaceum com extrato bruto de pitanga. A) Placa com todos os resultados. B-H) Resultados discriminados por pocinho. B) Canamicina (100 µg/ml) – Controle da inibição do crescimento, C) Controle negativo - Água destilada estéril, D) 1472,3 mg AGE/L, E) 294,46 mg AGE/L, F) 147,23 mg AGE/L, G) 98,15 mg AGE/L e H) 58,98 AGE/L de extrato bruto de pitanga. Figura 9 - Ensaio qualitativo da inibição do quorum sensing em C. violaceum com extrato fenólico de pitanga. A) Placa com todos os resultados. B-H) Resultados discriminados por pocinho. B) Canamicina (100 µg/ml) – Controle da Inibição do crescimento, C) Controle negativo - Água destilada estéril, D) 2315,2 mg AGE/L, E) 463,04 mg AGE/L, F) 231,15 mg AGE/L, G) 154,35 e H) 115,76 mg AGE/L de extrato fenólico de pitanga. Segundo Adonizio et al. (2009) a inibição do sistema quorum sensing pode ser evidenciada pela perda do pigmento roxo, sem alteração no crescimento em C. violaceum. Como pode ser observado nas Figuras 6-9, o antibiótico inibiu o crescimento microbiano, visualizada pela formação de um halo transparente ao redor do poço contendo o mesmo. No caso dos extratos, houve uma leve inibição do crescimento em algumas concentrações, porém halos visivelmente turvos, com expressiva redução do pigmento violaceína são vistos na maioria dos pocinhos, indicando inibição do sistema quorum sensing, especialmente para o extrato fenólico de pitanga. 44

(45) 5.3 - Concentração Inibitória Mínima (MIC) As concentrações inibitórias mínimas em C. violaceum ATCC 6357, A. hydrophila IOC/FDA 110-36, E. coli ATCC 10536 e S. marcescens estão apresentadas nas Tabelas 4 e 5, em valores de diluição do extrato e em concentração de compostos fenólicos totais expressos em mg AGE/L, presentes nos extratos de grumixama e pitanga. Os inibidores quorum sensing não causam a morte de micro-organismos, agem bloqueando a expressão de fenótipos, sem afetar o crescimento microbiano (PAN e REN, 2009; YEO e THAM, 2012; KALIA, 2012; BAI e RAI, 2012; NAZZARO, FRATIANNI e COPPOLA, 2013). Determinar a MIC dos extratos para as bactérias utilizadas nos testes garante que os resultados obtidos para os ensaios anti-quorum sensing sejam devidos à inibição da comunicação bacteriana e não causados pela morte microbiana. Tabela 4 - Concentração Inibitória Mínima expressa em quantidade de compostos fenólicos totais (mg AGE/L) obtidas dos extratos bruto e fenólico de grumixama. Extrato de grumixama mg AGE/L Bactérias Bruto A. hydrophila IOC/FDA110-36 C. violaceum ATCC6357 E. coli ATCC10536 S. marcescens Fenólico A. hydrophila IOC/FDA110-36 C. violaceum ATCC6357 E. coli ATCC10536 S. marcescens Equivalência ao extrato puro * 420,08 1:6 100,82 100,82 >100,82 1:20 1:20 <1:20 499,75 1:6 214,18 749,63 >149.93 1:14 1:4 <1:20 *Esse valor representa o quanto o extrato foi diluído comparado ao extrato puro. Tabela 5 - Concentração Inibitória Mínima expressa em quantidade de compostos fenólicos totais (mg AGE/L) obtidas dos extratos bruto e fenólico de pitanga. Extrato de pitanga Bactérias mg AGE/L Bruto A. hydrophila IOC/FDA110-36 C. violaceum ATCC6357 45 Equivalência ao extrato puro * 98,15 1:15 92,02 1:16

(46) Fenólico E. coli ATCC10536 S. marcescens 73,61 >73,61 1:20 <1:20 A. hydrophila IOC/FDA110-36 C. violaceum ATCC6357 E. coli ATCC10536 S. marcescens 115,76 1:20 115,76 165,37 >115,76 1:20 1:14 <1:20 *Esse valor representa o quanto o extrato foi diluído comparado ao extrato puro. Os valores das MICs do extrato bruto de grumixama obtidos para as bactérias testadas variaram de 100,82 mg AGE/L a 420, 08 mg AGE/L e para o extrato fenólico a variação foi de 149,93 mg AGE/L a 499,75 mg AGE/L. As bactérias mais sensíveis ao extrato bruto de grumixama foram C. violaceum ATCC6357 e E. coli ATCC10536, já para o extrato fenólico, C. violaceum ATCC6357 foi a bactéria mais sensível (Tabela 4). Os valores da MICs do extrato bruto de pitanga variaram de 73,61 mg AGE/L a 98,15 mg AGE/L. As MICs do extrato fenólico variaram de 115,76 mg AGE/L a 165,37 mg AGE/L. E. coli ATCC 10536 foi a bactéria que apresentou a menor MIC, valor de 73,61 mg AGE/L para o extrato bruto de pitanga e C. violaceum ATCC 6357 e A. hydrophila IOC/FDA 110-36 foram as que apresentaram as menores MICs para extrato fenólico de pitanga (Tabela 5). A comparação dos valores da MIC obtidos neste estudo permite constatar que as bactérias testadas apresentaram maior sensibilidade aos extratos de pitanga e que a sensibilidade foi semelhante entre o extrato bruto e o fenólico desta fruta. Não existe uma forma padronizada para expressão dos resultados dos testes antimicrobianos por produtos naturais. Dessa maneira, existem variações na determinação da MIC que impedem uma devida comparação entre diferentes agentes antimicrobianos naturais. Tais variações podem ser atribuídas a vários fatores, como a variação na técnica aplicada (em caldo ou meio sólido), a origem e época da colheita da planta, se são utilizadas plantas frescas ou secas, os tipos de solventes utilizados no preparo dos extratos, o próprio micro-organismo avaliado, entre outros (OSTROSKY et al., 2008; FENNEL et al., 2004). Os resultados constatados neste trabalho indicaram sensibilidade antimicrobiana aos extratos brutos e fenólicos de grumixama e pitanga, indicando que mesmo em concentrações aproximadamente 20 vezes diluídas, os extratos apresentaram atividade antimicrobiana e que possivelmente estando na forma diluída terão pouca influencia no aspecto sensorial do 46

(47) alimento. Entre as características para escolha de um agente antimicrobiano, deve ser considerada sua compatibilidade química e sensorial com o alimento alvo e sua efetividade contra micro-organismos indesejáveis (SETTANNI; CORSETTI, 2008). Alguns extratos naturais, quando testados como agentes antimicrobianos, apresentaram resultados satisfatórios, porém as características sensoriais dos alimentos não foram avaliadas (ALMEIDA et al., 2014) ou quando analisadas, tornaram sua utilização inviável (SILVA, 2007). Em trabalho realizado por Zola (2014), foram obtidos valores da MICs para extratos de grumixama e pitanga efetivos contra algumas bactérias de importância na área de microbiologia de alimentos. Os valores da MIC determinados para o extrato fenólico de grumixama foram menores que 260 mg AGE/L contra S. aureus e B. cereus, 520 mg AGE/L contra P. aeruginosa e 1,040 mg AGE/L contra E. coli e Listeria monocytogenes. Já o extrato fenólico de pitanga apresentou valor da MIC menor que 490 mg AGE/L contra S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, L. monocytogenes e B. cereus (ZOLA, 2014). Os resultados da MIC de grumixama e pitanga obtidos no presente trabalho foram menores que os encontrados por Zola (2014). As bactérias testadas se mostraram mais sensíveis que as bactérias usadas por esse autor, apresentando MIC consideravelmente menor. A atividade antimicrobiana de extratos ricos em compostos fenólicos é bem conhecida (ALVARENGA et al, 2007). Esses compostos atuam causando danos a membrana celular ou ruptura da camada de peptideoglicano, causando a fuga de componentes citoplasmáticos como proteínas ou glutamato de potássio e fosfato. Causam também inibição do transporte ativo e o desacoplamento da fosforilação oxidativa. A presença do grupo hidroxila no composto fenólico pode influenciar na sua atividade antimicrobiana por meio da ligação ao local ativo de enzimas, formando ligações de hidrogênio e alterando o metabolismo celular (SALAWU et al., 2011; LIU, 2003; HAIDARI et al., 2009). 5.4 - Quantificação da inibição da produção de violaceína por C. violaceum ATCC 6357 5.4.1 - Quantificação da inibição da produção de violaceína pelos extratos obtidos de grumixama Os extratos bruto e fenólico de grumixama, em todas as concentrações testadas, apresentaram reduções significativas no percentual de inibição da produção de violaceína, 47

(48) comparadas ao controle (p<0,05) (Figuras 10 a 13). As contagens de UFC ml-1 após 24 horas de incubação na presença dos extratos, em suas diferentes concentrações, ou dos controles, não apresentaram diferença estatisticamente significativa, demonstrando que os mesmos tiveram apenas propriedades de inibição do quorum sensing, sem afetar o crescimento microbiano (Figura 10 a 13). Figura 10 - Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato bruto de grumixama em diferentes concentrações e avaliação do crescimento microbiano (Log UFC ml-1) após 24 horas de incubação na presença dos extratos. O controle consistiu do meio LB adicionado de 200 µl de água destilada esterilizalada. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem estatisticamente entre si (p<0,05). Os resultados revelaram ainda que todos os extratos, em suas maiores concentrações avaliadas, tiveram uma inibição no percentual de violaceína maior ou igual ao da furanona, composto de comprovada inibição do sistema quorum sensing (PAN e REN, 2009; GRAM et al., 1996; MANEFIELD et al., 2000; KALIA, 2012), que inibiu 79% quando usada na concentração de 39,4 µM. O extrato bruto de grumixama apresentou inibição da produção de violaceína que variou entre 84 a 50 %, de acordo com a concentração avaliada (Figura 10). Os percentuais de inibição da produção de violaceína pela furanona e pelo extrato bruto de grumixama na concentração de 100,82 mg AGE/L não diferiram estatisticamente (p<0,05). As duas menores concentrações avaliadas apresentaram menor eficácia na capacidade de 48

(49) inibição do sistema quorum sensing em C. violaceum (Figura 10). A redução na produção de violaceína pode ser observada na Figura 11. Figura 11 - Inibição da produção de violaceína pelo extrato bruto de grumixama. A) Controle, B) Furanona na concentração de 39,4 µM, C) Extrato bruto de grumixama na concentração de 100,82 mg AGE/L, D) Extrato bruto de grumixama na concentração 50,41 mg AGE/L, E) Extrato bruto de grumixamana concentração 33,61 mg AGE/L e F) Extrato bruto de grumixama na concentração de 25,21 mg AGE/L. Nas Figuras 12 e 13 estão apresentados os resultados de inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de grumixama, em diferentes concentrações. Constatou-se que o extrato fenólico na concentração 119,94 mg AGE/L apresentou elevada eficiência na inibição (90%), alcançando valores superiores aquele obtido com furanona (79%). Também houve inibição da produção de pigmento quando C. violaceum cresceu na presença dos extratos em concentrações inferiores, porém com menor eficiência, sendo que as concentrações 59,97 mg AGE/L e 39,98 mg AGE/L não diferiram significativamente entre si. Os resultados obtidos na contagem de células viáveis não revelaram diferenças estatísticas entre os tratamentos, indicando que os extratos, nas concentrações testadas, não inibiram o crescimento de C. violaceum. 49

(50) Figura 12 - Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de grumixama em diferentes concentrações e avaliação do crescimento microbiano (Log UFC ml-1) após 24 horas de incubação na presença dos extratos. O controle consistiu do meio LB adicionado de 200 µl de água destilada esterilizada. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem estatisticamente (p<0,05). Figura 13 - Inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de grumixama. A) Controle, B) Furanona na concentração de 39,4 µM, C) Extrato fenólico de grumixama na concentração de 119,94 mg AGE/L, D) Extrato fenólico de grumixama na concentração 59,97 mg AGE/L, E) Extrato fenólico de grumixama na concentração 39,98 mg AGE/L e F) Extrato fenólico de grumixama na concentração de 29,99 mg AGE/L. 5.4.2 - Quantificação da inibição da produção de violaceína pelos extratos obtidos de pitanga Os extratos bruto e fenólico de pitanga, em todas as concentrações testadas, apresentaram reduções significativas no percentual de inibição da produção de violaceína, comparadas ao controle (p<0,05) (Figuras 14 - 17). As contagens de UFC ml-1, após 24 horas de incubação 50

(51) na presença dos extratos em suas diferentes concentrações ou dos controles, não apresentaram diferenças significativas, demonstrando haver apenas propriedades de inibição do sistema quorum sensing pelos extratos nas concentrações avaliadas (Figura 14 - 17). Constatou-se que o extrato bruto de pitanga, na concentração de 58,89 mg AGE/L, reduziu 96,8 % a produção de violaceína em comparação ao controle, (Figura 14). Não houve diferença significativa no percentual de inibição da produção de violaceína entre furanona e os extratos de pitanga nas concentrações de 46,30 mg AGE/L, em 30,87 mg AGE/L e 23,15 mg AGE/L. A Figura 15 mostra a diferença observada na produção do pigmento violaceína nas diferentes concentrações do extrato bruto de pitanga e a Figura 17 pelo extrato fenólico da mesma fruta. Figura 14 - Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato bruto de pitanga em diferentes concentrações e avaliação do crescimento microbiano (Log UFC ml -1) após 24 horas de incubação na presença dos extratos. O controle consistiu do meio LB adicionado de 200 µl de água destilada esterelizada. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem estatisticamente (p<0,05). 51

(52) Figura 15 - Inibição da produção de violaceína pelo extrato bruto de pitanga. A) Controle, B) Furanona na concentração de 39,4 µM, C) Extrato bruto de pitanga na concentração de 58,89 mg AGE/L, D) Extrato bruto de pitanga na concentração de 29,44 mg AGE/L, E) Extrato bruto de pitanga na concentração de 19,66 mg AGE/L e F) Extrato bruto de pitanga na concentração de 14,72 mg AGE/L. Figura 16 - Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de pitanga em diferentes concentrações e avaliação do crescimento microbiano (Log UFC ml -1) após 24 horas de incubação na presença dos extratos. O controle consistiu do meio LB adicionado de 200 µl de água destilada esterelizada. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem estatisticamente (p<0,05). Figura 17 - Inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de pitanga. A) Controle, B) Furanona na concentração de 39,4 µM, C) Extrato fenólico de pitanga na concentração de 52

(53) 92,61 mg AGE/L, D) Extrato fenólico na concentração de 46,30 mg AGE/L, E) Extrato fenólico de pitanga na concentração de 30,87 mg AGE/L e F) Extrato fenólico de pitanga na concentração de 23,15 mg AGE/L. Os resultados obtidos evidenciam que os extratos das duas frutas avaliadas, grumixama e pitanga apresentaram-se como potenciais inibidores do sistema quorum sensing em C. violaceum. Todos os extratos testados foram capazes de inibir a produção de violaceína, chegando até uma redução máxima de 96,8%, em comparação ao controle. Até mesmo na concentração 100 vezes diluída, os extratos se mostraram eficazes na redução da produção de violaceína e, portanto na inibição do quorum sensing. Em conformidade com o presente trabalho, vários estudos demonstraram a eficácia de extratos naturais, contendo compostos fenólicos, em inibir a produção de violaceína por C. violaceum. Vattem et al. (2007) demonstraram atividade anti-quorum sensing por frutas como framboesa, mirtilo e uva, onde estas apresentaram redução na produção de violaceína que variou de 20 a 60%. Nesse mesmo estudo, ervas e especiarias também foram testadas apresentando redução de 78% na produção de violaceína em manjericão, 60% em tomilho e brassica e 40% em alecrim, gengibre e açafrão. Assim, os resultados do presente estudo foram consideravelmente maiores do que os encontrados no estudo de Vattem et al. (2007). Kigelia africana, da família Bignoniaceae, produz uma fruta conhecida por sua forte atividade terapêutica atribuída à presença de compostos fenólicos. O extrato obtido dessa fruta apresentou grande potencial para atividade anti-quorum sensing com redução da produção de violaceína em até 99,76% (CHENIA, 2011). O estudo de Borges et al. (2014) avaliou a atividade de compostos fenólicos isolados sobre a produção de violaceína e foi constatada redução de 59% na presença de ácido gálico, 72% no de ácido ferúlico, 75% no de caféico, 48% no de floridizina, 33% em epicatequina e 51% para glicosídeo olieuropeína, todos na concentração de 1000 µg/ml. Outro estudo, feito por Huber et al. (2003), demostrou o efeito na inibição do quorum sensing por compostos fenólicos como epigalocatecolamina (EGCG), ácido elágico e ácido tâmico, que reduziram a bioluminescência em E. coli MT102 pSB403, a fluorescência em Pseudomonas putida pKR-C12, a formação de biofilme e a motilidade Burkholderia cepacia. Alguns trabalhos identificaram os compostos fenólicos majoritários presentes na grumixama e pitanga. Na grumixama foram identificados os compostos fenólicos como antocianidinas (MORENO, 2007), cianidinas, quercetinas, ácido sinápico e ácido gálico 53

(54) (SILVA et al., 2014). Também foram identificados catequina e epicatequina (INFARTE, 2013), flavonóides (GUEDES, 2012), ácido elágico, miricetina e rutina (REYNERTSON, 2007). Na pitanga, os principais compostos fenólicos identificados foram ácido gálico (PRADO, 2009), ácido clorogênico, ácido caféico, ácido ferúlico, ácido p-cumárico, rutina, miricetina e quercetina (KARWOWSKI, 2012). Como grumixama e pitanga são frutas ricas em compostos fenólicos, a atividade anti-quorum sensing evidenciada neste trabalho pode estar relacionada à presença desses compostos identificados como já relatado (VATTEM et al., 2007; CHENIA, 2011; BORGES et al., 2014; HUBER et al., 2003). Porém, a atividade anti-quorum sensing também pode estar relacionada a outros compostos presentes nessas frutas. Esse fato pode ser observado devido a ambos os extratos, bruto e fenólico, apresentarem um efeito anti-quorum sensing considerável. O extrato bruto contêm todas as substâncias presentes nas frutas que podem ser extraídas pelos solventes utilizados na extração (etanol, metanol e acetona). Já o extrato fenólico, contêm apenas os compostos fenólicos dessas frutas, sendo o método de extração específico para estes compostos (extração em fase sólida – C18). Gilber e Alves (2003) e Asoanaivo et al. (2001) afirmaram que extratos vegetais podem ser mais eficazes do que os constituintes isolados de uma planta. Este fato pode ser atribuído pelas interações positivas entre os componentes presentes no extrato. O beneficio do extrato pode estar na proteção do componente ativo da planta a uma degradação enzimática, ou até mesmo por facilitar o transporte através de barreiras, resultando em uma maior eficácia quando comparado ao composto purificado, dessa forma sendo mais eficaz sua utilização. Na literatura, até o momento, são escassos os estudos que avaliaram a atividade antiquorum sensing de frutas. Entretanto, é crescente o número de estudos que avaliam essa atividade em plantas, incluindo ervas medicinais (ALVAREZ, MOREIRA e PONCE, 2012). Um estudo com 20 ervas da medicina tradicional chinesa demonstrou que 40% dessas inibiam a atividade de quorum sensing, indicada pela inibição da produção de violaceína. Esse estudo demonstrou que a atividade anti-quorum sensing pode ser mais presente do que se imagina e esse potencial poderia oferecer um modo alternativo de ação contra bactérias patogênicas que utilizam o sistema quorum sensing para regular virulência. Além disso, as ervas estudadas pertenciam a diferentes famílias de plantas sugerindo que os inibidores de quorum sensing não são exclusivos de um grupo de plantas (YEO e THAM, 2011). 54

(55) Plantas medicinais tradicionalmente usadas em todo o mundo apresentaram inibição da produção de violaceína, e Syzygiumcumini L. e Pimenta dioica L inibiram a produção desse pigmento em 80% (VASAVI, ARUN e REKHA, 2013). Centella asiatica L. (VASAVI e REKHA, 2014) e Adenanthera pavonina L (VASAVI ARUN e REKHA, 2015) reduziram completamente a produção de violaceína, sendo os flavonóides sugeridos como os responsáveis por essa ação. Além dessas plantas, o extrato de Rhizophora annamalayanacasca, uma planta do mangue, apresentou atividade anti-quorum sensing por meio de inibição da violaceína e da bioluminescência em V. harveyi demonstrando o potencial dos frutos de manguezais como agentes anti-quorum sensing (MUSTHAFA et al., 2013). Sementes de Cuminum cyminum, conhecido pelo nome popular de cominho, apresentaram atividade como potentes inibidores do quorum sensing inibindo em 86% a produção de violaceína por C. violaceum (PACKIAVATHY et al., 2011). Além desses, cafeína se mostrou um potente inibidor do quorum sensing reduzinho significativamente a produção de violaceína, mostrando atuar na inibição da produção de AHL (NORIZAN, YIN e CHAN, 2013). Além da atividade anti-quorum sensing ser evidenciada em produtos vegetais também foi comprovada por produtos como o mel (TRUCHADO et al., 2009) e a própolis (ALVAREZ, MOREIRA e PONCE, 2012). Méis uniflorais reduziram a produção de violaceína em até 95%, sendo essa capacidade atribuída à inibição da síntese de AHL (TRUCHADO et al., 2009). Já a própolis apresentou redução no percentual de violaceína de, aproximadamente 60%, onde foi sugerida que essa atividade poderia ser devida a presença de compostos fenólicos (ALVAREZ, MOREIRA e PONCE, 2012). 5.5 - Efeito dos extratos de grumixama e pitanga sobre a motilidade tipo swimming e swarming em S. marcescens e A. hydrophila IOC/FDA110-36 Os extratos de grumixama e pitanga atuaram reduzindo a motilidade tipo swimming e swarming em ambas as bactérias avaliadas. As Figuras 18, 19, 20 e 21 apresentam os resultados para motilidade tipo swimming e swarming. 55

(56) Figura 18 - Efeito do extrato de grumixama sobre a motilidade tipo swimming em S. marcescens e A. hydrophila IOC/FDA110-36. A-C) Testes com S. marcescens e D-E) Testes com A. hydrophila IOC/FDA110-36. A) Controle: S. marcescens, B) Extrato bruto de grumixama na concentração de 101,02 mg AGE/L, C) Extrato fenólico de grumixama na concentração de 119,94 mg AGE/L. D) Controle: A. hydrophila IOC/FDA110-36, E) Extrato bruto de grumixama na concentração de 252,05 mg AGE/L, F) Extrato fenólico de grumixama na concentração de 299,85 mg AGE/L. Figura 19 - Efeito do extrato de grumixama sobre a motilidade tipo swarming em S. marcescens e A. hydrophila IOC/FDA110-36. A-C) Testes com S. marcescens e D-E) Testes com A. hydrophila IOC/FDA110-36. A) Controle: S. marcescens, B) Extrato bruto de grumixama na concentração de 101,02 mg AGE/L, C) Extrato fenólico de grumixama na 56

(57) concentração de 119,94 mg AGE/L. D) Controle: A. hydrophila IOC/FDA110-36, E) Extrato bruto de grumixama na concentração de 252,05 mg AGE/L, F) Extrato fenólico de grumixama na concentração de 299,85 mg AGE/L. Figura 20 - Efeito do extrato de pitanga sobre a motilidade tipo swimming em S. marcescens e A. hydrophila IOC/FDA110-36. A-C) Testes com S. marcescens e D-E) Testes com A. hydrophila IOC/FDA110-36. A) Controle: S. marcescens, B) Extrato bruto de pitanga na concentração de 58,89 mg AGE/L, C) Extrato fenólico de pitanga na concentração de 92,61 mg AGE/L. D) Controle: A. hydrophila IOC/FDA110-36, E) Extrato bruto de pitanga na concentração de 58,82 mg AGE/L, F) Extrato fenólico de pitanga na concentração de 213,52 mg AGE/L. 57

(58) Figura 21- Efeito do extrato de pitanga sobre a motilidade tipo swarming em S. marcescens e A. hydrophila IOC/FDA110-36. A-C) Testes com S. marcescens e D-E) Testes com A. hydrophila IOC/FDA110-36. A) Controle: S. marcescens, B) Extrato bruto de pitanga na concentração de 58,89 mg AGE/L, C) Extrato fenólico de pitanga na concentração de 92,61 mg AGE/L. D) Controle: A. hydrophila IOC/FDA110-36. E) Extrato bruto de pitanga na concentração de 58,82 mg AGE/L, F) Extrato fenólico de pitanga na concentração de 213,52 mg AGE/L. O sistema quorum sensing controla a formação de biofilme, motilidade tipo swarming, a produção de biossurfactantes, de nucleases e do pigmento vermelho chamado prodigiosina em S. marcescens (BAKKIYARAJ et al., 2012). Como podem ser observados nas Figuras 19-22, os extratos bruto e fenólico de grumixama e pitanga foram capazes de reduzir a motilidade tipo swimming e swarming, atuando como inibidores do sistema quorum sensing. Vale ressaltar que as concentrações utilizadas não inibiram a multiplicação deste micro-organismo (Tabela 4 e Tabela 5). Os dados da motilidade de S. marcescens ainda apontaram uma inibição na produção de prodigiosina, pigmento vermelho cuja produção é controlada pelo quorum sensing (THOMSON, N. R. et al, 2000; FINERAN, P. C. et al, 2005; FINERAN, P. C. et al, 2013). Estudos semelhantes também encontraram redução na motilidade bacteriana por produtos naturais. Nove isolados de bactérias associadas a coral, entre 19 testados por Bakkiyaraj et al. (2012), atuaram inibindo a motilidade tipo swarming em S. marcescens. Epigalocatequina galato (EGCG), um composto extraído do chá verde, provocou reduções na motilidade em Campylobacter jejuni em até 75% (CASILLO et al., 2014). Já Packiavathy et al. (2011) testaram extratos de Cuminum cyminum na motilidade em Proteus mirabilis, P. 58

(59) aeruginosa PAO1 e S. marcescens, encontrando resultados de diminuição da motilidade tipo swarming proporcionais as concentrações do extrato. A cafeína atuou também inibindo de motilidade swarming em P. aeroginosas PA01 tendo sua atividade atribuída a inibição da produção de AHL (NORIZAN, YIN e CHAN, 2013). As plantas Centella asiatica L. (VASAVI e REKHA, 2014) e Adenanthera pavonina L (VASAVI ARUN e REKHA, 2015) inibiram completamente esse tipo de motilidade nessa bactéria. A motilidade é uma característica de A. hydrophila regulada pelo quorum sensing, envolvendo sinalizadores AI-1 e AI-2 (DANIELS, VANDERLEYDEN e MICHIELS, 2004; KOZLOVA et al., 2008). Esse mecanismo controla a expressão de vários fatores em A. hydrophila (SWIFT et al, 1997) pelo sistema quorum sensing, por meio dos homólogos LuxRI chamados de AhyRI neste micro-organismo (GARDE et al., 2010). Os resultados descritos acima evidenciaram uma inibição da motilidade tipo swimming e swarming em A. hydrophila, possivelmente envolvendo mecanismo de inibição do quorum sensing. Uma modificação na motilidade celular pode ter consequências profundas sobre a patogenicidade do organismo, pois alguns genes de virulência são normalmente co-regulados com a motilidade (MCCARTER, 2006). Os extratos de grumixama e pitanga se mostraram efetivos na regulação da motilidade em S. marcescens e A. hydrophyla, indicando seus potenciais em controlar processos de virulência regulados por este mecanismo. 5.6 – Efeito dos extratos sobre a formação de biofilme em C. violaceum ATCC6357, S. marcescens, A. hydrophila IOC/FDA110-36 e E. coli ATCC10536 Os efeitos de ambos os extratos de grumixama e pitanga sobre a formação de biofilme foram semelhantes para todos os micro-organismos estudados. Porém, C. vioulaceum foi o micro-organismo mais influenciado na presença dos mesmos, com um aumento na biomassa de até 240 %. Esses resultados sugerem que a substância envolvida na regulação do biofilme pode estar presente tanto no extrato bruto como no extrato fenólico da fruta. Os resultados para formação de biofilme para os extratos brutos e fenólicos de pitanga e grumixama estão apresentados nas Figuras 22, 23, 24 e 25. 59

(60) Figura 22 - Formação de biofilme na presença do extrato bruto de grumixama. A) C. violaceum ATCC6357. B) S. marcescens. C) A. hydrophila IOC/FDA110. E) E. coli ATCC10536. 60

(61) Figura 23 - Formação de biofilme na presença do extrato fenólico de grumixama. A) C. violaceum ATCC6357. B) S. marcescens. C) A. hydrophila IOC/FDA110. E) E. coli ATCC10536. 61

(62) Figura 24 - Formação de biofilme na presença do extrato bruto de pitanga. A) C. violaceum ATCC6357. B) S. marcescens. C) A. hydrophila IOC/FDA110 E) E. coli ATCC10536. 62

(63) Figura 25 - Formação de biofilme na presença do extrato fenólico de pitanga. A) C. violaceum ATCC6357. B) S. marcescens. C) A. hydrophila IOC/FDA110. E) E. coli ATCC10536. Os resultados obtidos para a formação de biofilme contradizem os anteriormente descritos neste trabalho, onde os extratos de ambas as frutas tiveram ação de inibição do sistema quorum sensing, atuando negativamente sobre a expressão de fenótipos como produção de pigmento em C. violaceum e motilidade em A. hydrophila e S. marcenscens. Um estudo feito por Viana et al., 2009 apresentou resultados semelhantes a este, onde a furanona em concentração de 1 ml L-1 não afetou o crescimento e formação de biofilme em H. alvei em teste de microplaca utilizando cristal violeta. Além desse, um estudo feito por Ponce et al., 2012, com Enterobacter cloacae mostrou que o sistema quorum sensing regulou de forma negativa a atividade proteolítica nessa bactéria e na síntese de enzimas hidrolíticas mediadas por AHLs. Ta et al., (2014) em trabalho com várias espécies de plantas encontraram que 40% das mesmas não apresentaram nenhuma inibição ou até mesmo aumentaram a formação da massa do biofilme, quando comparados ao controle. Em estudo feito por Ghosh et al. (2014), 63

(64) os resultados revelaram que o extrato regulou a expressão de genes responsáveis pela virulência e motilidade celular e reprimiu genes relacionados a formação do biofilme. A atividade anti-quorum sensing do extrato da casca de goiaba e os resultados indicaram uma inibição de 19% dos genes expressos em C. violaceum, envolvendo genes relacionados a motilidade, biogênese celular, membrana externa, mecanismo de transdução e transporte e metabolismo de aminoácido. Os extratos de grumixama e pitanga tiveram atividade inibindo a expressão de fenótipos regulados pelo quorum sensing e aumentando a expressão de outros, sugerindo que os extratos contêm substâncias que desempenham atividades distintas sobre o quorum sensing. Teplitski, Robinson e Bauer (2000) sugeriram que as plantas podem produzir substâncias que imitam as AHLs, podendo agir positivamente em certas espécies bacterianas, ou atuar de forma negativa em algumas outras. Naquele trabalho, feito com exsudatos de mudas de ervilha, foi evidenciado a secreção de substâncias semelhantes a AHL com atividade inibitória sobre a estirpe de C. violaceum CV026, porém várias outros compostos estimularam outras estirpes repórteres do sistema quorum sensing. Esses autores sugeriram que as plantas podem produzir falsos compostos que imitam os sinalizadores quorum sensing, interferindo com a síntese ou transporte de AHL e também interagindo diretamente com a proteína receptora de AHL (homóloga a LuxR). Ahmad, Viljoen, e Chenia (2014) estudaram 22 compostos contidos em óleos essenciais e encontraram resultados variáveis na inibição da produção de violaceína; onde foi observado uma redução máxima de 90% em um dos compostos e um aumento por 7 dos 22 óleos essenciais testados. Os autores sugeriram que muitos óleos essenciais têm estruturas semelhantes às AHLs e que estas poderiam competir com a AHL relacionada à produção de violaceína (C6-AHL). A diversidade estrutural dos compostos dos óleos essenciais permitiria que eles tivessem um amplo espectro de atividade. De forma geral, vários compostos presentes em fontes naturais podem possuir substâncias semelhantes às moléculas sinalizadoras do quorum sensing (NOVAK e FRATAMICO, 2004; CHOO, RUKAYADI e HWANG, 2006; VATTEM et al., 2007; TRUCHADO et al., 2012; YEO e THAM, 2012; GANIN et al., 2012; BLANA e NYCHAS, 2013; ALVAREZ, MOREIRA e PONCE, 2013; TAN e YIN, 2013; NAZZARO, FRATIANNI, e COPPOLA, 2013). Estudos descritos na literatura demonstram que produtos naturais apresentaram uma atividade na inibição do biofilme, como naringenina, um flavonóide presente em frutas 64

(65) cítricas, atuando em biofilmes de V. harveyi e E. coli (VIKRAM et al, 2010). Além desse, também foram demonstradas atividades de inibição de biofilme pelos extratos fenólicos de cloudberries selvagens finlandeses (Rubus chamaemorus) e framboesas selvagens (Rubus idaeus) (PRILHA et al., 2014). Produtos naturais a partir de Centratherum punctatum, como lactonas de sesquiterpeno, também inibiram a produção de biofilme em P. aeruginosa, reduzindo a produção de AHL (AMARA, et al., 2012). Epigalocatequina galato (EGCG), extraído do chá verde, provocou reduções de até 75% na formação do biofilme em Campylobacter jejuni (CASILLO, HEREDIA e GARCÍA, 2014). Loughlin et al. (2013) demonstraram a eficácia de meta-bromo-tiolactona (mBTL), um análogo do auto indutor de P. aeroginosa, em inibir o quorum sensing impedindo a formação de biofilme neste microorganismo. Diferentes mecanismos foram propostos para explicar a inibição do sistema quorum sensing por produtos naturais. Esses mecanismos incluem a inibição da síntese da molécula sinalizadora ou receptora, inativação enzimática do sinalizador e pela semelhança das estruturas químicas dos produtos naturais aos sinalizadores do quorum sensing, agindo por competição junto aos receptores. Além desses, à ligação a proteína receptora pode provocar uma mudança na sua conformação prejudicando sua capacidade de interagir com a RNA polimerase, reduzindo seu potencial de transcrição manifestando, assim, sua atividade como antagonismo (Loughlin et al., 2013). Os compostos presentes nos extratos de grumixama e pitanga podem possuir semelhança estrutural aos sinalizadores utilizados no sistema quorum sensing ou interferir na síntese desses, inibindo fenótipos regulados pelo quorum sensing e em outros estimulando, como foi evidenciado também por Teplitski, Robinson e Bauer (2000). Mais estudos devem ser conduzidos para a identificação dos compostos presentes nos extratos das frutas testadas, bem como a elucidação do modo de ação dos mesmos sobre o sistema quorum sensing dos microorganismos avaliados. 6 - CONCLUSÃO Os resultados encontrados neste trabalho são importantes, pois ainda são escassos os estudos sobre atividade anti-quorum sensing de frutas, principalmente frutas nativas brasileiras. Com esse trabalho, há um incremento nas alternativas de produtos naturais com potenciais para controlar a atividade antimicrobiana e valorização de frutas nativas brasileiras. 65

(66) Este estudo também indica o potencial dos extratos de ambas as frutas para aplicações nas indústrias alimentícias e farmacêuticas, inibindo fenótipos de deterioração e de virulência regulados pelo quorum sensing. 7 - REFERÊNCIAS ABE, L. T.; LAJOLO, F. M.; GENOVESE, M. I. Potential dietary sources of ellagic acid and other antioxidants among fruits consumed in Brazil: Jabuticaba (Myrciaria jaboticaba (Vell.) Berg. Journal Sciences Food Agriculture. v. 92, p.1679–1687, 2012. ADONIZIO, A.; KONG, K.; MATHEE, K. Inhibition of quorum sensing-controlled virulence factor production in pseudomonas aeruginosa by south Florida plant extracts. Antimicrobial agents and chemotherapy. v. 52. n. 1 p. 198–203, 2008. AHMAD, A.; VILJOEN, A. M. e CHENIA, H. Y. The impact of plant volatiles on bacterial quorum sensing. Letters in Applied Microbiology. v. 60, p. 8-19, 2014. ALMEIDA, A. C.; OLIVEIRA, L.; PAULO, P. D.; MARTINS, E. R.; SOUZA, R. M.; FIGUEIREDO, L. S.; SANTOS, C. A.; FONSECA, H. C. Potencial antimicrobiano dos óleos essenciais de cravo-da-índia (Syzygium aromaticum L.) e alfavacão (Ocimum gratissimum L.) em carne moída de ovinos contaminada experimentalmente com Staphylococcus aureus. Revista brasileira Ciências Veterinária. v. 20, n. 4, p. 248-251, 2014. ALVARENGA, A.L. et al. Atividade antimicrobiana de extratos vegetais sobre bactérias patogênicas humanas. Revista Brasileira de Plantas Medicinais. v. 9, n.4, p.86-91, 2007. ALVAREZ, M. V.; ORTEGA-RAMIREZ, L. A.; GUTIERREZ-PACHECO, M,M.; BERNAL-MERCADO, T.; RODRIGUEZ-GARCIA, I.; GONZALEZ-AGUILAR, G. A.; PONCE, A.; MOREIRA,M. R.; ROURA, S. I.; AYALA-ZAVALA, F. F. Oregano essential oil-pectin edible films as anti-quorum sensing and food antimicrobial agents. Frontier in Microbiology. v. 5. p. 1-7, 2014. ALVAREZ, M.; MOREIRA, M.; PONCE, A. Antiquorum sensing and antimicrobial activity of natural agents with potential use in food. Journal of Food Safety. v. 32, p.379-387, 2012. AMAYA, S.; PEREIRA, J. A.; BORKOSKY, S. A.; VALDEZ, J. C.; BARDÓNA, A.; ARENA. M. E. Inhibition of quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa by sesquiterpene lactones. Phytomedicine. v. 19, p. 1173-1177, 2009. AN, D.; DANHORN, T.; FUQUA, C.; PARSEK, M. R. Quorum sensing and motility mediate interactions between Pseudomonas aeruginosa and Agrobacterium tumefaciens in biofilm cocultures. Proceedings of the National Academy of Sciences. v. 103, n. 10, p. 3828-3833, 2006. 66

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