Repositório UFAL: Manejo da fusariose na pimenta-do- reino cv. Bragantina

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO

EM PROTEÇÃO DE PLANTAS

JOSÉ GOMES FILHO

MANEJO DA FUSARIOSE EM PIMENTA-DO-REINO cv. BRAGANTINA

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JOSÉ GOMES FILHO

MANEJO DA FUSARIOSE EM PIMENTA-DO-REINO cv. BRAGANTINA

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Proteção de Plantas do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Alagoas, como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre em Proteção de Plantas.

Orientadora: Prof.ª Dr.ª Edna Peixoto da Rocha Amorim

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G633m Gomes Filho, José.

Manejo da fusariose em pimenta-do-reino cv. Bragantina / José Gomes Filho. – 2017.

92 f. : il.

Orientadora: Edna Peixoto da Rocha Amorim.

Dissertação (Mestrado em Proteção de Plantas) – Universidade Federal de Alagoas. Centro de Ciências Agrárias. Rio Largo, 2017.

Bibliografia: f. 72-90.

1. Piper nigrum – Doença - Controle. 2. Fusariose. 3. Pimenta do reino. I. Título.

CDU: 633.841 Catalogação na fonte

Universidade Federal de Alagoas Biblioteca Central

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DEDICO

A Deus, pela clareza das coisas. Aos meus pais José Gomes e

Maria do Socorro de Oliveira Gomes, pelo exemplo de honestidade, dedicação, apoio e incentivo em todas as etapas de minha vida. À minha avó Maria de Lourdes de Oliveira pelo exemplo de vida; meus irmãos Mauri de Oliveira Gomes, Cícero de Oliveira Gomes, José Luciano de Oliveira Gomes, Maciel de Oliveira Gomes e a minha namorada Tyara Lopes Alves, pelo incentivo e companheirismo. Aos meus sobrinhos e sobrinhas Gabriela, Grazielli, Bruna e Diego

Para aquela com quem aprendi muito, pela amizade, experiência transmitida e pela oportunidade de fazer parte de sua história de muitas realizações, Profª. Drª. Edna Peixoto da Rocha Amorim

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AGRADECIMENTOS

À Deus em primeiro lugar, pela vida e por ter guiado meus caminhos durante esses anos. À Universidade Federal de Alagoas, ao Centro de Ciências Agrárias, e ao Programa de Pós - Graduação em Proteção de Plantas por permitir a realização do mestrado.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de estudos.

À minha orientadora, prof.ª Drª. Edna Peixoto da Rocha Amorim, por mais uma orientação, pela dedicação, apoio, atenção, amizade, paciência e ensinamentos transmitidos para a realização desse trabalho.

À prof.ª Drª. Maria de Fátima Silva Muniz, pelos ensinamentos, pela contribuição ao realizar as correções e sugestões.

À Drª. Maria Quitéria Cardoso dos Santos, pela contribuição ao realizar as correções, pelas sugestões a melhoria do trabalho.

Ao corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Proteção de Plantas, pelos ensinamentos. Aos meus pais, José Gomes e Maria do Socorro, os quais tenho imensa admiração, que sempre estiveram ao meu lado nos momentos difíceis da vida, pelo amor, carinho e educação minha eterna gratidão.

À minha namorada Tyara Lopes Alves, por estar sempre ao meu lado, apoiando, incentivando, e pelo amor.

Aos colegas do Laboratório de Fitopatologia, em especial aos amigos Elton Benedito dos santos, Gerlan do Nascimento Rodrigues, Samuel Lima, Valdeir Carvalho, por todo apoio, amizade e pela ótima convivência durante esses anos.

Aos colegas da pós-graduação (Turma 2015.2), em especial ao amigo Marcelo, pelo excelente convívio durante a realização do curso.

E a todos que contribuíram de forma direta ou indireta na realização desse trabalho.

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RESUMO

A cultura da pimenta-do-reino (Piper nigrum L.), é uma especiaria de grande valor econômico,

consumida mundialmente. No Brasil sua produção vem sendo limitada pela fusariose, principal doença da cultura, provocada pelo fungo Fusarium solani f. sp. piperis, causando a redução dos

plantios no campo e até a morte da planta. Considerando as dificuldades e limitações no controle desta doença, a busca por novos métodos de controle alternativos vem se tornando bastantes promissores nas áreas produtoras do país. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de óleos essenciais, extratos vegetais e matéria orgânica no controle da fusariose em pimenta-do-reino. Foram instalados dois experimentos “in vitro” no Laboratório de Fitopatologia do

Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal de Alagoas (CECA/UFAL): o primeiro avaliou o efeito de óleos essenciais de nim, hortelã, copaíba, eucalipto, coco e alho em diferentes doses de 25, 50, 75 e 100 µL.mL-1, em delineamento inteiramente casualizado em

esquema fatorial (6 x 4) + 2. O segundo, avaliou o efeito dos extratos brutos aquosos (EBA) nas concentrações de 5, 10, 15 e 20%, com experimento inteiramente casualizado em esquema fatorial (5 x 4) + 2, ambos com seis repetições, sobre a inibição do crescimento micelial do patógeno em meio BDA. A partir dos melhores resultados “in vitro” foi realizado um

experimento com mudas de pimenta-do-reino inoculadas com discos de micélio de F. solani,

que foram pulverizadas com 20 mL dos óleos essenciais de hortelã e nim, nas doses de 50 e 75 µL.mL-1 e com os extratos brutos aquosos de melão-de-são caetano e mandioca nas

concentrações de 10 e 15%. O fungicida foi pincelado nos caules das plantas em forma de pasta na dose de 0,2 g.100 mL-1. O delineamento foi inteiramente casualizado, com dez tratamentos

e cinco repetições. Em outro experimento, avaliou-se os resíduos orgânicos de casca de coco, casca de mandioca, folhas de eucalipto, nim e de pimenta-do-reino nas doses de 25, 50, 75 e 100 g.Kg-1 incorporadas ao solo para o controle da fusariose em mudas de pimenta-do-reino,

sendo avaliadas aos 30, 60 e 90 dias após a inoculação do patógeno com uma suspensão de 1,8 x 10-6 con/mL. Os dados foram submetidos à análise de variância e de regressão e as médias

comparadas pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Os óleos essenciais de hortelã e nim (50 e 75 µL.mL-1) e os extratos de melão-de-são caetano e mandioca (10 e 15%)

proporcionaram os maiores percentuais de inibição micelial (91,61, 100, 41,74, 45,96, 61,01, 57,61, 51,53 e 55,48%), respectivamente. O EBA de melão-de-são caetano (15%) e o óleo essencial de hortelã (75 µL.mL-1), promoveram os menores índice de doença, com 24 e 28%

respectivamente. Os resíduos orgânicos de casca de mandioca e folhas de nim foram os mais eficientes no controle da fusariose aos 30, 60 e 90 dias.

Palavras-chave: Piper nigrum, Fusarium solani. Óleos essenciais. Extratos vegetal. Resíduos

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ABSTRACT

The Black pepper (Piper nigrum L.) is a spice of great economic value, consumed worldwide.

In Brazil, its production has been limited by the fusariosis, the main disease of the crop, caused by the fungus Fusarium solani f. sp. piperis, causing the reduction of the plantations in the field

and until the plant death. Considering the difficulties and limitations in controlling this disease, the search for new alternative control methods has become quite promising in the country's producing areas. Thus, the objective of this work was to evaluate the effect of essential oils, plant extracts and organic matter in the control of fusariosis in black pepper. Two in vitro experiments were carried out at the Phytopathology Laboratory of the Agricultural Sciences Center of the Federal University of Alagoas (CECA / UFAL): the first evaluated the effect of essential oils of neem, spearmint, copaiba, eucalyptus, coconut and garlic in different (6 x 4) + 2. The second one, which evaluated the effect of the crude aqueous extracts (EBA) at the concentrations of 5, 10, 10, 15, 25 and 50 μL.mL-1, 15 and 20%, with a completely randomized

experiment in a factorial scheme (5 x 4) + 2, both with six replicates, on the inhibition of mycelial growth of the pathogen in BDA medium. From the best "in vitro" results, an experiment was carried out with Pepper worm seedlings inoculated with F. solani mycelium

discs, which were sprayed with 20 mL of the essential oils of mint and neem at doses of 50 and 75 μL.mL-1 and with the crude aqueous extracts of caetano-melon and cassava in concentrations

of 10 and 15%. The fungicide was brushed in the stems of the pulp-shaped plants at a dose of 0.2 g. 100 mL-1. The design was completely randomized, with ten treatments and five replicates.

In another experiment, organic residues of coconut husk, cassava husk, eucalyptus leaves, neem and black pepper were evaluated at a dose of 25, 50, 75 and 100 g.Kg-1 were incorporated into

the soil for the control of fusariosis in pepper plants, being evaluated at 30, 60 and 90 days after inoculation of the pathogen with a suspension of 1.8 x 10-6 con/mL. The data were submitted

to analysis of variance and regression and the means were compared by the Tukey test at the 5% probability level. Essential oils of peppermint and neem (50 and 75 μL.mL-1) and extracts

of melon-de-cassetane and cassava (10 and 15%) provided the highest percentages of mycelial inhibition (91.61, 100, 41.74, 45.96, 61.01, 57.61, 51.53 and 55.48%), respectively. The EBA of caetano melon (15%) and the essential oil of mint (75 μL.mL-1), promoted the lowest disease

rate, with 24 and 28% respectively. Organic residues of cassava husk and neem leaves were the most efficient in the control of fusariosis at 30, 60 and 90 days.

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Planta de pimenta-do-reino cv. bragantina (A), tutor de madeira usado nos plantios (B) e planta em fase de frutificação (C) ... 17 Figura 2 - Etapas do procedimento do teste de patogenicidade em mudas de pimenta-do-reino. Corte no caule da planta (A); disco de micélio do patógeno com 5 mm de diâmetro (B); inserção do disco no caule da planta (C) ... 33 Figura 3 - Teste de patogenicidade pelo método ferimento das raízes. Ferimento no sistema radicular da planta (A); Deposição de 20 mL da solução de conídios na planta (B) ... 34 Figura 4 - Vista geral do experimento sobre o efeito dos extratos vegetais e óleos essenciais no controle da fusariose ... 38 Figura 5 - Mudas de pimenta-do-reino tratadas com extratos vegetais e óleos essenciais (A); Aplicação do fungicida no colo da planta (B) ... 38 Figura 6 - Incorporação dos resíduos orgânicos ao solo (A); vasos com os resíduos orgânicos incorporados (B) ... 41 Figura 7 - Experimento “in vivo” com resíduos orgânicos no controle da fusariose (Fusarium solani) ... 41

Figura 8 - Sintomas internos da fusariose aos 90 dias. Sistema radicular da planta (A); Corte longitudinal no sistema radicular (B) e no caule da planta (C); Corte transversal no caule (D) e no sistema radicular (E). ... 42 Figura 9 - Aspectos gerais de Fusarium solani.: Verso e reverso da colônia (A - B),

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Figura 11 - Efeito dos óleos essenciais independente da dose utilizada sobre a porcentagem de inibição do crescimento micelial (PIC) de Fusarium solani. ... 49

Figura 12 - Efeito da concentração de extrato bruto aquoso (EBA) de pimenta-do-reino (Piper nigrum L.) na porcentagem de inibição do crescimento micelial (PIC) de Fusarium solani .. 54

Figura 13 - Efeito das médias gerais de extratos brutos aquosos (EBA) sobre a porcentagem de inibição do crescimento micelial (PIC) de Fusarium solani ... 55

Figura 14 - Efeito de óleos essenciais e extratos brutos aquosos sobre a incidência da fusariose (Fusarium solani)em mudas de pimenta do reino. ... 59

Figura 15 - Porcentagem total da frequência das espécies fúngicas identificadas nos resíduos orgânicos de nim, eucalipto, pimenta-do-reino, casca de coco e casca de mandioca, após incubadas por 72 h em meio BDA... 62 Figura 16 - Efeito da incorporação de diferentes doses de resíduos orgânicos no controle da fusariose de pimenta-do-reino. ... 69 Figura 17 - Efeito de resíduos orgânicos sobre a incidência da fusariose aos 30, 60 e 90 dias após a inoculação de Fusarium solani em mudas de pimenta do reino ... 71

Figura 18 - Efeito dos resíduos orgânicos no comprimento da raiz em mudas de pimenta-do-reino na fusariose causada por Fusarium solani ... 72

Figura 19 - Efeitos dos resíduos orgânicos sobre o desenvolvimento do sistema radicular de mudas de pimenta-do-reino aos 90 dias após a inoculação com Fusarium solani. Testemunha

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Características morfológicas e culturais de Fusarium solani, obtido em área

produtora de pimenta-do-reino com sintoma de fusariose no município de Atalaia - AL ... 43 Tabela 2 - Resumo da análise de variância do efeito dos óleos essenciais sobre a porcentagem de inibição do crescimento micelial (PIC%) de Fusarium solani ... 46

Tabela 3 - Efeito dos óleos essenciais sobre o crescimento micelial de Fusarium solani ... 46

Tabela 4 - Modo de ação do óleo essencial testado que apresentou inibição de 100% do crescimento micelial de Fusarium solani ... 50

Tabela 5 - Efeito da interação dos extratos brutos aquosos (EBA) de pimenta-do-reino, mandioca, mamona, melão-de-são caetano e coentro sob diferentes concentrações na porcentagem de inibição do crescimento micelial (PIC) de Fusarium solani ... 51

Tabela 6 - Efeito dos extratos brutos aquosos de melão-de-são caetano (EBAME), mandioca (EBAMA) e óleos essenciais de nim (OENIM), hortelã (OEHORT) sobre a incidência da fusariose em mudas de pimenta-do-reino (Piper nigrum L.) ... 56

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ... 14

2 REVISÃO DE LITERATURA ... 16

2.1 Origem, características botânicas e importância econômica da cultura da pimenta-do-reino ... 16

2.2 Doenças da Pimenta-do-reino ... 18

2.2.1 Fusariose ou podridão-das-raízes... 19

2.3 Manejo da fusariose... 22

2.3.1 Uso de óleos essenciais e extratos vegetais no controle de doenças de plantas ... 23

2.3.2 Resíduos orgânicos no controle de doenças radiculares ... 28

3 MATERIAL E MÉTODOS ... 32

3.1 Local de execução dos experimentos ... 32

3.2 Obtenção e preservação do isolado ... 32

3.3 Teste de patogenicidade e reisolamento do isolado ... 32

3.4 Identificação do patógeno ... 34

3.4.1 Caracterização morfológica ... 34

3.4.2 Caracterização molecular ... 34

3.5 Manejo da doença ... 35

3.5.1 Obtenção das mudas, extratos vegetais e óleos essenciais ... 35

3.5.2 Obtenção dos resíduos orgânicos vegetais ... 35

3.5.3 Análise microbiológica e química dos resíduos orgânicos e análise do solo ... 36

3.5.4 Efeito de extratos vegetais e óleos essenciais sobre o crescimento micelial de Fusarium solani ... 37

3.5.5 Efeito de extratos vegetais e óleos essenciais sobre o controle da fusariose em mudas de pimenta-do-reino ... 39

3.5.6 Efeito da incorporação de matéria orgânica no controle da fusariose em pimenta-do-reino ... 40

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 43

4.1 Identificação do isolado e caracterização molecular ... 43

4.2 Teste de patogenicidade e reisolamento ... 44

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4.3.1 Inibição do crescimento micelial de Fusarium solani com óleos essenciais ... 45

4.3.2 Modo de ação dos óleos essenciais sobre o crescimento micelial de Fusarium solani .. 49

4.3.3 Inibição do crescimento micelial de Fusarium solani com extratos brutos aquosos (EBA) ... 50

4.4 Efeito de extratos vegetais e óleos essenciais sobre o controle da fusariose (Fusarium solani) em mudas de pimenta-do-reino ... 56

4.5 Resíduos orgânicos no controle da fusariose em pimenta-do-reino ... 59

4.5.1 Análise microbiológica dos resíduos orgânicos ... 59

4.5.2 Características das propriedades químicas dos resíduos orgânicos e análise química do solo... 63

4.5.3 Efeito da incorporação de matéria orgânica no controle da fusariose em pimenta-do-reino ... 65

5 CONCLUSÕES ... 73

6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 74

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1. INTRODUÇÃO

A pimenta-do-reino (Piper nigrum L.), cultura de exploração milenar, é uma das

especiarias mais importante e consumida mundialmente. Amplamente utilizada como condimento no preparo e em processamento de alimentos (PRABHAKARAN NAIR, 2011).

No Brasil, a produção de pimenta-do-reino vem crescendo fortemente, destacando-se no comércio agrícola nacional e internacional. Aproximadamente toda produção destinada ao mercado externo é comercializada na forma processada, enquanto para o mercado interno tanto

as formas processadas como “in natura” são importantes (CAVALCANTE, 2005; EMATER, 2013).

O Brasil está entre os maiores produtores e exportadores dessa commodity no mundo. Os estados do Pará, Espírito Santo e Bahia são responsáveis por aproximadamente 98,3% da produção nacional. Na região Nordeste do país, os maiores produtores da cultura são os estados Bahia, Alagoas, Maranhão, Paraíba, Rio Grande do Norte e Ceará. Em Alagoas, dados de 2016 indicam que a área colhida de pimenta-do-reino foi de 183 ha, com uma produção de 584 toneladas e um rendimento médio de 3.191 Kg.ha-1 (IBGE, 2016).

A produção de pimenta-do-reino, no Brasil, vem sendo comprometida e limitada, principalmente por problemas de fitossanidade que causam danos às lavouras e perdas na produção (DRUMOND NETO, 2012). O principal fator limitante no cultivo agrícola da cultura é a doença conhecida por fusariose (OLIVEIRA, 2012). Segundo Lourinho et al. (2014), a fusariose ou podridão-das-raízes é a principal doença da cultura, causada pelo fungo Fusarium solani f. sp. piperis, restrito ao Brasil e vem causando a redução de vida útil das pimenteiras

nas regiões produtoras. A doença destrói o sistema radicular, o que provoca sérios prejuízos econômicos (FISCHER et al., 2010; SWARUPA; RAVISHANKAR; REKAR, 2013). A produtividade das pimenteiras cultivadas no estado alagoano está sendo ameaçada pelo aparecimento da fusariose ou podridão-das-raízes nas áreas produtoras. Em março de 2005, foi detectado, no município de União dos Palmares, o primeiro relato de Fusarium solani f. sp. piperis em pimenta-do-reino cv. bragantina (CARNAÚBA et al., 2007).

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Os métodos que vem sendo empregados são pouco eficientes. Não há nenhum registro de fungicida recomendado para a fusariose em pimenta-do-reino no sistema de agrotóxicos fitossanitários (AGROFIT – MAPA). Nenhuma das cultivares de pimenta-do-reino existentes até o momento são resistentes ou tolerantes ao Fusarium solani f. sp. piperis. Segundo Rocha

Neto (2013), torna-se necessário adotar medidas preventivas e práticas culturais que possam reduzir a taxa de progresso da doença.

O controle alternativo com substâncias naturais já vem sendo estudado a alguns anos com o propósito de controlar fitopatógenos (SANTOS, 2015). O uso de óleos essenciais e extratos vegetais vêm apresentando resultados significativos e eficientes no controle de diversos fitopatógenos (SILVA et al., 2009). A ação fungitóxica pode ser decorrente da atividade antimicrobiana exercida diretamente contra o patógeno, retardando o crescimento micelial ou inibindo a esporulação e a germinação de esporos (VENTUROSO et al., 2011; GARCIA et al., 2012).

Um dos focos de estudo são os chamados metabólitos secundários produzidos pelas plantas, muitos dos quais não participam diretamente de seu desenvolvimento. Essas substâncias desempenham um papel fundamental nas suas interações de defesa contra predadores e patógenos. Muitos destes metabólitos secundários apresentam atividades biológicas e têm sido utilizados na indústria farmacêutica e agroquímica (ANDRADE, 2006; SOUZA JÚNIOR, et al., 2009).

A incorporação de cobertura morta também é uma outra alternativa de controle envolvida no manejo de doenças causadas por patógenos radiculares. Segundo Blok et al. (2000) a utilização de compostos orgânicos, constituem uma alternativa eficiente no controle de fitopatógenos veiculados pelo solo, uma vez que melhoram as características físico-químicas do solo, induzindo a supressividade dos fitopatógenos.

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2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Origem, características botânicas e importância econômica da cultura da pimenta-do-reino

A pimenta-do-reino, também conhecida como pimenta branca e preta é originária das florestas do sul da Índia, onde vem sendo cultivada por cerca de 6.000 anos.

No Brasil, a cultura foi introduzida pelos portugueses durante o período colonial, desde o século XVII. A exploração comercial da cultura foi a partir do ano de 1933 por imigrantes japoneses com a introdução da cultivar Kuching (Cingapura) no município de Tomé-Açu no estado do Pará (DUARTE, 1999; FARIA FILHO, 2002; CHU, 2006; DESER, 2008). A expansão da cultura para outras localidades da Amazônia e outros estados brasileiros fez com que ampliasse a área cultivada, tornando o Brasil autossuficiente na década de 1950 na produção de pimenta (EMBRAPA, 2013). De acordo com Homma (1998), nos anos 80 o país chegou a ser o maior produtor e exportador da especiaria do mundo. A alta expressividade de produção fez com que o país integrasse a IPC –Internacional Pepper Community, organização

intergovernamental de países produtores de pimenta, formado por Brasil, Índia, Indonésia, Malásia, Sri Lanka e Vietnã. Fundada em 1972, desempenha diversas funções voltadas a coordenação, as políticas de produção, exportação, controle de qualidade e ao uso do condimento (DRUMOND NETO, 2012).

É uma planta de clima tropical de espécie perene, arbustiva e trepadeira pertencente à família da Piperácea, que cresce aderida a tutores de madeiras ou troncos de árvores e apresenta frutos do tipo baga com inflorescências formadas nos ramos plagiotrópicos (DUARTE; ALBUQUERQUE, 2005) (Figura 1). A família Piperaceae compreende cerca de 1400 espécies distribuídas no mundo (SOLTIS et al., 1999). Arias et al. (2006) e Magevshi et al. (2011) afirmam que a família Piperaceae são representadas por quatro gêneros e cerca de 500 espécies no Brasil. Segundo Brito (2012), o gênero Piper é de maior relevância e valor econômico, pois tem como principal representante a pimenta-do-reino.

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Figura 1 - Planta de pimenta-do-reino cv. bragantina (A), tutor de madeira usado nos plantios (B) e planta em fase de frutificação (C).

Fonte: GOMES FILHO, J, 2016

A produção das pimenteiras em escala comercial se dá através da propagação vegetativa (CASTRO, 1979; DUARTE, 1999). O principal método utilizado de propagação da pimenta-do-reino é por estaquia (FACHINELO et al., 1995; PAIVA & GOMES, 1995; HARTMANN et al., 2011)

.

De acordo com Freire (2013), nos plantios comerciais de pimenta-do-reino as principais variedades recomendadas são: Cingapura, Bragantina e Guajarina. A variedade Bragantina, muito cultivada em Alagoas, apresenta folhas largas, cordiformes, espigas muito longas, flores 100% hermafroditas, o que favorece um bom enchimento das espigas com frutos graúdos, brotos novos dos ramos de crescimento na cor verde clara. Pode atingir três metros de altura e proporciona uma produção média de 3 kg/planta com rendimento médio em torno de 4,8 toneladas por hectare (SECUNDINO, 2012).

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pessoas. Além de divisas em torno de US$ 50 milhões por ano através das exportações (EMBRAPA, 2004).

Filgueiras et al. (2012), afirmam que no período de safra no estado do Pará a cultura da pimenta-do-reino gerou divisas de mais de 50 milhões de dólares ao ano e empregou cerca de 70 a 80 mil pessoas. Sendo uma das especiaria mais valorizadas do mundo a cultura apresenta grande valor econômico e alta expressão no mercado de exportação.

Em 2015 foram produzidos 374.500 toneladas de pimenta-do-reino em todo o mundo. Atualmente, o Vietnã é o maior produtor (125 mil toneladas), seguido de Brasil (54.031 toneladas), Indonésia, Índia, Malásia, Tailândia, Sri Lanka, China e outros (ALVES ,2015; IBGE, 2016). No ano de 2016, a exportação de pimenta-do-reino gerou uma receita de US$ 246.501.361 milhões para o agronegócio brasileiro (MDIC, 2016). Os principais países compradores são os Estados Unidos, Alemanha, França, Espanha, Holanda, México, Argentina, Vietnã (CAVALCANTE, 2005; LIMA et al., 2010).

No Brasil, as Regiões Norte e Sudeste possuem os maiores volumes de produção e as maiores áreas cultivadas, sendo que a Região Nordeste apresenta o maior rendimento agrícola, correspondendo a 2.400 Kg.ha-1. O estado do Pará é o maior produtor nacional de

pimenta-do-reino com 66,34% da produção brasileira, seguido do Espírito Santo com 23,6% e Bahia com 8,33%, responsável por cerca de 86,74% da produção do Nordeste. O estado de Alagoas, apesar de produzir apenas 11,26% da Região Nordeste possui um rendimento de 3.191 Kg.ha-1,

superando o rendimento agrícola nacional de 2.109 Kg.ha-1 (IBGE, 2016).

2.2 Doenças da Pimenta-do-reino

Dentre as doenças que atacam a cultura da pimenta-do-reino, as que causam os maiores danos econômicos para os produtores rurais são a fusariose ou podridão-das-raízes (Fusarium solani f. sp. piperis) e a murcha-amarela (Fusarium oxysporum). No entanto, há outras doenças

que provocam menores danos nas pimenteiras como a queima-do-fio (Koleroga noxia) e a

antracnose (Colletotrichum gloeosporioides) (TREMACOLDI, 2010). De acordo com Duarte

(1999), merecem atenção no cultivo de pimenta-do-reino a requeima de mudas (Phytophthora capsici Leonia); a galha das raízes (Meloidogyne incógnita (Kofoid & White) Chitwood e M. javanica (Treud) Chitwood); a rubelose (Corticium salmonicolor Berk & Broome); o mosaico

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Kuhn); a podridão preta dos frutos (Cephaleuros virescens Kunze); e a podridão das estacas

(Sclerotium rolfsii Sacc).

2.2.1 Fusariose ou podridão-das-raízes

A fusariose, conhecida pelos agricultores por podridão-das-raízes, podridão-do-pé e mal-de-mariquita, é uma das doenças mais prejudiciais à cultura da pimenta-do-reino (TRINDADE, POLTRONIERI,1997). Segundo Duarte; Albuquerque (1980); Ando et al.(1996); Benchimol et al., (2000) a fusariose é considerada a principal doença da cultura, de ocorrência restrita ao Brasil e conforme Albuquerque et al. (2001), no hemisfério oriental a doença fusariose não ocorre, devido as maiores dispersões e variações genéticas da espécie onde está localizada o centro de origem da pimenta-do-reino.

Na década de 1960, surgiram os primeiros relatos de plantas de pimenta-do-reino exibindo sintomas, onde foram observados amarelecimento e queda sucessiva de folhas e entrenós, resultando na morte de várias plantas no município de Tomé-Açu – PA (DUARTE, 1999). As condições favoráveis de umidade e temperatura contribuíram para a esporulação do fungo nas hastes das plantas mortas presas aos tutores, e em 1970, houve a infecção dos ramos das pimenteiras, aumentando ainda mais a gravidade da doença, devido principalmente à disseminação aérea dos esporos (ALBUQUERQUE; DUARTE, 1972a).

A doença vem causando elevadas perdas, em todas as áreas produtoras nos estados do Pará, Amazonas, Rondônia, Amapá, Paraíba, Maranhão, Bahia, Espírito Santo, Minas Gerais, Mato grosso e Alagoas. O ciclo produtivo de uma lavoura sadia é de 12 a 15 anos, como consequência da doença seu ciclo foi alterado, tornando-se mais curto, 5 a 6 anos (TREMACOLDI, 2014). De acordo com Carnaúba et al. (2007), a fusariose causa uma redução do período útil de exploração das pimenteiras para apenas quatro anos. A doença provoca redução de até 10% nas áreas cultivadas e ocasiona perdas de 10 milhões de dólares/ano (TREMACOLDI, 2010).De acordo com D’Addazio et al. (2016), a fusariose provoca graves danos a pimenta-do-reino, reduzindo a área cultivada e a produção em 3% anualmente.

Para Duarte (1999, p. 161):

(20)

A infecção da doença na planta de pimenta-do-reino pode iniciar pelas raízes e ramos. As raízes mais jovens e secundárias são as principais vias de penetração do patógeno e com o progresso da doença, o sistema radicular é reduzido e verifica-se a ausência de radicelas, levando a podridão da raiz. Este apodrecimento estende-se ao colo da planta até 30 cm acima do solo. Ao realizar o corte longitudinal no caule com 3 a 5 cm próximo do solo, observa-se o escurecimento dos vasos condutores (xilema e floema), que dependendo da intensidade ou agressividade do patógeno, pode ocorrer o secamento total e morte da planta. O escurecimento dos vasos condutores é devido a colonização por hifas e microconídios do patógeno, que causam a hipertrofia, hiperplasia do cambio, xilema e floema e a destruição de fibras de xilema e amiloplastos de células do parênquima (ORTIZ et al., 2014). À proporção que o fungo se desenvolve dentro do sistema vascular da planta, toxinas fúngicas são produzidas como naftoquinonas e ácido fusarico que dificultam a absorção e transporte de água (ROCHA et al., 2016).

Os sintomas reflexos são o amarelecimento das folhas e a clorose, resultando em folhagens esparsas e flácidas, como consequência, a queda das folhas prematuras e rompimento dos internódios. Duarte (1999) afirma que nos ramos, os primeiros sinais são o amarelecimento em plantas bem vigorosas com formação de lesões escuras que cobrem um ou mais nós distribuindo-se para outros ramos, causando a queima e secamento de alguns ramos, podendo alcançar até o sistema radicular. Na base do caule da planta há uma exsudação escura brilhante, indicando um estádio evoluído da fusariose (FUKUTOMI et al., 1981). Segundo Cavalcante (2005), o surgimento da exsudação escura brilhante na base do caule da planta faz com que a doença se espalhe rapidamente ocasionando a morte da planta no período de dois anos.

Ventura; Costa (2004) relata que com o progresso da doença, a planta sofre o secamento do ramo principal tanto para cima quanto para baixo, no entanto, a base da planta e o seu sistema radicular permanecem sadios.

O agente causal da fusariose ou podridão-das-raízes da pimenta-do-reino é o fungo

Fusarium solani f. sp. piperis forma anamórfica que pertence a ordem Tuberculariales e família Tuberculariaceae. O anamórfico produz três tipos de esporos, microconídios hialinos,

(21)

SUMMERELL, 2007). O fungo possui hifas septadas, hialinas com formação de longas fiálides (TREMACOLDI, 2010).

Na forma teleomórfica, a doença é causada por Nectria haematococca Berk & Br. f.

sp. piperis Albuq., um ascomiceto que pertence à ordem Hypocreales e a família Nectriaceae

(DUARTE, 1999). Segundo Albuquerque et al. (2001), a fase sexual foi identificada através de estudos de compatibilidade sexual de Fusarium solani f. sp. piperis. A fase sexual do fungo

ocorre raramente no meio ambiente, produz peritécios arredondados ou piriformes de forma isolada ou agregada, avermelhados, com superfície externa rugosa apresentando consistência gelatinosa. Na parte interna dos peritécios são formados os ascos, a qual comporta oito ascósporos bicelulados, sendo que cada célula dos ascósporos são uninucleadas e ambos os núcleos são geneticamente iguais, além de apresentar uma superfície estriada com uma pequena constrição à altura do septo central.

Umidade relativa elevada favorece a produção de conídios sobre os tecidos infectados das raízes e ramos. Duarte (1999) e Tremacoldi (2010), relatam que a disseminação e a multiplicação do patógeno são favorecidas em período chuvoso. Na época chuvosa as plantas não apresentam sintomas visíveis, no entanto, é neste período que ocorre as infecções do fungo nas raízes e nos ramos da parte aérea das pimenteiras-do-reino, exibindo-se os sintomas característicos da doença durante a estação seca (DUARTE, 1999). Duarte (1999), destaca que nas estações mais secas, o número de plantas com os sintomas da doença aumenta gradativamente. O excesso de umidade do solo, adubos nitrogenados e estresse hídrico propiciam a doença (CAVALCANTE, 2005). Algumas lavouras mais velhas constituem importantes focos de disseminação do patógeno, ocasionando infecções nas novas plantações. Conforme Scherm; Yang (1996), temperaturas do solo em torno de 15 ºC contribuem para sintomas em raízes, enquanto temperaturas de 22 a 24 ºC favorecem os sintomas de parte aérea. De acordo com Duarte et al. (2005), solos com problema de drenagem favorecem a doença, causando mais danos para as pimenteiras, principalmente em cultivos mal conduzidos. A fusariose tem seu início na área em pequenas reboleiras, que avançam podendo tornar o pimental inviável para a produção (VENTURA; COSTA, 2004).

A penetração do fungo no sistema radicular é favorecido pelas relações entre os fatores abióticos e bióticos. Em contato com as raízes da planta os esporos germinam, o micélio penetra diretamente nos tecidos da epiderme ou por ferimentos causados por M. incognita e por outros

(22)

ramos infectados ocorre pelo vento iniciando as infecções secundárias (ALBUQUERQUE, 1980). Nas épocas mais úmidas, nos tecidos apodrecidos da planta formam-se peritécios, que internamente formam os ascósporos, importantes na disseminação aérea do patógeno nas áreas de cultivo, além de formar massas esbranquiçadas de esporos nos tecidos mortos (DUARTE, 1999; VENTURA; COSTA, 2004). Na fase saprofítica são formados os macro e microconídios e clamidosporos, que são disseminados pelo vento e água. Os clamidósporos podem permanecerem por vários anos viáveis no solo, podendo iniciar as infecções no sistema radicular ao encontrar condições ambientais favoráveis. De acordo com Pfenning; Lima (2007), os clamidósporos, estruturas de resistências do patógeno formado em um ambiente adverso podem permanecer viáveis por mais de 20 anos.

Para que ocorram epidemias de fusariose em pimenta-do-reino é necessário a presença de fontes primárias de infecção. Observações de campo têm mostrado que a doença pode iniciar nos pimentais de três modos diferentes; a) nos pimentais novos, formados com estacas sadias e plantados bem distantes de pimentais doentes, a doença começa a surgir no sistema radicular após 12 a 15 anos, em pimenteiras dispersas pela plantação e com o aumento da população o patógeno pode se disseminar pela parte aérea; b) nas plantações novas, instaladas em áreas isoladas, porém formadas com estacas retiradas de pimenteiras infectadas, a doença pode adquirir caráter epidêmico, quatro a cinco anos após o plantio, sugerindo que estruturas do fungo em estado latente nos tecidos de pimenteiras jovens tornam-se fontes primárias de inóculo, ao encontrarem condições favoráveis de desenvolvimento; e, c) epidemias precoces podem também se estabelecer em pimentais originados de estacas sadias, porém instalados próximos a culturas de pimenta-do-reino infectadas pela fusariose aérea (DUARTE, 1999, p. 168).

2.3 Manejo da fusariose

O controle da doença em condições de campo é o principal problema enfrentado pelos produtores de pimenta-do-reino em todas as regiões produtoras do estado brasileiro. De acordo com Michereff et al. (2005 apud Santos, 2010), patógenos que vivem em ambiente subterrâneo são altamente adaptados em associação com o hospedeiro, tornando o controle muito difícil.

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ou carbendazin (1 g/L por 30 minutos); nas capinas e outros tratos culturais deve-se evitar ferimentos nas raízes próximas as camadas superficiais do solo e manter a cobertura vegetal nas entrelinhas (TRINDADE; POLTRONIERI, 1997; VENTURA; COSTA, 2004; TREMACOLDI, 2010). Para o controle da fusariose na parte aérea é necessário realizar inspeções periódicas na lavoura, podar as plantas com sintomas da doença e em seguida fazer aplicação com fungicida. No entanto, se o índice de infecção atingir 15%, o controle não é mais eficiente, neste caso o mais recomendado é arrancar e queimar as plantas doentes, para reduzir as perdas causadas pela doença (VENTURA; COSTA, 2004).

Em condições de campo, o controle da doença é limitado, pois não há cultivar resistente e nem um fungicida efetivo ou oficialmente aprovado no Brasil (D’ADDAZIO et al.,

2016). Conforme esses autores, vários estudos in vitro vem sendo realizados para identificar produtos que possam controlar o fungo. As medidas recomendadas para o controle da fusariose mais usadas na pipericultura vem se mostrando onerosas ou pouco eficientes. Daí a necessidade de novos métodos de controle, entre quais o controle com produtos naturais e aplicação de resíduos orgânicos.

2.3.1 Uso de óleos essenciais e extratos vegetais no controle de doenças de plantas

O uso de produtos químicos na agricultura para o controle de doenças de plantas, pragas agrícolas, plantas daninhas vem sendo questionado pela sociedade, devido aos diversos problemas gerados para a saúde humana e ao meio ambiente, pelo uso de doses excessivas ou de forma inadequada dos produto químicos (GURJAR et al., 2012). Segundo Morandi; Bettiol (2008), as consequências das práticas agrícolas no ambiente e a contaminação com produtos químicos vem mudando o cenário da produção agrícola, resultando na presença de segmentos de mercado que visam à aquisição de produtos diferenciados, tais como o desenvolvimento de sistemas de cultivos mais sustentáveis que vem estimulando a busca por novas medidas de proteção das plantas contra as doenças (FERREIRA, 2013).

(24)

Esses novos métodos alternativos para a proteção de plantas tem ganhado atenção mundial e os principais focos das pesquisas estão no estudo das propriedades químicas que essas plantas apresentam em sua composição com potencial fungicida ou fungistático que as tornam eficientes no controle de fitopatógenos (BARROS et al., 2013; TOMAZONI et al., 2013; SANTOS, 2014).

A ação fungitóxica dos produtos naturais tanto atuam diretamente no patógeno, causando desaceleramento do crescimento micelial, reduzindo a esporulação e a germinação de esporos, quanto pela indução de fitoalexinas indicando a presença de compostos de características elicitores (CARVALHO, 2010; VENTUROSO et al., 2011; GARCIA et al., 2012). Umas das vantagens de se utilizar os produtos naturais na agricultura é devido a rápida degradação no ambiente e sua baixa toxidez (GHINI; KIMATI, 2000). Conforme Amorim et al., (2011), os extratos vegetais e os óleos essenciais podem minimizar o surgimento de microrganismos resistentes e a contaminação do meio ambiente.

Segundo Amandioha (2000) e Morandi; Bettiol (2009), os extratos vegetais são fontes inesgotáveis de moléculas, muitas delas desconhecidas, servindo de modelo para síntese química, com geração de produtos de baixo custo, de fácil aquisição e uma alternativa para países em desenvolvimento, onde os fungicidas sintéticos são escassos e representam um alto custo aos produtores. De acordo com Diniz et al. (2006), os extratos apresentam em sua composição várias moléculas complexas, destacando-se compostos fenólicos, terpenóides e alcaloides que são sintetizados pelo metabolismo secundários das plantas, importantes para as relações ecológicas. Os extratos de plantas apresentam atividade elicitoras, causando reações de defesa da planta contra fitopatógenos (TALAMINI; STANDINIK, 2004). As reações induz a resistência ao patógeno nas plantas hospedeiras (LINDSEY; STADEN, 2004). Standinik; Maraschin (2004) relatam que os extratos podem apresentar ação direta, já que possuem substâncias tóxicas para os fungos, e apresentam um grande potencial para a produção de fungicidas naturais menos agressivo ao meio ambiente.

(25)

metabolismo secundário das plantas, desempenhando um papel fundamental na proteção de plantas com ação inseticida, bactericida e fungicida.

Esses efeitos de proteção aos microrganismos, deve-se as suas propriedades químicas presentes em suas moléculas, e sua característica lipofílica, aliada com a hidrofobicidade que permite a interação entre o óleo e os lipídeos da membrana celular e interferência na permeabilidade, provocando alterações nas estruturas dos microrganismos (BAKKALI et al., 2008; COSTA et al., 2011). O óleo essencial em contato com o fungo promove a inibição de seu crescimento micelial, muda a composição da parede celular, causando a destruição de membranas plasmáticas e uma desorganização na estrutura mitocondrial do patógeno, entre outras características (KSHORE; PANDE, 2007). Zambonelli et al. (1996); Costa et al. (2011) e Dos santos et al. (2013) afirmam que a ação antifúngica dos óleos essenciais testados, revelaram que ocorre a penetração de quitina nas paredes das hifas, prejudicando a camada de lipoproteína da membrana citoplasmática, ocasionando a saída do citoplasma e o murchamento de hifas.

Diversas pesquisas vêm sendo realizadas com a utilização de óleos essenciais no controle de vários fitopatógenos na agricultura e vem apresentando resultados promissores, sendo por ação antimicrobiana como a indução de resistência (FRANCO; BETTIOL, 2000; BENATO et al., 2002; PEREIRA et al., 2012; AMINI et al., 2012; MAIA et al., 2014).

Lustosa et al. (2011), revelaram que os óleos essenciais de copaíba e eucalipto apresentam atividades fungitóxicas contra diversos fitopatógenos. O principal componente do óleo de eucalipto é o monoterpeno 1,8-cineol ou eucaliptol, outro componente é a piperitona que é utilizada para síntese de timol e mentol, que ambos são usados como flavorizante como aditivos em preparações medicinais e na síntese de fungicidas (VITURRO et al., 2003; FIGUEIREDO et al., 2013). De acordo com Bonaldo (2007), a atividade fungitóxica do óleo de eucalipto citriodora controlou os fungos S. rolfsii, Phytophthora sp., R. solani e A. alternata

e também promoveu a ativação dos mecanismos naturais da planta de sorgo.

(26)

O nim (Azadirachta indica A. Juss.) é uma planta pertencente à família Meliaceae,

conhecido pelos indianos como uma planta medicinal que é amplamente usada no controle de insetos e fungos. Conforme Martinez (2002), a ação fungitóxica do nim contra fitopatógenos é devido a substância azadiractina formada por um complexo tetranotriterpenóides, encontrados principalmente nas sementes, sendo solúvel em água e eliminado no ambiente em até 20 dias. De acordo com Medice et al. (2007) e Dias-Arieira et al. (2010), o óleo de nim promove o controle de alguns fitopatógenos devido ao seu efeito fungistático ou inibitório.

O alho (Allium sativum L.) é uma planta pertencente à família Liliaceae, espécie

amplamente estudada e utilizada no controle de fitopatógenos. Segundo Vieira (1992) e Wu et al. (1996) o alho é composto por diversas substâncias, composto pelos principais princípios ativos alicina, aliina, alinase, alitiamina, sulfeto de alilo, alilglucósio, óxido dialila dissulfeto, alinase, alitiamina, sulfuretos, hormônios, resinas e os compostos isoticiânico, inulina, nicotinamina e galantamina. A capacidade fungitóxica do extrato e do óleo de alho é devido ao componente alicina e também pelo odor característico do alho. Conforme Amagase et al. (2001), por apresentar alta instabilidade, a ação antimicrobiana do alho é questionada em trabalhos in vivo. A ação fungitóxica da alicina são observados em diversas pesquisas a vários

fungos fitopatogênicos (SOVOVA, 2002; PARK et al., 2005; SLUSARENKO; PATEL; PORTZ, 2008; VENTUROSO, 2009; LEITE et al., 2012).

De acordo com Torres et al. (2005), os compostos fenólicos encontrados no endosperma líquido do coqueiro (Cocos nicifera L.) são metabólitos secundários que

apresentam efeitos antimicrobiano a vários microrganismos. No entanto, existe poucos trabalhos na literatura relatando o uso de óleo de coco no controle de fungos fitopatogênicos. Segundo Sousa et al. (2012), o óleo de coco na concentração de 1% inibiu o crescimento micelial do fungo Colletrotrichum gloesporioides em 73,67% na cultura da pimenta de cheiro

(Capsicum chinense). O óleo de coco inibiu 50% do crescimento micelial de C. gloesporioides

na cultura do maracujá, apresentando potencial fungitóxico sobre o patógeno (DE ABREU et al., 2014).

Segundo Freire (2006), o óleo essencial de hortelã-pimenta (Mentha piperita L.)

(27)

niger, A. glaucus, Fusarium oxysporum, F. semitectum, Colletotrichum musae, C. gloeosporioides (FREIRE, 2006).

O extrato de coentro (Coriandrum sativum L.) vem sendo estudado devido à presença de princípio ativo com propriedade antifúngicas. De acordo com Bizzo et al. (2009) e Rentschler (2014), o óleo das sementes de coentro é formada por várias substâncias, sendo a principal o D-linalol e seguido em menores proporções de acetato de geranilo, geraniol, borneol, alcanfor, alfa-terpineol, óxido de linaeol e nerol. Esses compostos possuem ação fungitóxica a vários fungos, sendo eficiente na inibição do crescimento micelial de Cladosporium cucumerinumEllis & Arthur e Fusarium culmorum (Wm. G. Smith) Sacc. (DELGADO, 1993).

O extrato de melão-de-são caetano (Mormodica charantia L.), vem apresentando

resultados eficientes no controle de doenças de plantas causados por fitopatógenos. Segundo Torres et al. (2002), o extrato de M. charantia é composto por várias substâncias bioativas,

como alcaloides, flavonoides, saponinas, glicosídeos, constituintes fenólicos, ácidos livres, que possuem ação antifúngica, inseticida e bactericida dentre outras atividades. Ação antifúngica do extrato de melão-de-são caetano é demonstrado em vários trabalhos. Celoto et al. (2011), utilizando extrato aquoso e metanólico de M. charantia, obteve um percentual de inibição de

80% das lesões da antracnose nos frutos de bananas. Feitosa et al. (2008), observaram que o melão-de-são caetano apresentou resultados positivos no controle de Clostridium sp. patógeno

de pós-colheita. Conforme Medeiros et al. (2013), o extrato de melão-de-são caetano reduziu a incidência de fungos dos gêneros Fusarium sp., Cladosporium sp., Curvularia sp. e Alternaria sp., em sementes de Pterogyne nitens. O extrato de melão-de-são caetano obteve eficiência no

controle Fusarium sp. e Cladosporium sp. em sementes de sabiá (Mimosa caesalpiniaefolia

Benth.) (LEITE et al., 2011).

A mamona (Ricinus communis L.) pertencente à família da Euphorbiaceae, é uma

planta oleaginosa arbustiva. A composição química do óleo e do extrato vegetal, é composto principalmente por ricina, molécula mais tóxica e mais estudada. A atividade fungitóxica do extrato aquoso de folhas de mamona é evidenciado em alguns trabalhos, apresentando efeito inibitório contra vários patógenos foliares quanto de solos (RIBEIRO; BEDENDO, 1999; CASTRO et al., 2005; CASTRO et al., 2006; SILVEIRA, 2006; SILVA JÚNIOR et al., 2007; SILVA JÚNIOR et al., 2009).

A mandioca (Manihot esculenta Crantz) é uma planta perene, arbustiva, pertencente à

(28)

animal. De acordo com Nassar et al. (2007), as folhas de mandioca apresentam elevada

concentração de β-caroteno, proteínas e minerais. As folhas da planta também possuem algumas substancias tóxicas como cianeto, compostos fenólicos, nitrato, ácido oxálico, saponinas, hemaglutinina e inibidores de tripsina, que dependendo de sua concentração pode provocar efeitos tóxicos (MELO et al., 2007). Segundo Ponte (1999), o cianeto possui atividades nematicidas, inseticidas, enquanto os outros compostos exercem atividades antifúngicas. Vale ressaltar que trabalhos com extratos de folhas de mandioca no controle de fungos fitopatogênicos são escassos na literatura.

O extrato de pimenta-do-reino (Piper nigrum L.) vem sendo utilizado no controle de

fitopatógenos e de insetos pragas na agricultura devido a vários compostos químicos, destacando-se a isobutilamida, piperidina e pirrolidina. Além de lignanas, neolignanas e seus precursores, flavonóides, kawalactonas, butenólidos e epóxidos de ciclohexano, sendo a piperina a principal substância estudada por suas propriedades inseticidas e fungicidas (SENGUPTA; RAY, 1987). A atividade antifúngica do extrato de Piper nigrum no controle de

doença de plantas foram comprovados em algumas espécies de fungos: Barros et al. (2013), verificaram que o extrato de pimenta-do-reino teve eficácia nas concentrações a partir de 10%, na concentração de 30% proporcionou um percentual de 42% de controle de Fusarium verticillioides e 32% de Acremonium sp. Barros (2015), afirma que o extrato aquoso de

pimenta-do-reino foi eficiente no controle de Cladosporium cladosporioides, Bipolaris sorokiniana e Fusarium graminearum na cultura do trigo. Dias et al. (2016) obteve um

percentual de 43,25% de controle de Lasiodiplodia theobromae in vitro.

2.3.2 Resíduos orgânicos no controle de doenças radiculares

A utilização de fontes de matéria orgânica surge como uma alternativa no manejo aos principais fungos fitopatogênicos habitantes do solo.

(29)

vegetais ao solo, favorece o aumento da flora microbiana, atividade antagônica aos microrganismos fitopatogênicos, contribuindo para a supressividade do solo e pode melhorar a resistência das plantas as doenças. Os microrganismos presentes no solo afetam as propriedades química, física e biológica e contribui para diversas funções metabólicas nas fases de desenvolvimento das plantas (GREEN et al., 2006).

Para Blok et al. (2000), novos métodos como a adição de matéria orgânica se constitui uma alternativa viável para o controle de doenças radiculares, que através da supressividade aos fitopatógenos vem controlando uma gama de fungos de solos e se tornando uma das práticas muito utilizada na agricultura.

A condição de supressividade é determinadas por vários fatores bióticos e abióticos. Entre os fatores bióticos destacam-se os microrganismos (fungos, bactérias,), microartrópodes, minhocas, etc. Características físico-químicas do solo, tais como textura do solo, ponto hidrogeniônico (pH), tipo de matéria orgânica, relação carbono/nitrogênio (C/N), nutrientes, umidade, densidade, capacidade de retenção de água, dentre outras, destacam-se entre os fatores abióticos, que pode atuar de forma direta ou indireta sobre os patógenos radiculares, interferindo no seu desenvolvimento a curto e a longo prazo (HORNBY, 1983; BETTIOL; GHINI, 2005).

Segundo Baker; Cook (1974), com o ambiente supressivo no solo a população de patógenos tende a não se estabelecer ou se estabelecer causa a doença, no entanto, essa doença tende a sofrer um declínio no decorrer do tempo. De acordo com Ghini et al. (2001), esse ambiente supressivo causa a supressão da doença devido principalmente a fatores bióticos e abióticos, mesmo havendo a inter-relação entre o hospedeiro suscetível e o patógeno.

(30)

Conforme Café Filho; Lobo Junior (2000), para obter maiores chances de controle das doenças é necessário observar os seguintes fatores como: a complexidade do solo, as estratégias de sobrevivência dos fungos neste sistema, a dinâmica das populações dos microrganismos e a epidemiologia da doença em habitat causal. De acordo com Pereira et al. (1996), a utilização de resíduos orgânicos na supressão da doença e na redução dos níveis populacionais dos fitopatógenos está diretamente relacionado com suas ações e com as interações existentes entre solo-patógeno-hospedeiro, aliados também as dinâmicas associadas a composição físico-química e biológica de cada resíduo orgânico. A redução das fontes de inóculo que estão presentes na rizosfera é devido aos mecanismos de ação atribuídos por antibiose, hiperparasitismo, predação, dentre outros existentes entre os microrganismos, destacando-se os fungos fitopatogênicos e seus antagonistas (HARAN et al., 1996; GHINI et al, 2001).

Para Nascimento Júnior (2015, p. 26):

Para utilização de resíduos orgânicos no controle de doenças faz-se necessário realizar bioensaios in vitro para observação de algumas características relacionadas com condições específicas que proporcionem estímulo ou inibição em um ambiente controlado. A natureza dessa condição pode ser físico-químico ou biológica, que podem variar em função dos meios de cultura, luminosidade, extratos adicionados ao meio, antagonistas e competidores interferindo direto ou indiretamente sobre o patógeno, principalmente no seu crescimento micelial e na produção de esporos.

A eficiência dos resíduos orgânicos no controle de doenças radiculares, vem sendo comprovada por diversos trabalhos, tornando uma alternativa de manejo viável e de baixo custo para os produtores rurais: Veras (2006) afirma que a casca de mandioca na dosagem de 100 g.Kg-1 com uma relação C/N de 9:1 e de nim na concentração de 20 g.Kg-1 proporcionou uma

maior supressividade da doença causada por Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum em

quiabeiro. Veras et al. (2007), avaliaram que a incorporação de bagaço de coco babaçu ao solo na concentração de 20 g.Kg-1, proporcionou a supressividade da fusariose na cultura do quiabo,

devido aos altos níveis nutricionais e as atividades dos microrganismos. Ferreira et al. (2009), verificaram que a incorporação de nim na concentração de 20 g.Kg-1 no solo, apresentou

eficiência no controle da fusariose em maracujá amarelo, Em tomateiro, Wong et al. (2011) verificaram que a incorporação de folhas de mandioca na concentração de 25 g.Kg-1 com uma

relação C/N de 21:1, possibilitou o controle da murcha-de-fusário, através da liberação dos compostos orgânicos voláteis oriundos da decomposição da mandioca. Ferreira et al. (2015), estudando a fusariose do maracujazeiro amarelo confirmaram que a incorporação de resíduos orgânicos de bagaço da casca de coco babaçu (80 g.Kg-1) e a casca de mandioca (60 g.Kg-1)

(31)

Em maracujazeiro amarelo, Ferreira (2015) avaliando diferentes resíduos orgânicos, entre eles as folhas de eucalipto nas concentrações de 0-20-40-60-80-100 g.Kg-1, verificou que

(32)

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Local de execução dos experimentos

Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Fitopatologia e em casa de vegetação (Telado) no Centro de Ciências Agrárias (CECA) da Universidade Federal de Alagoas (UFAL) – Campus Delza Gitaí, em Rio Largo - AL, durante o período de Junho de 2016 a Junho de 2017.

3.2 Obtenção e preservação do isolado

O isolado de Fusarium solani utilizado nos experimentos foi obtido, a partir de plantas

de pimenta-do-reino com sintomas característicos da fusariose, coletada em uma unidade produtora de pimenta-do-reino, localizada no município de Atalaia em fevereiro de 2016.

Realizou-se o isolamento do microrganismo, através da retirada de pequenos cortes na área de transição entre o tecido sadio e doente no colo e na raiz da planta, que foram desinfestados em álcool 70% por 30 segundos, hipoclorito de sódio 2% por 1 min e lavados em água destilada esterilizada (ADE), logo após secos em papel toalha autoclavado, colocados em placas de Petri contendo meio de cultura BDA (Batata – 200 g; Dextrose – 20 g; Ágar – 18 g e água destilada – 1000 mL) e incubados a temperatura ambiente, até o crescimento do fungo. Depois de sete dias, constatado o crescimento da colônia fúngica, foram retirados discos de micélio (5 mm) e transferidos para outa placa de Petri em meio BDA, para obter a cultura pura. Em seguida, o isolado foi preservado pelo método Castellani em temperatura ambiente.

3.3 Teste de patogenicidade e reisolamento do microrganismo

O teste de patogenicidade do isolado foi realizado em mudas de pimenta-do-reino com quatro meses de idade através de dois métodos de inoculação: deposição de disco de inóculo sobre o caule da planta e por suspensão de inóculo.

(33)

foi colocado uma fita plástica transparente. A testemunha recebeu apenas disco de BDA sem o fungo. As mudas de pimenta-do-reino inoculadas com o patógeno foram submetidas a câmara úmida por 48 h.

Figura 2 - Etapas do procedimento do teste de patogenicidade em muda de pimenta-do-reino. Corte no caule da planta (A); disco de micélio do patógeno com 5 mm de diâmetro (B); inserção do disco no caule da planta (C).

Fonte: GOMES FILHO, J, 2016

No segundo método, o ferimento foi realizado através de uma raspagem superficial nas raízes das plantas com o auxílio de um estilete. Em seguida, foram adicionados 20 mL da suspensão de conídios (1 x 106 con.mL-1) em cada planta (Figura 3).

(34)

Figura 3 - Teste de patogenicidade pelo método ferimento das raízes. Ferimento no sistema radicular da planta (A); Deposição de 20 mL da solução de conídios na planta (B).

Fonte: GOMES FILHO, J, 2016

3.4 Identificação do patógeno

3.4.1 Caracterização morfológica

A partir da cultura pura foi realizado a identificação através de microculturas, de acordo com a metodologia proposta por MENEZES; ASSIS (2004). Após sete dias, foram feitas observações em lâminas para identificar as estruturas dos isolados.

A identificação foi realizada com base nas características morfológicas em microscópio óptico. As medições das estruturas propagativas foram realizadas através de imagens capturadas por câmera digital (Olympus IX2-SLP) acoplada ao microscópio óptico com aumento de 400x, projetada em monitor de computador, através do software Cellsenses Standard (SAMSUNG SDC-415®). Foram efetuadas 50 medições de cada tipo de estrutura produzida.

3.4.2 Caracterização molecular

(35)

As sequências obtidas foram analisadas com o algoritmo BLASTn (ALTSCHUL et al.,

1990) e o banco de dados não-redundantes GenBank.

3.5 Manejo da doença

3.5.1 Obtenção das mudas, extratos vegetais e óleos essenciais

As mudas de pimenta-do-reino foram adquiridas na propriedade Terra & Água Fidelis e Nonô - Consult. Agroambiental LTDA, localizada no município de Pilar - AL.

Os produtos vegetais foram selecionados e adquiridos em diferentes localidades: as folhas de melão-de-são caetano, mamona e mandioca foram coletadas no CECA/UFAL. As folhas de pimenta-do-reino foram coletadas na unidade produtora (Atalaia-AL) e as folhas de coentro foram adquiridas na feira municipal.

Para preparar os extratos brutos aquosos (EBA), todos os materiais vegetais coletados foram secos em estufa a 55 ºC por quatro dias até atingir a massa constante. Após a secagem foram triturados em moinho, para obter o pó ou pequenas frações dos fragmentos das folhas dos vegetais. A proporção 1:9 (peso/volume) foi usada para obtenção do EB, colocando-se 20 g do pó dos extratos vegetais para cada 180 mL de água destilada esterilizada (ADE), em uma temperatura variando de 55 a 60 ºC por 3 min, logo em seguida o líquido foi filtrado em gaze tripla esterilizada e levados para a câmara de fluxo laminar, permanecendo por 1 hora na U.V, sendo usados imediatamente nos experimentos, de acordo com a metodologia proposta por SILVA (2016).

Os óleos essenciais de eucalipto, copaíba, hortelã e alho foram adquiridos de forma comercial, produzido por ERVA DOCE & DOCE ERVA (Amorim Flora, Maceió – AL, Brasil). O óleo de nim foi adquirido de forma comercial, produzido por Vitaplan (NUTRIPLAST Ind. e Com. Ltda., Santa Catarina - SC). O óleo de coco foi adquirido também de forma comercial, produzido pela empresa COPRA (Copra Indústria Alimentícia Ltda., Maceió - AL).

3.5.2 Obtenção dos resíduos orgânicos vegetais

(36)

eucalipto, as cascas de coco e as folhas de pimenta-do-reino em Atalaia –AL e as folhas de nim em Rio Largo (CECA/UFAL).

Todos os materiais vegetais foram secos em estufa de ventilação forçada a 65±2 ºC por 72-96 h, logo após a secagem foram passados no triturador forrageiro e armazenados em sacolas plásticas em local seco e arejado.

3.5.3 Efeito de extratos vegetais e óleos essenciais sobre o crescimento micelial de Fusarium

solani

Foram realizados dois experimentos, um com extratos vegetais e outro com óleos essenciais. Para os extratos vegetais, foram testados folhas de pimenta-do-reino, mandioca, mamona, coentro e melão-de-são caetano, nas concentrações de 5, 10, 15 e 20% (v/v) e mais o fungicida (Carbendazim) na dosagem recomendada (0,2 g/mL). A testemunha foi constituída apenas pela inoculação do disco de inóculo em placas com meio BDA. O extrato bruto aquoso (EBA) de cada material vegetal foi misturado ao meio de cultura BDA fundente com aproximadamente 45 ºC, em seguida vertidos em placas de Petri (90 mm de diâmetro). Após essa etapa, no centro das placas foram depositados discos de micélio do fitopatógeno (5 mm) com 10 dias de idade, seguida da incubação a temperatura ambiente. No período de onze dias, em que a testemunha atingiu toda placa, foi avaliado o crescimento micelial, medindo-se diariamente em dois sentidos diametralmente opostos com o auxílio de um paquímetro digital de fibra de carbono (Western® 6” 150 mm).

O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial (5 x 4) + 2, representado por cinco extratos bruto aquoso (EBA) e quatro concentrações, totalizando 22 tratamentos com 6 repetições, sendo que cada repetição foi constituída por uma placa de Petri.

No experimento com óleos essenciais, foram utilizados óleos de nim, eucalipto, hortelã, copaíba, alho e coco, nas dosagens de 25, 50, 75, 100 µ L.mL-1 mais o fungicida

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Os dados originais dos dois experimentos foram submetidos a análise de variância e de regressão e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. O programa estatístico usado nas análises foi o ASSISTAT versão 7.7 (SILVA, 2016).

Nos dois experimentos tanto os extratos vegetais como os óleos essenciais foram avaliados o crescimento micelial, para determinar a porcentagem de inibição do crescimento micelial (PIC%), utilizando a fórmula proposta por Edginton et al. (1971), (Eq. 1):

(Eq. 1)

O modo de ação dos produtos testados foi avaliado através da transferência dos discos de inóculo, que não apresentaram crescimento micelial, para placas de Petri contendo BDA, sem a presença do agente inibidor e incubadas a temperatura ambiente. Após 120 h foi avaliado quanto a presença ou não de crescimento micelial do fungo.

3.5.4 Efeito de extratos vegetais e óleos essenciais sobre o controle da fusariose em mudas de pimenta-do-reino

O experimento foi realizado em casa de vegetação, utilizando-se mudas de pimenta-do-reino com seis meses de idade a partir dos melhores resultados dos tratamentos “in vitro

(Figura 4). As mudas foram transplantadas para vasos com capacidade de 1 L, contendo solo mais o substrato na proporção 1:4 (v/v), previamente autoclavado (1 atm, 120 ºC por 2 h) e inoculadas com o patógeno, através da técnica de deposição de disco de micélio (5 mm) em ferimentos realizados com um pequeno corte transversal, no caule das mudas, com o auxílio de um bisturi. Dez dias após a inoculação, as mudas foram tratadas em intervalos de oito dias com cinco aplicações dos produtos (extratos vegetais de folhas melão-de-são caetano e mandioca nas concentrações de 10 e 15% e óleos essenciais de nim e hortelã nas concentrações de 50 e 75 µL.mL-1). Foram utilizados 20 mL por planta, sendo adicionados 0,1 mL do espalhante

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5A). A testemunha recebeu apenas discos de micélio do patógeno. Para o tratamento das mudas com o fungicida (Carbendazim 0,2 g/100 mL) foi feito um corte vertical no colo da planta, aplicando-se o produto em forma de consistência pastosa com o auxílio de um pincel (Figura 5 B), de acordo com a metodologia proposta por SANTOS (2015).

Figura 4 - Vista geral do experimento sobre o efeito dos extratos vegetais e óleos essenciais no controle da fusariose.

Fonte: GOMES FILHO, J, 2016

Figura 5 - Mudas de pimenta-do-reino tratadas com extratos vegetais e óleos essenciais (A); Aplicação do fungicida no colo da planta (B).

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A avaliação do experimento foi realizada aos 7, 14, 21, 28 e 42 dias após as aplicações dos produtos, determinando-se a porcentagem de plantas infectadas.

O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado com dez tratamentos e cinco repetições, totalizando 50 parcelas.

Os dados foram submetidos a análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. As análises foram realizadas com o auxílio do programa estatístico ASSISTAT Versão 7.7 (SILVA, 2016).

3.5.5 Análise microbiológica e química dos resíduos orgânicos e análise do solo

A população microbiana de bactérias e fungos totais presente em cada resíduo orgânico foi determinada. A contagem de bactérias totais foi realizada de acordo com Nakasone et al. (1999) com alterações: verteu-se 100 µL dos extratos aquoso na concentração de 10% em placas de Petri contendo meio de cultura BDA e espalhou-se com o auxílio de alça Drigalski. Para a determinação de fungos totais, foram adicionado 0,5 g de cada resíduo orgânico no tubo de ensaio com 9,5 mL de água destilada esterilizada (ADE) sendo homogeneizado, obtendo-se diluições seriadas até (1 x 10-4 e 1 x 10-5). Em seguida foi adicionado 100 µL de cada diluição

sobre placas de Petri contendo meio BDA com adição do antibiótico ampicilina. As avaliações foram realizadas através da contagem das colônias de bactérias totais após 24 h, e para os fungos totais foram realizadas as identificações e contagem das colônias fúngicas com 72 h após a montagem dos experimentos.

O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado com cinco tratamentos e cinco repetições por tratamento correspondente por cada resíduo, sendo que as testemunhas foram utilizadas apenas água destilada esterilizada (ADE) sobre o meio de cultura. Foram avaliados as médias e as frequências dos resultados.

Para a análise química dos resíduos orgânicos, amostras de cada resíduo (10g) foram secas em estufa de ventilação forçada a 65±2 ºC por 96 h, logo após passadas em moinho e acondicionados em sacolas plásticas e enviadas à empresa Central Analítica (Maceió - AL), onde foi determinados a relação C/N, macro e micronutrientes. Também foi realizado a análise

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3.5.6 Efeito da incorporação de matéria orgânica no controle da fusariose em pimenta-do-reino

Os resíduos orgânicos utilizados foram casca de coco (CC), casca de mandioca (CM), folhas de nim (FN), folhas de eucalipto (FE) e folhas de pimenta-do-reino (FP) nas concentrações de 25, 50, 75 e 100 g.Kg-1 de solo. Os resíduos orgânicos foram incorporados a

solo autoclavado e colocados em vasos (1 L) (Figura 6). Trinta dias após as mudas de pimenta-do-reino com seis meses de idade foram transplantadas para os vasos e inoculadas, através da deposição de uma suspensão de inóculo de Fusarium solani (1,8 x 106 con.mL-1) na proporção

de 50 mL/vaso, nas raízes feridas (raspagem superficial nas raízes) com o auxílio de um bisturi A testemunha foi inoculada com o patógeno, sendo transplantada em solo autoclavado, sem a presença de resíduos. O tratamento químico usado foi com o fungicida (Carbendazim) na dosagem recomenda de 0,2 g/100 mL, sendo as plantas pulverizadas com a solução fungicida.

O delineamento utilizado foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial (5 x 4) +2, representado por cinco resíduos orgânicos e quatro concentrações, totalizando 22 tratamentos com quatro repetições (Figura 7).

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Figura 6 - Incorporação dos resíduos orgânicos ao solo (A); vasos com os resíduos orgânicos incorporados (B).

Fonte: GOMES FILHO, J, 2017

Figura 7 - Experimento “in vivo” com resíduos orgânicos no controle da fusariose (Fusarium solani).

Fonte: GOMES FILHO, J, 2017

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Figura 8 - Sintomas internos da fusariose aos 90 dias. Sistema radicular da planta (A); Corte longitudinal no sistema radicular (B) e no caule da planta (C); Corte transversal no caule (D) e no sistema radicular (E).

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