Avaliação dos efeitos anticancerígenos dos 1,2,3-triazóis derivados do núcleo 1,4-naftoquinona em linhagens leucêmicas humanas

3
5
131
2 years ago
Preview
Full text
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SINTETICOS BIOATIVOS AVALIAÇÃO DOS EFEITOS ANTICANCERÍGENOS DOS 1,2,3TRIAZÓIS DERIVADOS DO NÚCLEO 1,4-NAFTOQUINONA EM LINHAGENS LEUCÊMICAS HUMANAS TANGBADIOA HERVÉ COULIDIATI JOÃO PESSOA-PB 2014 TANGBADIOA HERVÉ COULIDIATI AVALIAÇÃO DOS EFEITOS ANTICANCERÍGENOS DOS 1,2,3TRIAZÓIS DERIVADOS DO NÚCLEO 1,4-NAFTOQUINONA EM LINHAGENS LEUCÊMICAS HUMANAS Tese de doutorado apresentada ao programa Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do Centro de Ciências da Saúde, da Universidade Federal da Paraíba para obtenção do grau de Doutor em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos. Área de Concentração: Farmacologia Orientador: Prof. Dr. Demétrius Antonio Machado de Araújo Co-orientador: Prof. Dr. Eduardo de Jesus Oliveira JOÃO PESSOA-PB 2014 TANGBADIOA HERVÉ COULIDIATI AVALIAÇÃO DOS EFEITOS ANTICANCERÍGENOS DOS 1,2,3-TRIAZÓIS DERIVADOS DO NÚCLEO 1,4-NAFTOQUINONA EM LINHAGENS LEUCÊMICAS HUMANAS Tese de doutorado apresentada ao programa de PósGraduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do Centro de Ciências da Saúde, da Universidade Federal da Paraíba para obtenção do grau de Doutor em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos. Área de Concentração: Farmacologia BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Demétrius Antonio Machado de Araújo (Orientador) PgPNSB/UFPB Profa. Dra. Márcia Regina Piuvezam (Membro interno) PgPNSB/UFPB Profa. Dra. Sandra Rodrigues Mascarenhas (Membro interno) PgPNSB/UFPB Prof. Dr. Celso de Amorin Camara (Membro externo) UFRPE Profa. Dra. Patricia Mirella da Silva Scardua (Membro externo) DBM/UFPB Dedico essa tese o meu Pai, a minha mãe e os meus irmãos, fonte da minha inspiração. A gradecimentos Primeiramente, quero agradecer profundamente ao convênio T W A S -C N Pq, F R number: 3240223361 , pela oportunidade que eles me ofereceram com a bolsa de doutorado, o que permitiu a realização desse trabalho. M eus agradecimentos ao C N Pq e ao C A PE S pelo apoio financeiro ao laboratório que tambémpermitiu à realização desse trabalho. A gradeço a U niversidade F ederal da Paraíba, através do Programa de Pósgraduação em Produtos N aturais e S intéticos B ioativos para me aceitar como estudante de doutorado emconvênio. M eus sinceros agradecimentos ao Prof. D r. D emetrius A ntonio M achado de A raújo (O rientador), pela dedicação ao ensino, à pesquisa e pela orientação segura e paciente que possibilitou a realização desse trabalho, pela convivência diária e amizade sincera e atenciosa. M eus sinceros agradecimentos ao Prof. D r. E duardo de J esus O liveira, coorientador dessa tese. É com você que tudo iniciou desde o dia que respondeu a minha mensagemsemmesmo me conhecer. O brigado para essa oportunidade que me ofereceu e para ter sido me colocado emcontacto como Prof. D r. D emetrius. A gradeço sinceramente à Prof a. D ra. M árcia Regina Piuvezam, à Prof a. D ra. S andra Rodrigues M ascarenhas, à Prof a. D ra. Patricia M irella da S ilva S cardua, ao Prof. D r. C elso de A morin C amara para aceitar de fazer parte da minha banca de defesa do doutorado. A gradeço ao Prof. D r. V aldir de A ndrade B raga pelos encorajamentos e em aceitar de fazer parte da minha banca de qualificação. M euss agradecimentos a todos os professores do programa, especificamente a aqueles comquempaguei as disciplinas do doutorado. M eus agradecimentos ao Prof. D r. J uan C arlos com que estabeleci uma verdadeira amizade. O brigado por tudo e também de me apresentar aos integrantes das nossas peladas de baskete, especialmente o L eandro, meu parceiro quando quero tomar umas. M eus agradecimentos a essas pessoas maravilhosas que sempre tiveram comigo no laboratório e comquemaprendi muito: G laucia, B runa e D ra. A letheia. M eus agradecimentos à D ra. T eresa C ristina (T C ris) que sempre quis me ver feliz. M uito obrigado pelo apoio moral. A o Itacío pela convivência no laboratório e pelas explicações quando quero tirar duvidas. M eus agradecimentos a todos os membros do laboratório: A liny, Refany, C aio, C arol, Priscilla, L ais, K atyana, Izabela e A ndressa pela convivência diária no laboratório. M eus agradecimentos ao Prof. D r. E néas e à D ra. A line pelas suas contribuições preciosas nos experimentos de PC R e de microscopia de fluorescência. M eus agradecimentos a todos os estudantes africanos em J oão Pessoa, Recife e N atal com quemtive uma relação de fraternidade aqui no B rasil. M uito grato a V ocês! Lista de Figuras Figura 1: Capacidade biológica adquirida por células cancerosas durante o processo de tumorigênese. ...................................................................................................................... 19 Figura 2: Localização dos pontos de interrupção nos genes ABL e BCR e a estrutura dos RNAm quiméricos resultantes. ....................................................................................... 25 Figura 3: Representação esquemática do ciclo celular da mitose. .................................. 26 Figura 4: O processo de controle do ciclo celular. .............................................................. 29 Figura 5: Micrografias eletrônicas ilustrativas dos tipos de morte celular e as suas características morfológicas. .................................................................................................. 33 Figura 6: As duas principais vias que levam a apoptose. .................................................. 35 Figura 7: Classificação das quinonas. .................................................................................. 44 Figura 8: Estrutura do núcleo 1H-1,2,3-triazol não substituído. ........................................ 46 Figura 9: A reação de síntese do anel 1,2,3-triazol. ........................................................... 47 Figura 10: Presencia do núcleo 1,2,3-triazóis em várias moléculas com atividades biológicas. .................................................................................................................................. 49 Figura 11: Estruturas químicas das 1,2,3-triazol-1,4-naftoquinonas (C2-C8) e seu precursor azida (C1). ............................................................................................................... 54 Figura 12: Analise da fragmentação do DNA por eletroforese nas células HL-60 e K562. .......................................................................................................................................... 79 Figura 13: indução da condensação do material genético. ............................................... 80 Figura 14: Efeito do C2 e C3 na externalização da fosfatidilserina .................................. 86 Figura 15: Efeito de C2 e C3 na expressão das proteínas associadas a apoptose nas células HL-60. ........................................................................................................................... 88 Figura 16: Efeito de C2 e C3 na expressão da proteína ERK em células HL-60. ......... 99 Figura 17: Proposição do mecanismo de ação dos compostos C2 e C3 na linhagem de leucemia mielóide aguda (HL-60). ....................................................................................... 109 Figura 18: Proposição do mecanismo de ação dos comopostos C2 e C3 na linhagem de leucemia mielóide crônica (K562). ................................................................................. 110 vi Lista de Grafícos Gráfico 1: Determinação da viabilidade celular pela integridade da membrana plasmática por citometria de fluxo nas células K562. ......................................................... 72 Gráfico 2: Determinação da viabilidade celular pela integridade da membrana plasmática por citometria de fluxo nas células HL-60. ....................................................... 73 Gráfico 3: Determinação da viabilidade celular pela integridade da membrana plasmática por citometria de fluxo nas PBMCs. .................................................................. 74 Gráfico 4: Histogramas representativos do efeito dos compostos C2 e C3 na distribuição do ciclo celular em PBMC após 24 horas de incubação. ............................. 78 Gráfico 5: Avaliação do efeito de C2 e C3 sobre a despolarização da membrana mitocondrial. .............................................................................................................................. 82 Gráfico 6: Avaliação do efeito de C2 e C3 sobre a despolarização da membrana mitocondrial em PBMC. ........................................................................................................... 83 Gráfico 7: Avaliação da indução da apoptose e da necrose nas células HL-60 e K562 pelos compostos C2 e C3. ...................................................................................................... 85 Gráfico 8: Expressão do RNAm do p21 nas células K562. ............................................... 87 Gráfico 9: Efeito do C2 e C3 na expressão da proteína BAX nas células HL-60. ......... 89 Gráfico 10: Gráfico 10: Efeito do C2 e C3 na liberação do citocromo C dentro do citosol nas células HL-60..................................................................................................................... 90 Gráfico 11: Avaliação do nível de EROS intracelulares após 24 h de tratamento com os Compostos. ............................................................................................................................... 92 Gráfico 12: Gráfico 12: Avaliação do nível de produção de EROS em PBMC............... 93 Gráfico 13: Inibição da produção de EROS intracelular pelo NAC nas células HL-60 tratadas com C2 ou C3............................................................................................................ 94 Gráfico 14: Efeito do NAC sobre a citotoxicidade do C2 (A) e C3 (B) nas células HL-60. ..................................................................................................................................................... 95 Gráfico 15: Efeito do NAC na indução da apoptose nas células HL-60. ......................... 96 Gráfico 16: Participação das MAPKs na inibição da proliferação celular induzido pelos compostos. ................................................................................................................................ 98 vii Lista de Tabelas Tabela 1: Classificação Franco-Americo-Britanico dos vários subgrupos de Leucemia Mielóide Aguda. ........................................................................................................................ 23 Tabela 2: Sequencia dos primers utilizados na realização de PCR em K562. .............. 65 Tabela 3: Anticorpos primários e secundários usados na técnica de Western Blot, e respectivas diluições. ............................................................................................................... 66 Tabela 4: Atividade citotóxica em IC50 dos compostos e etoposideo (ETO) em linhagens de câncer humano e normais. .............................................................................. 70 Tabela 5: Efeito dos triazóis (C2 e C3) sobre a distribuição do ciclo celular em K562. 76 Tabela 6: Efeito dos triazóis (C2 e C3) sobre a distribuição do ciclo celular em HL-60. ..................................................................................................................................................... 77 viii Lista de Abreviaturas ABL: Abelson leucemia vírus AIF: Fator de indução da apoptose APAF: Apoptotic protease activating factor ASXL1: Additional sex combs like transcriptional regulator 1 ATP: Adenosine triphosphate BAX: Bcl2-associated X Bcl-2: B-cell lymphoma 2 BCR: Breakpoint cluster region BSA: Albumina de soro bovina CDKIs: Inibidores de CDKs CDKs: Quinases dependente de ciclinas CEBPA: CCAAT/enhancer-binding protein alpha CMA: autofagia mediada por chaperoninas CTHs: Células-tronco hematopoiéticas DCF: Diclorofluoresceina DMSO: Dimetilsulfoxido DNA: Acido desoxiribonucleico DTT: Ditiotreitol EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético ERK: Quinases reguladas por sinais externos EROS: Espécies reativas de oxigênio FAB: Sistema franco-americo-britânico FLT3: FMS-like tyrosina quinase 3 H2O2: Peróxido de hidrogênio Hsc70: Heat shock chaperone 70 ix IAF: Fator de inibição da apoptose IP: Iodeto de propídeo Kv1.3: Canal de potássio dependente de voltagem, tipo 1.3 LLA: Leucemia linfóide aguda LLC: Leucemia linfóide crônica LMA: Leucemia mielóide aguda LMC: Leucemia mielóide crônica MAPKs: Proteínas quinases ativadas por mitogênos MDR: Resistência a multidroga MTT: Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio NAC: N-acetil cisteina NPM1: Nucleophosmin PBMC: Células mononucleares do sangue periférico PBS: Tampão fosfato salina PD98059: inibidor de ERK PTP: Poro de permeabilidade transitório RNA: Acido ribonucleico SB203580: inibidor de p38 MAPK SDS: Dodecilsulfato de sódio SBF: Soro bovino fetal TBS-T: Tampão salina de tris TGF-β: Tumor growth factor β TMRM: Tetrametilrodamina metil ester TNF: Fator de necrose tumoral TNFR1: Fator de necrose tumoral receptor 1 WT1: Wilms tumor 1 x COULIDIATI, T.H. Avaliação dos efeitos anticancerígenos dos 1,2,3-triazóis derivados do núcleo 1,4-naftoquinona em linhagens leucêmicas humanas. 2014. 129f. Tese de Doutorado – Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa. Resumo O núcleo triazol e seus derivados têm atraído uma atenção considerável nessas últimas décadas devido ao seu potencial quimioterápico. Mais especificamente, tem se verificado o interesse em moléculas que contêm o grupo 1,2,3-triazol, isto porque esta classe de heterocíclicos é conhecida por exibir uma vasta gama de atividades biológicas, tais como, anti-proliferativo e anti-neoplásico. O objetivo desse trabalho foi o de avaliar o potencial anticancerígeno de novos triazóis derivados do 1,4-naftoquinona, elucidando as suas citotoxicidades e o mecanismo de morte envolvido. Os resultados obtidos revelaram que, das cinco linhagens cancerígenas testadas, as linhagens leucêmicas HL-60 e K562 foram as mais sensíveis, e dentre os oito compostos (denominados C1 a C8) testados, C2 e C3 foram os mais citotóxicos, apresentando CI50 de 14 μM e 41 μM, em HL-60 e de 24 μM e 81 μM em K562, respectivamente. Entretanto, os compostos foram menos citotóxicos nas células normais do sangue periférico humano com CI50 acima 80 μM. Investigando o tipo de morte induzido pelos compostos nas duas linhagens, foi demonstrado que os compostos C2 e C3 induziram apoptose em HL-60. Já nas células K562, este dois derivados provocaram a parada do ciclo celular na fase S e necrose. A parada do ciclo celular na fase S em K562 foi relacionada com a expressão do gene p21. Foi revelado a diminuição da expressão da proteína Bcl-2 e o aumento da expressão da proteína BAX nas células HL-60, e ainda verificou-se a liberação do citocromo c sugerindo a participação da via intrínseca na indução da apoptose em HL-60. A ativação dessa via pode ser via inibição da fosforilação da proteína ERK. Os resultados mostraram também que durante uma hora de pré-tratamento das células HL-60 com o N-acetil cisteina (1 mM), houve a redução da citotoxicidade dos compostos C2 e C3 de 30,83% e 26,47% respectivamente; indicando que a indução da apoptose em HL-60 é mediada pelo aumento da produção das espécies reativas de oxigênio intracelulares. Dessa forma, pode-se concluir que os compostos C2 e C3 apresentaram efeitos citotóxicos frente às linhagens HL-60 e K562, então, podem ser considerados como protótipo de moléculas anti-leucêmicas. Palavras chave: Apoptose; Ciclo celular; Citotoxicidade; Citometria de fluxo; EROS; Leucemia mielóide; 1,2,3-triazol-1,4-naftoquinonas. xi COULIDIATI, T.H. Evaluation of anticancer effects of 1,2,3-triazoles derivates to the nucleus 1,4-naphthoquinone in human leukemic cell lines. 2014. 129f. PhD thesis. Federal University of Paraíba – João Pessoa. Abstract The triazole nucleus and its derivatives have attracted considerable attention in recent decades for their chemotherapeutic potentials. Specifically, the interest in molecules containing the 1,2,3-triazole as chemotherapeutic agents for various diseases has increased, because they are known to exhibit a wide range of biological activities, such as anti-proliferative and anti-neoplastic. The aim of this study was to evaluate the potencial anti-cancer effect of new triazole derivatives from 1,4-naphthoquinone, elucidating their cytotoxicity and cell death mechanisms involved. From five cancer cell lines tested, leukemic cells (HL-60 and K562) were the most sensitive, and between the eight triazole compounds tested (called C1 to C8), compounds C2 and C3 showed the best IC50 of 14 μM and 41 μM for HL-60 cells and 24 μM and 81 μM for K562 cells, respectively. However, these two compounds showed very little cytotoxic effect towards PBMC normal cells with IC50 superior to 80 μM. Investigating the type of cell death induced by compounds C2 and C3, it was showed that compounds induced apoptosis in HL-60 cells and cell cycle arrest in the S-phase, and necrosis in K562 ones. Cell cycle arrest in S phase was related to the expression of the p21 gene in K562. Results revealed a reduced expression of Bcl-2 protein and an increased expression of BAX protein in HL-60 cells. Moreover, it was found cytochrome c release, suggesting involvement of the intrinsic pathway in apoptosis induction in these cells. Activation of this pathway may be through inhibition of ERK phosphorylation. Our results also showed that pre-treatment of HL-60 cells with N-acetyl cysteine (1 mM) for 1 hour reduced the cytotoxic effect of compounds C2 and C3 for 30,83% and 26,47% respectively; indicating that the induction of apoptosis in HL-60 is mediated by increased production of intracellular ROS. Thus, it can be concluded that C2 and C3 compounds showed cytotoxic effects on HL-60 and K562 cells, so, can be considered as prototype anti-leukemic molecules. Keywords: Apoptosis; Cell cycle; Cytotoxicity; Flow cytometry; Myeloid leukemia; ROS; 1,2,3-triazole-1,4-naphthoquinones. xii Sumário 1. Introdução .......................................................................................................................... 16 1.1 Tumor ............................................................................................................................. 16 1.2 Câncer ............................................................................................................................ 16 1.2.1 Definição ................................................................................................................ 16 1.2.2 A transformação maligna .......................................................................................... 17 1.2.3 As características do câncer..................................................................................... 18 1.3 Epidemiologia do câncer .................................................................................................. 19 1.4 Leucemia ............................................................................................................................. 21 1.4.1 Leucemia mielóide aguda ......................................................................................... 22 1.4.2 Leucemia mielóide crônica........................................................................................ 23 1.5 Ciclo celular ........................................................................................................................ 25 1.5.1 Divisão celular ............................................................................................................. 25 1.5.2 Sistema de controle do ciclo celular ........................................................................ 27 1.6 Morte celular ....................................................................................................................... 29 1.6.1 Autofagia ...................................................................................................................... 30 1.6.2 Senescência ................................................................................................................ 31 1.6.3 Mitose catastrófica ..................................................................................................... 31 1.6.4 Necrose ........................................................................................................................ 32 1.6.5 Apoptose ...................................................................................................................... 33 1.6.5.1 Alterações morfológicas e bioquímicas da apoptose. ................................... 34 1.6.5.2 Mecanismo da apoptose .................................................................................... 35 1.7 Mitocôndria ......................................................................................................................... 37 1.8 Sinalização celular em modelos de câncer ................................................................... 39 1.9 Espécies reativas de oxigênio ......................................................................................... 40 1.10 Quimioterapia do câncer ................................................................................................ 42 1.11 Derivados triazóis de quinonas ..................................................................................... 44 1.11.1 Naftoquinonas ........................................................................................................... 44 1.11.2 1,2,3-triazóis .............................................................................................................. 45 1.11.2.1 Estrutura e síntese ............................................................................................ 45 1.11.2.2 Efeitos farmacológicos ..................................................................................... 47 xiii 2. Objetivos ............................................................................................................................ 50 2.1 Objetivo geral ..................................................................................................................... 50 2.2 Objetivos específicos ........................................................................................................ 50 3. Material e Métodos ........................................................................................................... 51 3.1 Material ................................................................................................................................ 51 3.1.1 Equipamentos ............................................................................................................. 51 3.1.2 Reagentes e compostos utilizados .......................................................................... 52 3.1.3 Soluções ...................................................................................................................... 52 3.1.4 Compostos estudados ............................................................................................... 53 3.1.5 Linhagens celulares ................................................................................................... 54 3.1.5.1 Linhagens leucêmicas (HL-60, K562, K562-Lucena) .................................... 54 3.1.5.2 Linhagens de adenocarcinoma de mama (MCF-7) e de cólon (HT-29) ..... 55 3.1.5.3 Células do sangue periférico (PBMC) .............................................................. 55 3.2 Métodos ............................................................................................................................... 56 3.2.1 Teste de viabilidade preliminar das culturas celulares ......................................... 56 3.2.2 Teste de viabilidade celular pelo método colorimétrico do MTT ......................... 57 3.2.3 Ensaio da integridade da membrana plasmática por citometria ......................... 58 3.2.4 Análise do ciclo celular por citometria ..................................................................... 58 3.2.5 Avaliação da fragmentação do DNA ....................................................................... 59 3.2.5.1 Extração do DNA................................................................................................. 59 3.2.5.2 Eletroforese em gel de agarose ........................................................................ 59 3.2.6 Análise da condensação da cromatina por microscopia de fluorescência ........ 60 3.2.7 Avaliação do potencial da membrana mitocondrial por citometria ..................... 60 3.2.8 Teste da externalização da fosfatidilserina por citometria ................................... 61 3.2.9 Análise da externalização da fosfatidilserina por microscopia de fluorescência ................................................................................................................................................. 62 3.2.10 Avaliação da produção das espécies reativas de oxigênio ............................... 62 3.2.11 Análise da expressão relativa do gene p21. ........................................................ 63 3.2.12 Análise da expressão de proteínas por Western blot ......................................... 65 3.2.12.1 Preparo das amostras ...................................................................................... 65 3.2.12.2 Dosagem de proteína (Método de Bradford): ............................................... 65 3.2.12.3 Eletroforese e electrotransferência ................................................................ 65 3.2.12.4 Imunodeteção de proteínas com anticorpos específicos............................ 66 3.2.13 Análise de proteínas intracelulares por citometria de fluxo ............................... 67 xiv 3.3 Análise estatística .............................................................................................................. 68 4. Resultados ......................................................................................................................... 69 4.1 Efeito citotóxico dos compostos ...................................................................................... 69 4.2 Análise da viabilidade celular pela avaliação da integridade da membrana celular. ..................................................................................................................................................... 71 4.3 Efeito dos compostos no ciclo celular ............................................................................ 75 4.4 Avaliação do dano do material genético ........................................................................ 79 4.5 Efeito dos compostos na despolarização do potential da membrana mitocondrial 81 4.6 Avaliação da exteriorização da fosfatidilserina ............................................................. 84 4.7 Avaliação da expressão do RNAm do p21 .................................................................... 87 4.8 Análise da expressão das proteínas BAX e Bcl-2 ........................................................ 88 4.9 Avaliação da via de indução da apoptose em HL-60 ................................................... 89 4.10 Nível de EROS intracelulares e efeito do NAC ........................................................... 91 4.11 Investigação da via de MAPK ........................................................................................ 97 Discussão ................................................................................................................................ 100 Conclusão ................................................................................................................................ 111 Referências bibliográficas ..................................................................................................... 112 xv 1. Introdução 1.1 Tumor Em Patologia, tumor é qualquer massa anômala observada nos tecidos. Se a massa, formada por células, apresenta uma taxa de crescimento persistente e que ultrapassa a taxa de crescimento dos tecidos normais, definese uma neoplasia. As neoplasias são classificadas em benignas e malignas. Enquanto neoplasias benignas tendem a crescer de maneira circunscrita ao seu tecido de origem; neoplasias malignas caracterizam-se pelo crescimento invasivo e sua disseminação por vasos sanguíneos ou linfáticos, dando origem às metástases. As neoplasias malignas são conhecidas como cânceres (HANAHAN & WEINBERG, 2000). 1.2 Câncer 1.2.1 Definição O câncer é o termo usado para designar um conjunto de mais de uma centena de enfermidades caracterizadas pela proliferação descontrolada de células somáticas, o que leva à formação de um tecido anormal (RIBEIRO & FREIRE-MAIA, 2002). Ou seja, é nada mais que uma expansão clonal incessante de células somáticas que, invadindo, subvertendo e corroendo os tecidos normais, provoca a morte do mesmo (EVAN & VOUSDEN, 2001). O câncer é uma doença genética complexa, que é causado principalmente por fatores ambientais. Os agentes causadores do câncer (carcinógenos) podem estar presentes nos alimentos, na água, no ar, nos produtos químicos e na luz solar, por causa dos raios ultravioletas (ALISON, 2001). 16 1.2.2 A transformação maligna A transição de uma célula normal para o estado transformado, ou tumoral, é devida principalmente a uma combinação de eventos genéticos. Especificamente, a transformação maligna é devido a uma acumulação de mutações aleatórias e espontâneas em genes diferentes (normalmente mais de dez) dentro da mesma linhagem celular (LOWE et al., 2004). Essa transformação maligna precisa ser codificada de forma estável de modo que os eventos ontogênicos possam acumular-se nas linhagens clonais. Os mecanismos de mutações genéticas como as alterações, as inserções, as deleções e as recombinações são capazes de induzir mudanças fenotípicas persistentes a uma célula transformada. Por esta razão, o câncer tem sido visto como uma doença baseada principalmente na genética (PONDER, 2001; HAHN & WEINBERG, 2002). No entanto, os eventos genéticos ocorrem em baixa frequência e não são, portanto, um dispositivo particularmente eficaz para a transformação maligna. Também, algumas células superam a transformação maligna por meio da aquisição de processo de reparo do defeito do DNA. Os mecanismos de controle epigenético oferecem via alternativa a partir da aquisição de características ontogênicas estáveis. Os eventos epigenéticos são flexíveis e podem persistir devido às múltiplas divisões celulares, exercendo efeitos poderosos sobre o fenótipo celular (SHEN & LAIRD, 2012; DAWSON & KOUZARIDES, 2012). Embora as células cancerosas sofram alterações epigenéticas, as análises genômicas e epigenômicas revelaram recentemente a ocorrência generalizada de mutações nos reguladores epigenéticos de células cancerosas (YOU & JONES, 2012). Assim, os mecanismos genéticos e epigenéticos influenciam uns aos outros (YOU & JONES, 2012) e colaboram para permitir a aquisição dos dez principais balizamentos do câncer definidos na Figura 1 (HANAHAN & WEINBERG, 2011). 17 1.2.3 As características do câncer As células malignas atingem o fenótipo tumoral, em grande parte, pela reativação e modificação de muitos programas celulares existentes normalmente, que são utilizados durante o desenvolvimento celular. Esses programas controlam processos coordenados, tais como a proliferação, a migração, a polaridade, a apoptose e a diferenciação durante o desenvolvimento embrionário e a homeostase do tecido (LUO et al., 2009). Assim, danos nesses programas importantes podem resultar, para a célula e a sua progenitora, numa vantagem seletiva sobre as células vizinhas e, desse modo, numa vantagem proliferativa (LOWE et al., 2004). A célula cancerosa resultante evolui devido às alterações genéticas, seguido da seleção clonal das células anormais que podem sobreviver e proliferar em circunstâncias que, normalmente conduziriam a morte celular (LUO et al., 2009; STRATTON et al., 2009). Os tumores são diversos e heterogêneos, mas todos compartilham a capacidade de proliferar, além das restrições que limitam o crescimento do tecido normal. A falta de regulação de um número restrito de vias principais que controlam a proliferação e a sobrevivência da célula é obrigatória para o estabelecimento de todos os cânceres (EVAN & VOUSDEN, 2001). Como ilustrado na Figura 1, o câncer surge por causa de várias etapas do processo mutagênico nos quais as células cancerosas adquirem um conjunto comum de propriedades, incluindo o potencial ilimitado de proliferação, a auto-suficiência em sinais de crescimento e a resistência aos sinais antiproliferativos e apoptóticos (HANAHAN & WEINBERG, 2000; 2011). 18 Figura 1: Capacidade biológica adquirida por células cancerosas durante o processo de tumorigênese. (Adaptado de HANAHAN & WEINBERG, 2011) 1.3 Epidemiologia do câncer O câncer é um importante problema de saúde pública em países desenvolvidos e em desenvolvimento, sendo responsável por mais de seis milhões de óbitos a cada ano, representando cerca de 12% de todas as causas de morte no mundo. Embora as maiores taxas de incidência de câncer sejam encontradas em países desenvolvidos, dos dez milhões de casos novos anuais de câncer, cinco milhões e meio são diagnosticados nos países em desenvolvimento (OMS, 2002). De acordo com os dados epidemiológicos do câncer, um número estimado de 14,1 milhões de novos casos de câncer e 8,2 milhões de mortes 19 relacionadas ao câncer ocorreu em 2012, em comparação com 12,7 milhões e 7,6 milhões, respectivamente, em 2008. As estimativas de prevalência para 2012 mostram que houve 32,6 milhões de pessoas, com idade superior a 15 anos, vivas que tiveram um câncer diagnosticado nos últimos cinco anos (FERLAY et al., 2013). Os cânceres mais comumente diagnosticados em todo o mundo foram os de pulmão (1,8 milhões, 13,0% do total), de mama (1,7 milhões, 11,9%), e do cólon (1,4 milhões, 9,7%). As causas mais comuns de morte por câncer foram os cânceres de pulmão (1,6 milhões, 19,4% do total), fígado (0,8 milhão, 9,1%) e estômago (0,7 milhão, 8,8%) (FERLAY et al., 2013). Projeções com base nas estimativas GLOBOCAN 2012 prevêem um aumento substancial de 19,3 milhões de novos casos de câncer por ano até 2025, devido ao crescimento e envelhecimento da população global. Mais da metade de todos os cânceres (56,8%) e mortes por câncer (64,9%), em 2012 ocorreram em regiões menos desenvolvidas do mundo, e essas proporções irão aumentar ainda mais em 2025 (Ferlay et al., 2013). As leucemias foram relatadas na nona e na décima posições, dentre os cânceres comuns em homens e mulheres, respectivamente (JEMAL et al., 2011). Acometem indivíduos de todas as idades e raças, entretanto mais de 50% dos casos ocorrem até os 20 anos de idade, apesar de ser a forma mais comum de leucose no adulto e compreender 10-15% dos casos de leucemia aguda na infância. Esta patologia é rara acima dos 80 anos de idade. Verificase predomínio na raça branca e 60% dos casos são no sexo masculino (OLANIYI & UMAR, 2013). Tem sido relatado que indivíduos com síndrome de Down, síndrome de Patau, anemia de Fanconi, síndrome de Kostmann, síndrome de Bloom, síndrome de Klinefelter, neurofibromatose, hemoglobinúria paroxística noturna, policitemia vera, síndromes mielodisplásicas têm predisposição de desenvolver leucemias (RAJABLI et al., 2013). Fatores ambientais como certos agentes químicos (pesticidas, herbicidas, benzeno, borracha, fumo, tintas, derivados de petróleo, óxido de etileno) ou fármacos (cloranfenicol, fenilbutazona, cloroquina), exposição laborial ou acidental à radiação ionizante, radioterapia e quimioterapia no tratamento de neoplasias prévias, infecções virais (principalmente pelo EBV, 20 HIV e HTLV-1) também predispõem ao aparecimento das leucemias agudas (RAJABLI et al., 2013). 1.4 Leucemia O sistema hematopoiético é organizado a partir de uma hierarquia mantida por células-tronco hematopoiéticas raras (CTHs), que se auto-renovam e se diferenciam para produzir linhagens sanguíneas maduras, garantindo a produção de sangue durante o tempo da vida do organismo (WARNER et al., 2005). As CTHs dão origem a um grupo de células progenitoras que não têm mais o papel de se auto-renovar, que por sua vez dão origem as células que são mais limitadas nos seus potenciais de diferenciação, e finalmente para células maduras funcionais (PASSEGUÉ et al., 2003). Quando os sinais que regem esses processos normais tornam-se desregulados, as leucemias resultam em um acúmulo de células blásticas imaturas, que não conseguem se diferenciar em células funcionais (WARNER et al., 2005). A célula, em que os eventos de transformação acontecem, é desconhecida para a maioria dos tipos de cânceres, mas certos tipos de leucemias surgem devido às mutações que se acumulam nas CTHs (PASSEGUÉ et al. 2003). Assim, a leucemia é uma doença heterogênea, em nível molecular, resultante de uma variedade de alterações de numerosos genes importantes para o crescimento celular, a diferenciação e a morte celular (LI et al., 2005). As leucemias incluem quatro principais subtipos, descritos pela maioria dos registros de câncer. Esses quatros subtipos são: a Leucemia Mielóide Aguda (LMA), a Leucemia Mielóide Crônica (LMC), a Leucemia Linfóide Aguda (LLA), e a Leucemia Linfóide Crônica (LLC) (XIE et al., 2003). 21 1.4.1 Leucemia mielóide aguda A leucemia mielóide aguda (LMA) é caracterizada pela acumulação de grandes números de células anormais que não conseguem diferenciar-se em granulócitos ou monócitos (BONNET & DICK, 1997). A LMA é uma doença fenotipicamente e geneticamente heterogênea que pode se classificar de M0 a M7 (Tabela 1), de acordo com a classificação FAB (sistema Franco-AmericoBritânico). Grande progresso tem sido feito para compreender os mecanismos de leucemogênese na LMA. Uma das hipóteses mais relevante é a implicação das células-tronco hematopoiéticas primitivas ou as células progenitoras capazes de se transformar numa célula-tronco leucêmica, que mantém a capacidade de se auto-renovar (RENNEVILLE et al., 2008). As duas características fundamentais da LMA, incluem a proliferação desregulada e a sobrevivência celular por ativação dos oncogenes ou desativação dos genes supressores de tumores e o bloqueio da diferenciação causada pela redução da função dos fatores de transcrição, que são especificamente importantes para a diferenciação terminal das linhagens celulares derivadas da célula progenitora mielóide comum (RECKZEH et al., 2012). Tem sido proposto que, de acordo com os seus papéis na patogênese, as anormalidades genéticas de leucemia podem ser agrupadas em duas categorias: (1) mutações que envolvem as vias de transdução de sinal, dando origem às vantagens proliferativas para clones da leucemia (classe I); (2) aquelas que afetam os fatores de transcrição ou cofatores e prejudicam a diferenciação (classe II). Várias mutações genéticas foram descobertas em pacientes com LMA sem marcadores citogenéticos, e essas anormalidades foram consideradas como pertencentes à classe I, como exemplo as mutações nos genes C-KIT, FLT3 e NRAS ou classe II, como exemplo as mutações nos genes NPM1, CEBPA, WT1 e ASXL1 (SHEN et al., 2011). 22 Tabela 1: Classificação Franco-Americo-Britanico dos vários subgrupos de Leucemia Mielóide Aguda. Classificação LMA Descrição M0 Mieloblástica M1 Mieloblástica sem maturação M2 Mieloblástica com maturação M3 Promielocítica hipergranular M3 variante Promielocítica microgranular M4 Mielomonocítica M4 Eo Mielomonocítica com eosinofilia M5 Monocítica M5A Monocítica pouco diferenciada M5B Monocítica bem diferenciada M6 Eritroleucemia M7 Megacariocítica 1.4.2 Leucemia mielóide crônica A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença clonal maligna caracterizada por uma excessiva proliferação da linhagem mielóide (Fase Crônica), seguida por uma perda progressiva da diferenciação celular (Fase Acelerada) e terminando num quadro de leucemia aguda (Fase Blástica). A doença é associada a uma anormalidade citogenética específica conhecida como cromossomo Philadelphia (Ph). O cromossomo Ph ocorre em mais de 90% dos casos de LMC. Embora observado em outras leucemias e até mesmo em condições neoplásicas não hematopoéticas, ele é reconhecido como marcador citogenético da LMC e sua detecção tem implicações no diagnóstico, prognóstico e na terapêutica da doença (CHEN et al., 2010; BERGANTINI et al., 2005). O cromossomo Ph resulta de uma translocação recíproca entre os braços longos dos cromossomos 9 e 22. Esta translocação t(9;22)(q34;q11) 23 justapõe o oncogene ABL (Abelson Leukemia Vírus), mapeado no cromossomo 9, ao gene BCR (Breakpoint Cluster Region) mapeado no cromossomo 22. (Figura 2). Em condições normais, o gene BCR codifica uma proteína com função relacionada à regulação do ciclo celular, enquanto o gene ABL codifica uma proteína tirosina quinase. A oncoproteína quimérica resultante da fusão (BCR-ABL) apresenta uma atividade tirosina-quinase elevada, responsável pela patogênese da doença (BERGANTINI et al., 2005; DEININGER et al., 2000). O neogene BCR-ABL é o responsável pelo processo molecular que determina a transformação da célula progenitora hematopoética normal em maligna. A célula leucêmica com o gene BCR-ABL apresenta uma mieloproliferação contínua resultante, provavelmente, de três mecanismos principais: a alteração da adesão das células progenitoras com as células estromais e da matriz extracelular; a manutenção do sinal mitogênico constante e a resistência à apoptose celular. A tirosina-quinase BCR-ABL confere à célula leucêmica uma alta resistência à morte celular independentemente do agente indutor deste processo. Contudo, esses mecanismos de resistência, que favorecem o crescimento e a vantagem proliferativa das células com o cromossomo Ph em relação às células normais, não foram totalmente elucidados (BERGANTINI et al., 2005; MUGHAL et al., 2007). 24 Figura 2: Localização dos pontos de interrupção nos genes ABL e BCR e a estrutura dos RNAm quiméricos resultantes. (Fonte: DEININGER et al., 2000) 1.5 Ciclo celular 1.5.1 Divisão celular A divisão celular ocorre por uma série de eventos bem elaborados, em que os cromossomas e outros componentes são duplicados e uniformemente distribuídos em duas células filhas. É um processo altamente ordenado e bem regulado, que provoca uma mudança irreversível e unidireccional no estado da célula (PINHEIRO & SUNKEL, 2012). Essas reações bioquímicas complexas ocorrem em um período de cerca de 24 horas, dependendo do tipo de célula, sendo denominado ciclo celular (GARAY et al., 2003). Originalmente, a divisão celular foi dividida em duas fases: a mitose (M), o processo de divisão nuclear, e a interfase, o intervalo entre duas fases M. As etapas da mitose incluem a prófase, a metáfase, a anáfase e a telófase. Ao microscópio, as células de interfase aumentam de tamanho, mas com diferentes técnicas revelaram que a 25 interfase inclui as fases G1, S e G2. A replicação do DNA ocorre numa parte específica da interfase chamada fase S. A fase S é precedida pela fase G1 durante a qual a célula se prepara para a síntese do DNA e é seguido pela fase G2 durante a qual a célula se prepara para a mitose. As fases G1, S, G2 e M são as subdivisões tradicionais de um ciclo celular normal (Figura 3). Células em G1 podem, antes da replicação do DNA, entrar em um estado de repouso chamado G0 (VERMEULEN et al., 2003). Nas células normais, a progressão do ciclo celular pode ser controlada em resposta a diversos estímulos mitogénicos e anti-mitogénicos, o que resulta na modulação de diversos mecanismos moleculares. As diferentes cascatas de sinalização podem regular as proteínas do ciclo celular, a expressão de genes, as modificações pós-traducionais e a degradação de proteínas. Figura 3: Representação esquemática do ciclo celular da mitose. Fonte: WWW.google.com.br/ciclocelular 26 1.5.2 Sistema de controle do ciclo celular A transição de uma fase do ciclo celular para outro ocorre de forma ordenada e é regulada por diferentes proteínas celulares. As principais proteínas reguladoras são as quinases dependentes das ciclinas (CDKs), que são uma família de proteínas serina/treonina quinases ativadas em pontos específicos do ciclo celular. Até agora, nove CDKs foram identificadas e, dessas, cinco são ativas durante o ciclo celular. Entre elas temos as CDK4, CDK6 e CDK2 ativas durante a fase G1, a CDK2 ativa durante a fase S e a CDK1 ativa na fase G2 e M (Figura 4). Os níveis de proteínas CDK permanecem estáveis durante o ciclo celular, em contraste com as suas proteínas de ativação, as ciclinas. As ciclinas são sintetizadas e destruídas em períodos específicos durante o ciclo celular, regulando assim a atividade das quinases de uma forma conveniente. Diferentes ciclinas são necessárias nas diferentes fases do ciclo celular. As três ciclinas de tipo D (ciclina D1, ciclina D2, ciclina D3) se ligam às CDK4 e CDK6, e os complexos CDK-ciclina D são essenciais para a entrada na fase G1. Ao contrário das outras ciclinas, a ciclina D não é expressa constitutivamente, mas é induzida, enquanto a estimulação pelos fatores de crescimento persistir. Outra ciclina do G1 é a ciclina E, que se associa com CDK2 para regular a progressão do ciclo da fase G1 para a fase S. A ciclina A se liga com CDK2 e esse complexo é necessário durante a fase S. No final da interfase (fase G2), a ciclina A se complexa com CDK1 para promover à entrada na fase M. A mitose é ainda regulada pela ciclina B em complexo com CDK1 (VERMEULEN et al. 2003; SCHWARTZ & SHAH, 2005; HOCHEGGER et al., 2008; MALUMBRES & BARBACID, 2009). Além da ligação com as ciclinas, a atividade de CDK é também regulada por fosforilação em resíduos treonina e tirosina conservados. A ativação completa de CDK1 requer a fosforilação da treonina 161 (treonina 172 em CDK4 e treonina 160 em CDK2). Essas fosforilações induzem alterações conformacionais e reforçam a ligação das ciclinas. As proteínas quinases Wee1 e Myt1 fosforilam a CDK1 na tirosina-15 e/ou treonina-14, inativando assim a quinase. A desfosforilação nestes locais pela enzima Cdc25 é necessária para 27 a ativação da CDK1 e a progressão através do ciclo celular (VERMEULEN et al. 2003). A atividade de CDK pode ser neutralizada por proteínas inibidoras do ciclo celular, chamadas inibidores de CDK (CDKIs), que se ligam a CDK sozinha ou no complexo CDK-ciclina e regulam sua atividade. Duas famílias distintas de CDKIs foram descobertas, a família INK4 e a família Cip/Kip. A família INK4 inclui p15 (INK4b), p16 (INK4a), p18 (INK4c), p19 (INK4d), que especificamente inativam as CDKs da fase G1 (CDK4 e CDK6). Estes CDKIs formam complexos estáveis com a enzima CDK, antes da ligação da ciclina, impedindo a associação com a ciclina D. A segunda família de inibidores, a família Cip/Kip, que inclui p21 (WAF1, CIP1) e p27 (CIP2), p57 (Kip2). Estes inibidores inibem os complexos CDK-ciclina da fase G1, e, em menor grau, o complexo CDK1-ciclina B. As CDKIs são reguladas tanto por sinais internos e externos: a expressão de p21 está sob o controle transcricional do gene supressor de tumor p53. O promotor do gene de p21 contém um sítio de ligação à p53, o que permite que p53 transcricionalmente ative o gene p21. A expressão e ativação de p15 e p27 aumentam em resposta ao fator de transformação do crescimento β (TGF-β), contribuindo para a parada do crescimento (VERMEULEN et al. 2003; MALUMBRES & BARBACID, 2009). 28 Figura 4: O processo de controle do ciclo celular. A progressão através do ciclo celular é promovida pelas quinases dependentes de ciclinas (CDK), que são reguladas positivamente ou negativamente pelas ciclinas e pelos inibidores de CDK (CDKIs). O ponto de restrição é o ponto em que as células progridem através do ciclo celular independente de estímulos externos (Fonte: SCHWARTZ & SHAH, 2005). 1.6 Morte celular As células dos organismos multicelulares são membros de uma comunidade altamente organizada. O número de células na comunidade é fortemente regulado, não apenas pelo controle da taxa de divisão celular, mas também pelo controle da taxa de morte celular. Sabe-se que o desenvolvimento e a manutenção dos organismos dependem da interação entre as células que o constituem. A morte celular é um processo fundamental durante esses processos fisiológicos. Ela acontece naturalmente durante o 29 desenvolvimento e o envelh

Novo documento

RECENT ACTIVITIES

Transferir (131 página)
Livre

Documento similar

Desenvolvimento de vacinas recombinantes contra malária humana e teste in vivo em modelo murino
0
6
9
O ensino do relevo: noções e propostas para uma didática da geomorfologia
0
3
124
Entre desafios e potencialidades:: avaliação da participação comunitária em um programa de controle da esquistossomose e de promoção da saúde
0
2
148
A escrita imagética em "Relato de um certo Oriente", de Milton Hatoum
1
4
165
Estudo da frequência de oscilação da musculatura do assoalho pélvico durante a contração por meio de dispositivo vaginal multidirecional
0
5
76
Estudo e implementação de técnicas de controle de sistemas a eventos discretos em CLP: aplicação em um sistema flexível de manufatura didático
0
8
144
Estudo longitudinal dos fatores relacionados à infecção e reinfecção pelo Schistosoma mansoni em área endêmica, Minas Gerais
0
3
134
Identificação de espécies de candida na cavidade bucal e susceptibilidade antifúngica em pacientes irradiados em região de cabeça e pescoço e portadores de prótese removível
0
6
103
Inércia versus inovação: a produção residencial multifamiliar contemporânea em Belo Horizonte e São Paulo
0
1
358
Um método trust-region para otimização com restrições fazendo uso do método gradiente projetado
0
2
46
Movimento na composição musical: uma abordagem à luz do pensamento de Paul Klee e Gilles Deleuze
0
2
309
Nanopublicação e indexação: interlocuções semânticas, pragmáticas e discursiva em aplicações mtodológicas
0
2
201
Papel dos bacteriófagos na Etiopatogenia da vaginose bacteriana
0
9
47
Pattápio Silva (1880-1907): uma abordagem interpretativa de sua música em forma de dança e de livre fantasia
1
9
127
Tratamento de uma coorte de pacientes com infarto agudo do miocárdio com supradesnivelamento do segmento ST.
0
9
8
Show more