Avaliação dos efeitos anticancerígenos dos 1,2,3-triazóis derivados do núcleo 1,4-naftoquinona em linhagens leucêmicas humanas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SINTETICOS BIOATIVOS AVALIAÇÃO DOS EFEITOS ANTICANCERÍGENOS DOS 1,2,3TRIAZÓIS DERIVADOS DO NÚCLEO 1,4-NAFTOQUINONA EM LINHAGENS LEUCÊMICAS HUMANAS TANGBADIOA HERVÉ COULIDIATI JOÃO PESSOA-PB 2014 TANGBADIOA HERVÉ COULIDIATI AVALIAÇÃO DOS EFEITOS ANTICANCERÍGENOS DOS 1,2,3TRIAZÓIS DERIVADOS DO NÚCLEO 1,4-NAFTOQUINONA EM LINHAGENS LEUCÊMICAS HUMANAS Tese de doutorado apresentada ao programa Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do Centro de Ciências da Saúde, da Universidade Federal da Paraíba para obtenção do grau de Doutor em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos. Área de Concentração: Farmacologia Orientador: Prof. Dr. Demétrius Antonio Machado de Araújo Co-orientador: Prof. Dr. Eduardo de Jesus Oliveira JOÃO PESSOA-PB 2014 TANGBADIOA HERVÉ COULIDIATI AVALIAÇÃO DOS EFEITOS ANTICANCERÍGENOS DOS 1,2,3-TRIAZÓIS DERIVADOS DO NÚCLEO 1,4-NAFTOQUINONA EM LINHAGENS LEUCÊMICAS HUMANAS Tese de doutorado apresentada ao programa de PósGraduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do Centro de Ciências da Saúde, da Universidade Federal da Paraíba para obtenção do grau de Doutor em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos. Área de Concentração: Farmacologia BANCA EXAMINADORA Prof. Dr. Demétrius Antonio Machado de Araújo (Orientador) PgPNSB/UFPB Profa. Dra. Márcia Regina Piuvezam (Membro interno) PgPNSB/UFPB Profa. Dra. Sandra Rodrigues Mascarenhas (Membro interno) PgPNSB/UFPB Prof. Dr. Celso de Amorin Camara (Membro externo) UFRPE Profa. Dra. Patricia Mirella da Silva Scardua (Membro externo) DBM/UFPB Dedico essa tese o meu Pai, a minha mãe e os meus irmãos, fonte da minha inspiração. A gradecimentos Primeiramente, quero agradecer profundamente ao convênio T W A S -C N Pq, F R number: 3240223361 , pela oportunidade que eles me ofereceram com a bolsa de doutorado, o que permitiu a realização desse trabalho. M eus agradecimentos ao C N Pq e ao C A PE S pelo apoio financeiro ao laboratório que tambémpermitiu à realização desse trabalho. A gradeço a U niversidade F ederal da Paraíba, através do Programa de Pósgraduação em Produtos N aturais e S intéticos B ioativos para me aceitar como estudante de doutorado emconvênio. M eus sinceros agradecimentos ao Prof. D r. D emetrius A ntonio M achado de A raújo (O rientador), pela dedicação ao ensino, à pesquisa e pela orientação segura e paciente que possibilitou a realização desse trabalho, pela convivência diária e amizade sincera e atenciosa. M eus sinceros agradecimentos ao Prof. D r. E duardo de J esus O liveira, coorientador dessa tese. É com você que tudo iniciou desde o dia que respondeu a minha mensagemsemmesmo me conhecer. O brigado para essa oportunidade que me ofereceu e para ter sido me colocado emcontacto como Prof. D r. D emetrius. A gradeço sinceramente à Prof a. D ra. M árcia Regina Piuvezam, à Prof a. D ra. S andra Rodrigues M ascarenhas, à Prof a. D ra. Patricia M irella da S ilva S cardua, ao Prof. D r. C elso de A morin C amara para aceitar de fazer parte da minha banca de defesa do doutorado. A gradeço ao Prof. D r. V aldir de A ndrade B raga pelos encorajamentos e em aceitar de fazer parte da minha banca de qualificação. M euss agradecimentos a todos os professores do programa, especificamente a aqueles comquempaguei as disciplinas do doutorado. M eus agradecimentos ao Prof. D r. J uan C arlos com que estabeleci uma verdadeira amizade. O brigado por tudo e também de me apresentar aos integrantes das nossas peladas de baskete, especialmente o L eandro, meu parceiro quando quero tomar umas. M eus agradecimentos a essas pessoas maravilhosas que sempre tiveram comigo no laboratório e comquemaprendi muito: G laucia, B runa e D ra. A letheia. M eus agradecimentos à D ra. T eresa C ristina (T C ris) que sempre quis me ver feliz. M uito obrigado pelo apoio moral. A o Itacío pela convivência no laboratório e pelas explicações quando quero tirar duvidas. M eus agradecimentos a todos os membros do laboratório: A liny, Refany, C aio, C arol, Priscilla, L ais, K atyana, Izabela e A ndressa pela convivência diária no laboratório. M eus agradecimentos ao Prof. D r. E néas e à D ra. A line pelas suas contribuições preciosas nos experimentos de PC R e de microscopia de fluorescência. M eus agradecimentos a todos os estudantes africanos em J oão Pessoa, Recife e N atal com quemtive uma relação de fraternidade aqui no B rasil. M uito grato a V ocês! Lista de Figuras Figura 1: Capacidade biológica adquirida por células cancerosas durante o processo de tumorigênese. ...................................................................................................................... 19 Figura 2: Localização dos pontos de interrupção nos genes ABL e BCR e a estrutura dos RNAm quiméricos resultantes. ....................................................................................... 25 Figura 3: Representação esquemática do ciclo celular da mitose. .................................. 26 Figura 4: O processo de controle do ciclo celular. .............................................................. 29 Figura 5: Micrografias eletrônicas ilustrativas dos tipos de morte celular e as suas características morfológicas. .................................................................................................. 33 Figura 6: As duas principais vias que levam a apoptose. .................................................. 35 Figura 7: Classificação das quinonas. .................................................................................. 44 Figura 8: Estrutura do núcleo 1H-1,2,3-triazol não substituído. ........................................ 46 Figura 9: A reação de síntese do anel 1,2,3-triazol. ........................................................... 47 Figura 10: Presencia do núcleo 1,2,3-triazóis em várias moléculas com atividades biológicas. .................................................................................................................................. 49 Figura 11: Estruturas químicas das 1,2,3-triazol-1,4-naftoquinonas (C2-C8) e seu precursor azida (C1). ............................................................................................................... 54 Figura 12: Analise da fragmentação do DNA por eletroforese nas células HL-60 e K562. .......................................................................................................................................... 79 Figura 13: indução da condensação do material genético. ............................................... 80 Figura 14: Efeito do C2 e C3 na externalização da fosfatidilserina .................................. 86 Figura 15: Efeito de C2 e C3 na expressão das proteínas associadas a apoptose nas células HL-60. ........................................................................................................................... 88 Figura 16: Efeito de C2 e C3 na expressão da proteína ERK em células HL-60. ......... 99 Figura 17: Proposição do mecanismo de ação dos compostos C2 e C3 na linhagem de leucemia mielóide aguda (HL-60). ....................................................................................... 109 Figura 18: Proposição do mecanismo de ação dos comopostos C2 e C3 na linhagem de leucemia mielóide crônica (K562). ................................................................................. 110 vi Lista de Grafícos Gráfico 1: Determinação da viabilidade celular pela integridade da membrana plasmática por citometria de fluxo nas células K562. ......................................................... 72 Gráfico 2: Determinação da viabilidade celular pela integridade da membrana plasmática por citometria de fluxo nas células HL-60. ....................................................... 73 Gráfico 3: Determinação da viabilidade celular pela integridade da membrana plasmática por citometria de fluxo nas PBMCs. .................................................................. 74 Gráfico 4: Histogramas representativos do efeito dos compostos C2 e C3 na distribuição do ciclo celular em PBMC após 24 horas de incubação. ............................. 78 Gráfico 5: Avaliação do efeito de C2 e C3 sobre a despolarização da membrana mitocondrial. .............................................................................................................................. 82 Gráfico 6: Avaliação do efeito de C2 e C3 sobre a despolarização da membrana mitocondrial em PBMC. ........................................................................................................... 83 Gráfico 7: Avaliação da indução da apoptose e da necrose nas células HL-60 e K562 pelos compostos C2 e C3. ...................................................................................................... 85 Gráfico 8: Expressão do RNAm do p21 nas células K562. ............................................... 87 Gráfico 9: Efeito do C2 e C3 na expressão da proteína BAX nas células HL-60. ......... 89 Gráfico 10: Gráfico 10: Efeito do C2 e C3 na liberação do citocromo C dentro do citosol nas células HL-60..................................................................................................................... 90 Gráfico 11: Avaliação do nível de EROS intracelulares após 24 h de tratamento com os Compostos. ............................................................................................................................... 92 Gráfico 12: Gráfico 12: Avaliação do nível de produção de EROS em PBMC............... 93 Gráfico 13: Inibição da produção de EROS intracelular pelo NAC nas células HL-60 tratadas com C2 ou C3............................................................................................................ 94 Gráfico 14: Efeito do NAC sobre a citotoxicidade do C2 (A) e C3 (B) nas células HL-60. ..................................................................................................................................................... 95 Gráfico 15: Efeito do NAC na indução da apoptose nas células HL-60. ......................... 96 Gráfico 16: Participação das MAPKs na inibição da proliferação celular induzido pelos compostos. ................................................................................................................................ 98 vii Lista de Tabelas Tabela 1: Classificação Franco-Americo-Britanico dos vários subgrupos de Leucemia Mielóide Aguda. ........................................................................................................................ 23 Tabela 2: Sequencia dos primers utilizados na realização de PCR em K562. .............. 65 Tabela 3: Anticorpos primários e secundários usados na técnica de Western Blot, e respectivas diluições. ............................................................................................................... 66 Tabela 4: Atividade citotóxica em IC50 dos compostos e etoposideo (ETO) em linhagens de câncer humano e normais. .............................................................................. 70 Tabela 5: Efeito dos triazóis (C2 e C3) sobre a distribuição do ciclo celular em K562. 76 Tabela 6: Efeito dos triazóis (C2 e C3) sobre a distribuição do ciclo celular em HL-60. ..................................................................................................................................................... 77 viii Lista de Abreviaturas ABL: Abelson leucemia vírus AIF: Fator de indução da apoptose APAF: Apoptotic protease activating factor ASXL1: Additional sex combs like transcriptional regulator 1 ATP: Adenosine triphosphate BAX: Bcl2-associated X Bcl-2: B-cell lymphoma 2 BCR: Breakpoint cluster region BSA: Albumina de soro bovina CDKIs: Inibidores de CDKs CDKs: Quinases dependente de ciclinas CEBPA: CCAAT/enhancer-binding protein alpha CMA: autofagia mediada por chaperoninas CTHs: Células-tronco hematopoiéticas DCF: Diclorofluoresceina DMSO: Dimetilsulfoxido DNA: Acido desoxiribonucleico DTT: Ditiotreitol EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético ERK: Quinases reguladas por sinais externos EROS: Espécies reativas de oxigênio FAB: Sistema franco-americo-britânico FLT3: FMS-like tyrosina quinase 3 H2O2: Peróxido de hidrogênio Hsc70: Heat shock chaperone 70 ix IAF: Fator de inibição da apoptose IP: Iodeto de propídeo Kv1.3: Canal de potássio dependente de voltagem, tipo 1.3 LLA: Leucemia linfóide aguda LLC: Leucemia linfóide crônica LMA: Leucemia mielóide aguda LMC: Leucemia mielóide crônica MAPKs: Proteínas quinases ativadas por mitogênos MDR: Resistência a multidroga MTT: Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio NAC: N-acetil cisteina NPM1: Nucleophosmin PBMC: Células mononucleares do sangue periférico PBS: Tampão fosfato salina PD98059: inibidor de ERK PTP: Poro de permeabilidade transitório RNA: Acido ribonucleico SB203580: inibidor de p38 MAPK SDS: Dodecilsulfato de sódio SBF: Soro bovino fetal TBS-T: Tampão salina de tris TGF-β: Tumor growth factor β TMRM: Tetrametilrodamina metil ester TNF: Fator de necrose tumoral TNFR1: Fator de necrose tumoral receptor 1 WT1: Wilms tumor 1 x COULIDIATI, T.H. Avaliação dos efeitos anticancerígenos dos 1,2,3-triazóis derivados do núcleo 1,4-naftoquinona em linhagens leucêmicas humanas. 2014. 129f. Tese de Doutorado – Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa. Resumo O núcleo triazol e seus derivados têm atraído uma atenção considerável nessas últimas décadas devido ao seu potencial quimioterápico. Mais especificamente, tem se verificado o interesse em moléculas que contêm o grupo 1,2,3-triazol, isto porque esta classe de heterocíclicos é conhecida por exibir uma vasta gama de atividades biológicas, tais como, anti-proliferativo e anti-neoplásico. O objetivo desse trabalho foi o de avaliar o potencial anticancerígeno de novos triazóis derivados do 1,4-naftoquinona, elucidando as suas citotoxicidades e o mecanismo de morte envolvido. Os resultados obtidos revelaram que, das cinco linhagens cancerígenas testadas, as linhagens leucêmicas HL-60 e K562 foram as mais sensíveis, e dentre os oito compostos (denominados C1 a C8) testados, C2 e C3 foram os mais citotóxicos, apresentando CI50 de 14 μM e 41 μM, em HL-60 e de 24 μM e 81 μM em K562, respectivamente. Entretanto, os compostos foram menos citotóxicos nas células normais do sangue periférico humano com CI50 acima 80 μM. Investigando o tipo de morte induzido pelos compostos nas duas linhagens, foi demonstrado que os compostos C2 e C3 induziram apoptose em HL-60. Já nas células K562, este dois derivados provocaram a parada do ciclo celular na fase S e necrose. A parada do ciclo celular na fase S em K562 foi relacionada com a expressão do gene p21. Foi revelado a diminuição da expressão da proteína Bcl-2 e o aumento da expressão da proteína BAX nas células HL-60, e ainda verificou-se a liberação do citocromo c sugerindo a participação da via intrínseca na indução da apoptose em HL-60. A ativação dessa via pode ser via inibição da fosforilação da proteína ERK. Os resultados mostraram também que durante uma hora de pré-tratamento das células HL-60 com o N-acetil cisteina (1 mM), houve a redução da citotoxicidade dos compostos C2 e C3 de 30,83% e 26,47% respectivamente; indicando que a indução da apoptose em HL-60 é mediada pelo aumento da produção das espécies reativas de oxigênio intracelulares. Dessa forma, pode-se concluir que os compostos C2 e C3 apresentaram efeitos citotóxicos frente às linhagens HL-60 e K562, então, podem ser considerados como protótipo de moléculas anti-leucêmicas. Palavras chave: Apoptose; Ciclo celular; Citotoxicidade; Citometria de fluxo; EROS; Leucemia mielóide; 1,2,3-triazol-1,4-naftoquinonas. xi COULIDIATI, T.H. Evaluation of anticancer effects of 1,2,3-triazoles derivates to the nucleus 1,4-naphthoquinone in human leukemic cell lines. 2014. 129f. PhD thesis. Federal University of Paraíba – João Pessoa. Abstract The triazole nucleus and its derivatives have attracted considerable attention in recent decades for their chemotherapeutic potentials. Specifically, the interest in molecules containing the 1,2,3-triazole as chemotherapeutic agents for various diseases has increased, because they are known to exhibit a wide range of biological activities, such as anti-proliferative and anti-neoplastic. The aim of this study was to evaluate the potencial anti-cancer effect of new triazole derivatives from 1,4-naphthoquinone, elucidating their cytotoxicity and cell death mechanisms involved. From five cancer cell lines tested, leukemic cells (HL-60 and K562) were the most sensitive, and between the eight triazole compounds tested (called C1 to C8), compounds C2 and C3 showed the best IC50 of 14 μM and 41 μM for HL-60 cells and 24 μM and 81 μM for K562 cells, respectively. However, these two compounds showed very little cytotoxic effect towards PBMC normal cells with IC50 superior to 80 μM. Investigating the type of cell death induced by compounds C2 and C3, it was showed that compounds induced apoptosis in HL-60 cells and cell cycle arrest in the S-phase, and necrosis in K562 ones. Cell cycle arrest in S phase was related to the expression of the p21 gene in K562. Results revealed a reduced expression of Bcl-2 protein and an increased expression of BAX protein in HL-60 cells. Moreover, it was found cytochrome c release, suggesting involvement of the intrinsic pathway in apoptosis induction in these cells. Activation of this pathway may be through inhibition of ERK phosphorylation. Our results also showed that pre-treatment of HL-60 cells with N-acetyl cysteine (1 mM) for 1 hour reduced the cytotoxic effect of compounds C2 and C3 for 30,83% and 26,47% respectively; indicating that the induction of apoptosis in HL-60 is mediated by increased production of intracellular ROS. Thus, it can be concluded that C2 and C3 compounds showed cytotoxic effects on HL-60 and K562 cells, so, can be considered as prototype anti-leukemic molecules. Keywords: Apoptosis; Cell cycle; Cytotoxicity; Flow cytometry; Myeloid leukemia; ROS; 1,2,3-triazole-1,4-naphthoquinones. xii Sumário 1. Introdução .......................................................................................................................... 16 1.1 Tumor ............................................................................................................................. 16 1.2 Câncer ............................................................................................................................ 16 1.2.1 Definição ................................................................................................................ 16 1.2.2 A transformação maligna .......................................................................................... 17 1.2.3 As características do câncer..................................................................................... 18 1.3 Epidemiologia do câncer .................................................................................................. 19 1.4 Leucemia ............................................................................................................................. 21 1.4.1 Leucemia mielóide aguda ......................................................................................... 22 1.4.2 Leucemia mielóide crônica........................................................................................ 23 1.5 Ciclo celular ........................................................................................................................ 25 1.5.1 Divisão celular ............................................................................................................. 25 1.5.2 Sistema de controle do ciclo celular ........................................................................ 27 1.6 Morte celular ....................................................................................................................... 29 1.6.1 Autofagia ...................................................................................................................... 30 1.6.2 Senescência ................................................................................................................ 31 1.6.3 Mitose catastrófica ..................................................................................................... 31 1.6.4 Necrose ........................................................................................................................ 32 1.6.5 Apoptose ...................................................................................................................... 33 1.6.5.1 Alterações morfológicas e bioquímicas da apoptose. ................................... 34 1.6.5.2 Mecanismo da apoptose .................................................................................... 35 1.7 Mitocôndria ......................................................................................................................... 37 1.8 Sinalização celular em modelos de câncer ................................................................... 39 1.9 Espécies reativas de oxigênio ......................................................................................... 40 1.10 Quimioterapia do câncer ................................................................................................ 42 1.11 Derivados triazóis de quinonas ..................................................................................... 44 1.11.1 Naftoquinonas ........................................................................................................... 44 1.11.2 1,2,3-triazóis .............................................................................................................. 45 1.11.2.1 Estrutura e síntese ............................................................................................ 45 1.11.2.2 Efeitos farmacológicos ..................................................................................... 47 xiii 2. Objetivos ............................................................................................................................ 50 2.1 Objetivo geral ..................................................................................................................... 50 2.2 Objetivos específicos ........................................................................................................ 50 3. Material e Métodos ........................................................................................................... 51 3.1 Material ................................................................................................................................ 51 3.1.1 Equipamentos ............................................................................................................. 51 3.1.2 Reagentes e compostos utilizados .......................................................................... 52 3.1.3 Soluções ...................................................................................................................... 52 3.1.4 Compostos estudados ............................................................................................... 53 3.1.5 Linhagens celulares ................................................................................................... 54 3.1.5.1 Linhagens leucêmicas (HL-60, K562, K562-Lucena) .................................... 54 3.1.5.2 Linhagens de adenocarcinoma de mama (MCF-7) e de cólon (HT-29) ..... 55 3.1.5.3 Células do sangue periférico (PBMC) .............................................................. 55 3.2 Métodos ............................................................................................................................... 56 3.2.1 Teste de viabilidade preliminar das culturas celulares ......................................... 56 3.2.2 Teste de viabilidade celular pelo método colorimétrico do MTT ......................... 57 3.2.3 Ensaio da integridade da membrana plasmática por citometria ......................... 58 3.2.4 Análise do ciclo celular por citometria ..................................................................... 58 3.2.5 Avaliação da fragmentação do DNA ....................................................................... 59 3.2.5.1 Extração do DNA................................................................................................. 59 3.2.5.2 Eletroforese em gel de agarose ........................................................................ 59 3.2.6 Análise da condensação da cromatina por microscopia de fluorescência ........ 60 3.2.7 Avaliação do potencial da membrana mitocondrial por citometria ..................... 60 3.2.8 Teste da externalização da fosfatidilserina por citometria ................................... 61 3.2.9 Análise da externalização da fosfatidilserina por microscopia de fluorescência ................................................................................................................................................. 62 3.2.10 Avaliação da produção das espécies reativas de oxigênio ............................... 62 3.2.11 Análise da expressão relativa do gene p21. ........................................................ 63 3.2.12 Análise da expressão de proteínas por Western blot ......................................... 65 3.2.12.1 Preparo das amostras ...................................................................................... 65 3.2.12.2 Dosagem de proteína (Método de Bradford): ............................................... 65 3.2.12.3 Eletroforese e electrotransferência ................................................................ 65 3.2.12.4 Imunodeteção de proteínas com anticorpos específicos............................ 66 3.2.13 Análise de proteínas intracelulares por citometria de fluxo ............................... 67 xiv 3.3 Análise estatística .............................................................................................................. 68 4. Resultados ......................................................................................................................... 69 4.1 Efeito citotóxico dos compostos ...................................................................................... 69 4.2 Análise da viabilidade celular pela avaliação da integridade da membrana celular. ..................................................................................................................................................... 71 4.3 Efeito dos compostos no ciclo celular ............................................................................ 75 4.4 Avaliação do dano do material genético ........................................................................ 79 4.5 Efeito dos compostos na despolarização do potential da membrana mitocondrial 81 4.6 Avaliação da exteriorização da fosfatidilserina ............................................................. 84 4.7 Avaliação da expressão do RNAm do p21 .................................................................... 87 4.8 Análise da expressão das proteínas BAX e Bcl-2 ........................................................ 88 4.9 Avaliação da via de indução da apoptose em HL-60 ................................................... 89 4.10 Nível de EROS intracelulares e efeito do NAC ........................................................... 91 4.11 Investigação da via de MAPK ........................................................................................ 97 Discussão ................................................................................................................................ 100 Conclusão ................................................................................................................................ 111 Referências bibliográficas ..................................................................................................... 112 xv 1. Introdução 1.1 Tumor Em Patologia, tumor é qualquer massa anômala observada nos tecidos. Se a massa, formada por células, apresenta uma taxa de crescimento persistente e que ultrapassa a taxa de crescimento dos tecidos normais, definese uma neoplasia. As neoplasias são classificadas em benignas e malignas. Enquanto neoplasias benignas tendem a crescer de maneira circunscrita ao seu tecido de origem; neoplasias malignas caracterizam-se pelo crescimento invasivo e sua disseminação por vasos sanguíneos ou linfáticos, dando origem às metástases. As neoplasias malignas são conhecidas como cânceres (HANAHAN & WEINBERG, 2000). 1.2 Câncer 1.2.1 Definição O câncer é o termo usado para designar um conjunto de mais de uma centena de enfermidades caracterizadas pela proliferação descontrolada de células somáticas, o que leva à formação de um tecido anormal (RIBEIRO & FREIRE-MAIA, 2002). Ou seja, é nada mais que uma expansão clonal incessante de células somáticas que, invadindo, subvertendo e corroendo os tecidos normais, provoca a morte do mesmo (EVAN & VOUSDEN, 2001). O câncer é uma doença genética complexa, que é causado principalmente por fatores ambientais. Os agentes causadores do câncer (carcinógenos) podem estar presentes nos alimentos, na água, no ar, nos produtos químicos e na luz solar, por causa dos raios ultravioletas (ALISON, 2001). 16 1.2.2 A transformação maligna A transição de uma célula normal para o estado transformado, ou tumoral, é devida principalmente a uma combinação de eventos genéticos. Especificamente, a transformação maligna é devido a uma acumulação de mutações aleatórias e espontâneas em genes diferentes (normalmente mais de dez) dentro da mesma linhagem celular (LOWE et al., 2004). Essa transformação maligna precisa ser codificada de forma estável de modo que os eventos ontogênicos possam acumular-se nas linhagens clonais. Os mecanismos de mutações genéticas como as alterações, as inserções, as deleções e as recombinações são capazes de induzir mudanças fenotípicas persistentes a uma célula transformada. Por esta razão, o câncer tem sido visto como uma doença baseada principalmente na genética (PONDER, 2001; HAHN & WEINBERG, 2002). No entanto, os eventos genéticos ocorrem em baixa frequência e não são, portanto, um dispositivo particularmente eficaz para a transformação maligna. Também, algumas células superam a transformação maligna por meio da aquisição de processo de reparo do defeito do DNA. Os mecanismos de controle epigenético oferecem via alternativa a partir da aquisição de características ontogênicas estáveis. Os eventos epigenéticos são flexíveis e podem persistir devido às múltiplas divisões celulares, exercendo efeitos poderosos sobre o fenótipo celular (SHEN & LAIRD, 2012; DAWSON & KOUZARIDES, 2012). Embora as células cancerosas sofram alterações epigenéticas, as análises genômicas e epigenômicas revelaram recentemente a ocorrência generalizada de mutações nos reguladores epigenéticos de células cancerosas (YOU & JONES, 2012). Assim, os mecanismos genéticos e epigenéticos influenciam uns aos outros (YOU & JONES, 2012) e colaboram para permitir a aquisição dos dez principais balizamentos do câncer definidos na Figura 1 (HANAHAN & WEINBERG, 2011). 17 1.2.3 As características do câncer As células malignas atingem o fenótipo tumoral, em grande parte, pela reativação e modificação de muitos programas celulares existentes normalmente, que são utilizados durante o desenvolvimento celular. Esses programas controlam processos coordenados, tais como a proliferação, a migração, a polaridade, a apoptose e a diferenciação durante o desenvolvimento embrionário e a homeostase do tecido (LUO et al., 2009). Assim, danos nesses programas importantes podem resultar, para a célula e a sua progenitora, numa vantagem seletiva sobre as células vizinhas e, desse modo, numa vantagem proliferativa (LOWE et al., 2004). A célula cancerosa resultante evolui devido às alterações genéticas, seguido da seleção clonal das células anormais que podem sobreviver e proliferar em circunstâncias que, normalmente conduziriam a morte celular (LUO et al., 2009; STRATTON et al., 2009). Os tumores são diversos e heterogêneos, mas todos compartilham a capacidade de proliferar, além das restrições que limitam o crescimento do tecido normal. A falta de regulação de um número restrito de vias principais que controlam a proliferação e a sobrevivência da célula é obrigatória para o estabelecimento de todos os cânceres (EVAN & VOUSDEN, 2001). Como ilustrado na Figura 1, o câncer surge por causa de várias etapas do processo mutagênico nos quais as células cancerosas adquirem um conjunto comum de propriedades, incluindo o potencial ilimitado de proliferação, a auto-suficiência em sinais de crescimento e a resistência aos sinais antiproliferativos e apoptóticos (HANAHAN & WEINBERG, 2000; 2011). 18 Figura 1: Capacidade biológica adquirida por células cancerosas durante o processo de tumorigênese. (Adaptado de HANAHAN & WEINBERG, 2011) 1.3 Epidemiologia do câncer O câncer é um importante problema de saúde pública em países desenvolvidos e em desenvolvimento, sendo responsável por mais de seis milhões de óbitos a cada ano, representando cerca de 12% de todas as causas de morte no mundo. Embora as maiores taxas de incidência de câncer sejam encontradas em países desenvolvidos, dos dez milhões de casos novos anuais de câncer, cinco milhões e meio são diagnosticados nos países em desenvolvimento (OMS, 2002). De acordo com os dados epidemiológicos do câncer, um número estimado de 14,1 milhões de novos casos de câncer e 8,2 milhões de mortes 19 relacionadas ao câncer ocorreu em 2012, em comparação com 12,7 milhões e 7,6 milhões, respectivamente, em 2008. As estimativas de prevalência para 2012 mostram que houve 32,6 milhões de pessoas, com idade superior a 15 anos, vivas que tiveram um câncer diagnosticado nos últimos cinco anos (FERLAY et al., 2013). Os cânceres mais comumente diagnosticados em todo o mundo foram os de pulmão (1,8 milhões, 13,0% do total), de mama (1,7 milhões, 11,9%), e do cólon (1,4 milhões, 9,7%). As causas mais comuns de morte por câncer foram os cânceres de pulmão (1,6 milhões, 19,4% do total), fígado (0,8 milhão, 9,1%) e estômago (0,7 milhão, 8,8%) (FERLAY et al., 2013). Projeções com base nas estimativas GLOBOCAN 2012 prevêem um aumento substancial de 19,3 milhões de novos casos de câncer por ano até 2025, devido ao crescimento e envelhecimento da população global. Mais da metade de todos os cânceres (56,8%) e mortes por câncer (64,9%), em 2012 ocorreram em regiões menos desenvolvidas do mundo, e essas proporções irão aumentar ainda mais em 2025 (Ferlay et al., 2013). As leucemias foram relatadas na nona e na décima posições, dentre os cânceres comuns em homens e mulheres, respectivamente (JEMAL et al., 2011). Acometem indivíduos de todas as idades e raças, entretanto mais de 50% dos casos ocorrem até os 20 anos de idade, apesar de ser a forma mais comum de leucose no adulto e compreender 10-15% dos casos de leucemia aguda na infância. Esta patologia é rara acima dos 80 anos de idade. Verificase predomínio na raça branca e 60% dos casos são no sexo masculino (OLANIYI & UMAR, 2013). Tem sido relatado que indivíduos com síndrome de Down, síndrome de Patau, anemia de Fanconi, síndrome de Kostmann, síndrome de Bloom, síndrome de Klinefelter, neurofibromatose, hemoglobinúria paroxística noturna, policitemia vera, síndromes mielodisplásicas têm predisposição de desenvolver leucemias (RAJABLI et al., 2013). Fatores ambientais como certos agentes químicos (pesticidas, herbicidas, benzeno, borracha, fumo, tintas, derivados de petróleo, óxido de etileno) ou fármacos (cloranfenicol, fenilbutazona, cloroquina), exposição laborial ou acidental à radiação ionizante, radioterapia e quimioterapia no tratamento de neoplasias prévias, infecções virais (principalmente pelo EBV, 20 HIV e HTLV-1) também predispõem ao aparecimento das leucemias agudas (RAJABLI et al., 2013). 1.4 Leucemia O sistema hematopoiético é organizado a partir de uma hierarquia mantida por células-tronco hematopoiéticas raras (CTHs), que se auto-renovam e se diferenciam para produzir linhagens sanguíneas maduras, garantindo a produção de sangue durante o tempo da vida do organismo (WARNER et al., 2005). As CTHs dão origem a um grupo de células progenitoras que não têm mais o papel de se auto-renovar, que por sua vez dão origem as células que são mais limitadas nos seus potenciais de diferenciação, e finalmente para células maduras funcionais (PASSEGUÉ et al., 2003). Quando os sinais que regem esses processos normais tornam-se desregulados, as leucemias resultam em um acúmulo de células blásticas imaturas, que não conseguem se diferenciar em células funcionais (WARNER et al., 2005). A célula, em que os eventos de transformação acontecem, é desconhecida para a maioria dos tipos de cânceres, mas certos tipos de leucemias surgem devido às mutações que se acumulam nas CTHs (PASSEGUÉ et al. 2003). Assim, a leucemia é uma doença heterogênea, em nível molecular, resultante de uma variedade de alterações de numerosos genes importantes para o crescimento celular, a diferenciação e a morte celular (LI et al., 2005). As leucemias incluem quatro principais subtipos, descritos pela maioria dos registros de câncer. Esses quatros subtipos são: a Leucemia Mielóide Aguda (LMA), a Leucemia Mielóide Crônica (LMC), a Leucemia Linfóide Aguda (LLA), e a Leucemia Linfóide Crônica (LLC) (XIE et al., 2003). 21 1.4.1 Leucemia mielóide aguda A leucemia mielóide aguda (LMA) é caracterizada pela acumulação de grandes números de células anormais que não conseguem diferenciar-se em granulócitos ou monócitos (BONNET & DICK, 1997). A LMA é uma doença fenotipicamente e geneticamente heterogênea que pode se classificar de M0 a M7 (Tabela 1), de acordo com a classificação FAB (sistema Franco-AmericoBritânico). Grande progresso tem sido feito para compreender os mecanismos de leucemogênese na LMA. Uma das hipóteses mais relevante é a implicação das células-tronco hematopoiéticas primitivas ou as células progenitoras capazes de se transformar numa célula-tronco leucêmica, que mantém a capacidade de se auto-renovar (RENNEVILLE et al., 2008). As duas características fundamentais da LMA, incluem a proliferação desregulada e a sobrevivência celular por ativação dos oncogenes ou desativação dos genes supressores de tumores e o bloqueio da diferenciação causada pela redução da função dos fatores de transcrição, que são especificamente importantes para a diferenciação terminal das linhagens celulares derivadas da célula progenitora mielóide comum (RECKZEH et al., 2012). Tem sido proposto que, de acordo com os seus papéis na patogênese, as anormalidades genéticas de leucemia podem ser agrupadas em duas categorias: (1) mutações que envolvem as vias de transdução de sinal, dando origem às vantagens proliferativas para clones da leucemia (classe I); (2) aquelas que afetam os fatores de transcrição ou cofatores e prejudicam a diferenciação (classe II). Várias mutações genéticas foram descobertas em pacientes com LMA sem marcadores citogenéticos, e essas anormalidades foram consideradas como pertencentes à classe I, como exemplo as mutações nos genes C-KIT, FLT3 e NRAS ou classe II, como exemplo as mutações nos genes NPM1, CEBPA, WT1 e ASXL1 (SHEN et al., 2011). 22 Tabela 1: Classificação Franco-Americo-Britanico dos vários subgrupos de Leucemia Mielóide Aguda. Classificação LMA Descrição M0 Mieloblástica M1 Mieloblástica sem maturação M2 Mieloblástica com maturação M3 Promielocítica hipergranular M3 variante Promielocítica microgranular M4 Mielomonocítica M4 Eo Mielomonocítica com eosinofilia M5 Monocítica M5A Monocítica pouco diferenciada M5B Monocítica bem diferenciada M6 Eritroleucemia M7 Megacariocítica 1.4.2 Leucemia mielóide crônica A leucemia mielóide crônica (LMC) é uma doença clonal maligna caracterizada por uma excessiva proliferação da linhagem mielóide (Fase Crônica), seguida por uma perda progressiva da diferenciação celular (Fase Acelerada) e terminando num quadro de leucemia aguda (Fase Blástica). A doença é associada a uma anormalidade citogenética específica conhecida como cromossomo Philadelphia (Ph). O cromossomo Ph ocorre em mais de 90% dos casos de LMC. Embora observado em outras leucemias e até mesmo em condições neoplásicas não hematopoéticas, ele é reconhecido como marcador citogenético da LMC e sua detecção tem implicações no diagnóstico, prognóstico e na terapêutica da doença (CHEN et al., 2010; BERGANTINI et al., 2005). O cromossomo Ph resulta de uma translocação recíproca entre os braços longos dos cromossomos 9 e 22. Esta translocação t(9;22)(q34;q11) 23 justapõe o oncogene ABL (Abelson Leukemia Vírus), mapeado no cromossomo 9, ao gene BCR (Breakpoint Cluster Region) mapeado no cromossomo 22. (Figura 2). Em condições normais, o gene BCR codifica uma proteína com função relacionada à regulação do ciclo celular, enquanto o gene ABL codifica uma proteína tirosina quinase. A oncoproteína quimérica resultante da fusão (BCR-ABL) apresenta uma atividade tirosina-quinase elevada, responsável pela patogênese da doença (BERGANTINI et al., 2005; DEININGER et al., 2000). O neogene BCR-ABL é o responsável pelo processo molecular que determina a transformação da célula progenitora hematopoética normal em maligna. A célula leucêmica com o gene BCR-ABL apresenta uma mieloproliferação contínua resultante, provavelmente, de três mecanismos principais: a alteração da adesão das células progenitoras com as células estromais e da matriz extracelular; a manutenção do sinal mitogênico constante e a resistência à apoptose celular. A tirosina-quinase BCR-ABL confere à célula leucêmica uma alta resistência à morte celular independentemente do agente indutor deste processo. Contudo, esses mecanismos de resistência, que favorecem o crescimento e a vantagem proliferativa das células com o cromossomo Ph em relação às células normais, não foram totalmente elucidados (BERGANTINI et al., 2005; MUGHAL et al., 2007). 24 Figura 2: Localização dos pontos de interrupção nos genes ABL e BCR e a estrutura dos RNAm quiméricos resultantes. (Fonte: DEININGER et al., 2000) 1.5 Ciclo celular 1.5.1 Divisão celular A divisão celular ocorre por uma série de eventos bem elaborados, em que os cromossomas e outros componentes são duplicados e uniformemente distribuídos em duas células filhas. É um processo altamente ordenado e bem regulado, que provoca uma mudança irreversível e unidireccional no estado da célula (PINHEIRO & SUNKEL, 2012). Essas reações bioquímicas complexas ocorrem em um período de cerca de 24 horas, dependendo do tipo de célula, sendo denominado ciclo celular (GARAY et al., 2003). Originalmente, a divisão celular foi dividida em duas fases: a mitose (M), o processo de divisão nuclear, e a interfase, o intervalo entre duas fases M. As etapas da mitose incluem a prófase, a metáfase, a anáfase e a telófase. Ao microscópio, as células de interfase aumentam de tamanho, mas com diferentes técnicas revelaram que a 25 interfase inclui as fases G1, S e G2. A replicação do DNA ocorre numa parte específica da interfase chamada fase S. A fase S é precedida pela fase G1 durante a qual a célula se prepara para a síntese do DNA e é seguido pela fase G2 durante a qual a célula se prepara para a mitose. As fases G1, S, G2 e M são as subdivisões tradicionais de um ciclo celular normal (Figura 3). Células em G1 podem, antes da replicação do DNA, entrar em um estado de repouso chamado G0 (VERMEULEN et al., 2003). Nas células normais, a progressão do ciclo celular pode ser controlada em resposta a diversos estímulos mitogénicos e anti-mitogénicos, o que resulta na modulação de diversos mecanismos moleculares. As diferentes cascatas de sinalização podem regular as proteínas do ciclo celular, a expressão de genes, as modificações pós-traducionais e a degradação de proteínas. Figura 3: Representação esquemática do ciclo celular da mitose. Fonte: WWW.google.com.br/ciclocelular 26 1.5.2 Sistema de controle do ciclo celular A transição de uma fase do ciclo celular para outro ocorre de forma ordenada e é regulada por diferentes proteínas celulares. As principais proteínas reguladoras são as quinases dependentes das ciclinas (CDKs), que são uma família de proteínas serina/treonina quinases ativadas em pontos específicos do ciclo celular. Até agora, nove CDKs foram identificadas e, dessas, cinco são ativas durante o ciclo celular. Entre elas temos as CDK4, CDK6 e CDK2 ativas durante a fase G1, a CDK2 ativa durante a fase S e a CDK1 ativa na fase G2 e M (Figura 4). Os níveis de proteínas CDK permanecem estáveis durante o ciclo celular, em contraste com as suas proteínas de ativação, as ciclinas. As ciclinas são sintetizadas e destruídas em períodos específicos durante o ciclo celular, regulando assim a atividade das quinases de uma forma conveniente. Diferentes ciclinas são necessárias nas diferentes fases do ciclo celular. As três ciclinas de tipo D (ciclina D1, ciclina D2, ciclina D3) se ligam às CDK4 e CDK6, e os complexos CDK-ciclina D são essenciais para a entrada na fase G1. Ao contrário das outras ciclinas, a ciclina D não é expressa constitutivamente, mas é induzida, enquanto a estimulação pelos fatores de crescimento persistir. Outra ciclina do G1 é a ciclina E, que se associa com CDK2 para regular a progressão do ciclo da fase G1 para a fase S. A ciclina A se liga com CDK2 e esse complexo é necessário durante a fase S. No final da interfase (fase G2), a ciclina A se complexa com CDK1 para promover à entrada na fase M. A mitose é ainda regulada pela ciclina B em complexo com CDK1 (VERMEULEN et al. 2003; SCHWARTZ & SHAH, 2005; HOCHEGGER et al., 2008; MALUMBRES & BARBACID, 2009). Além da ligação com as ciclinas, a atividade de CDK é também regulada por fosforilação em resíduos treonina e tirosina conservados. A ativação completa de CDK1 requer a fosforilação da treonina 161 (treonina 172 em CDK4 e treonina 160 em CDK2). Essas fosforilações induzem alterações conformacionais e reforçam a ligação das ciclinas. As proteínas quinases Wee1 e Myt1 fosforilam a CDK1 na tirosina-15 e/ou treonina-14, inativando assim a quinase. A desfosforilação nestes locais pela enzima Cdc25 é necessária para 27 a ativação da CDK1 e a progressão através do ciclo celular (VERMEULEN et al. 2003). A atividade de CDK pode ser neutralizada por proteínas inibidoras do ciclo celular, chamadas inibidores de CDK (CDKIs), que se ligam a CDK sozinha ou no complexo CDK-ciclina e regulam sua atividade. Duas famílias distintas de CDKIs foram descobertas, a família INK4 e a família Cip/Kip. A família INK4 inclui p15 (INK4b), p16 (INK4a), p18 (INK4c), p19 (INK4d), que especificamente inativam as CDKs da fase G1 (CDK4 e CDK6). Estes CDKIs formam complexos estáveis com a enzima CDK, antes da ligação da ciclina, impedindo a associação com a ciclina D. A segunda família de inibidores, a família Cip/Kip, que inclui p21 (WAF1, CIP1) e p27 (CIP2), p57 (Kip2). Estes inibidores inibem os complexos CDK-ciclina da fase G1, e, em menor grau, o complexo CDK1-ciclina B. As CDKIs são reguladas tanto por sinais internos e externos: a expressão de p21 está sob o controle transcricional do gene supressor de tumor p53. O promotor do gene de p21 contém um sítio de ligação à p53, o que permite que p53 transcricionalmente ative o gene p21. A expressão e ativação de p15 e p27 aumentam em resposta ao fator de transformação do crescimento β (TGF-β), contribuindo para a parada do crescimento (VERMEULEN et al. 2003; MALUMBRES & BARBACID, 2009). 28 Figura 4: O processo de controle do ciclo celular. A progressão através do ciclo celular é promovida pelas quinases dependentes de ciclinas (CDK), que são reguladas positivamente ou negativamente pelas ciclinas e pelos inibidores de CDK (CDKIs). O ponto de restrição é o ponto em que as células progridem através do ciclo celular independente de estímulos externos (Fonte: SCHWARTZ & SHAH, 2005). 1.6 Morte celular As células dos organismos multicelulares são membros de uma comunidade altamente organizada. O número de células na comunidade é fortemente regulado, não apenas pelo controle da taxa de divisão celular, mas também pelo controle da taxa de morte celular. Sabe-se que o desenvolvimento e a manutenção dos organismos dependem da interação entre as células que o constituem. A morte celular é um processo fundamental durante esses processos fisiológicos. Ela acontece naturalmente durante o 29 desenvolvimento e o envelhecimento e também como um mecanismo homeostático para manter a população celular nos tecidos (ZIEGLER & GROSCURTH, 2004). Durante muito tempo, a morte celular foi considerada como um processo passivo de caráter degenerativo, que ocorre em situações de lesão celular, infecção e ausência de fatores de crescimento. Como consequência, a célula altera a integridade de sua membrana plasmática, aumenta o seu volume e perde as suas funções metabólicas. Entretanto, nem todos os eventos de morte celular são processos passivos. Os organismos multicelulares são capazes de induzir a morte celular programada ou regulada como resposta a estímulos intracelulares ou extracelulares. Os processos de morte celular podem ser classificados de acordo com suas características morfológicas e bioquímicas em: autofagia, senescência, mitose catastrófica, necrose, e apoptose (EDINGER & THOMPSON, 2004; GRIVICICH et al., 2007). 1.6.1 Autofagia A autofagia é um mecanismo catabólico que envolve a degradação de componentes celulares de células desnecessárias ou disfuncionais por meio dos lisossomos. Durante a autofagia, porções do citoplasma e das organelas são encapsuladas por membrana, originando estruturas denominadas autofagossomos. Estes irão se fusionar com os lisossomos. A seguir, o conteúdo dos autofagossomos será degradado pelas hidrolases lisossomais (KROEMER et al., 2010; MAIURI et al., 2007). No contexto da doença, a autofagia tem sido vista como uma resposta adaptativa para a sobrevivência, enquanto que, em outros casos, parece promover a morte celular. “A morte celular autofágica” é morfologicamente definida (especialmente por microscopia eletrônica de transmissão) como um tipo de morte celular que ocorre na ausência de condensação da cromatina, mas acompanhada por uma vacuolização autofágica massiva do citoplasma (Figura 5d) (JANKU et al., 2011; KROEMER et al., 2010). A autofagia é um processo adaptativo conservado evolutivamente e controlado geneticamente. Ela é um processo altamente regulado que pode estar envolvido na eliminação de proteínas de longa duração e todas as 30 organelas de uma forma generalizada ou visar especificamente organelas distintas. Existem três formas diferentes de autofagia que são comumente descritas; a macro-autofagia, a micro-autofagia e a “chaperone-mediated” autofagia (CMA). A macro-autofagia é a via principal, ocorrendo principalmente para erradicar organelas celulares danificadas ou proteínas não utilizadas. A micro-autofagia, por outro lado, envolve a imersão direta do material citoplasmático para o lisossomo. CMA é uma via muito complexa e específica, a qual envolve o reconhecimento pelo complexo contendo hsc70 (GLICK et al., 2010; GRIVICICH et al., 2007; JANKU et al., 2011). 1.6.2 Senescência A senescência é caracterizada pela parada irreversível do crescimento das células na fase G1 do ciclo celular. Morfologicamente, as células em senescência são maiores em tamanho e possuem maior granularidade. Ela é um processo metabólico ativo essencial para o envelhecimento. Ocorre por meio de uma programação genética que envolve deterioração dos telômeros e ativação de genes supressores tumorais. As células que entram em senescência perdem a capacidade proliferativa após um determinado número de divisões celulares (COLLADO & SORRANO, 2004; MOOI & PEEPER, 2006; SARETZKI, 2010). 1.6.3 Mitose catastrófica A mitose catastrófica é um processo passivo; porém, alguns estudos sugerem que ela também pode apresentar uma regulação genética. A mitose catastrófica envolve uma mitose aberrante que pode ser acompanhada de uma segregação cromossômica errônea, resultando em alterações morfológicas na célula como a micronucleação (que muitas vezes resulta de cromossomos e/ou fragmentos de cromossomos que não foram distribuídos igualmente entre os núcleos filhos) e multinucleação (a presença de dois ou mais núcleos com tamanhos semelhantes ou heterogêneas, que derivam de uma separação deficiente durante a citocinese). A mitose catastrófica pode levar tanto a uma morfologia apoptótica ou à necrose. Por isso, ela não é considerada como uma forma de morte por alguns autores, mas sim uma sinalização irreversível para a 31 morte (CASTEDO et al., 2004; GALLUZZI et al., 2012; GRIVICICH et al., 2007; KROEMER et al., 2009). 1.6.4 Necrose A necrose é o resultado final de uma catástrofe bioenergética decorrente da degradação do ATP a um nível incompatível com a sobrevivência da célula. A necrose pode ser iniciada principalmente por agentes tóxicos ou danos físicos. Ela é caracterizada morfologicamente por vacuolização do citoplasma, quebra da membrana plasmática e uma indução de inflamação ao redor da célula atribuível à liberação do conteúdo celular e moléculas pró-inflamatória. As células que morrem por necrose frequentemente exibem alterações na morfologia nuclear, mas não a condensação da cromatina e a fragmentação organizada do DNA em fragmentos de 200 pb que é característica da morte celular por apoptose (EDINGER & THOMPSON, 2004; GOLSTEIN & KROEMER, 2006). A Figura 5b, c ilustra as diferenças morfológicas entre as células que morrem por apoptose e necrose. A necrose tem sido tradicionalmente considerada uma forma passiva de morte celular, com mais semelhanças com um acidente do que um suicídio. Entretanto estudos recentes sugerem que a necrose também pode ser regulada geneticamente, desencadeada pelos mesmos sinais de morte que induzem a apoptose. Verifica-se que uma forma programada de morte necrótica (denominado necroptose) é muito comum em vivo não só em situação de patologia, mas também para manter a homeostase (GALLUZZI et al., 2012; HONG, 2013; NIKOLETOPOULOU et al., 2013; WHELAN et al., 2012; ZONG & THOMPSON, 2006). 32 Figura 5: Micrografias eletrônicas ilustrativas dos tipos de morte celular e as suas características morfológicas. As características morfológicas de a) uma célula saudável, b) uma célula necrótica, c) uma célula apoptótica e d) uma célula autofágica. Barra de escala:1 μm (Fonte: EDINGER & THOMPSON, 2004). 1.6.5 Apoptose A apoptose é a forma mais bem descrita da morte celular programada, e desempenha um papel importante tanto no desenvolvimento embrionário e o envelhecimento do organismo (KROEMER et al., 2007; POLLACK et al., 2002). A perturbação deste processo vital leva a uma variedade de doenças, tais como a isquemia, o câncer, as doenças neurodegenerativas e autoimunes 33 (SAIKUMAR et al., 1999). É um processo coordenado e, muitas vezes dependente de energia, que envolve a ativação de um grupo de cisteína proteases chamado "caspases" e uma cascata complexa de eventos que ligam desde a iniciação dos estímulos até o desaparecimento final da célula. A apoptose foi descrita pela primeira vez pelo KERR et al. (1972), e as células que sofrem apoptose exibem uma série de alterações morfológicas e bioquímicas características que permitem a diferenciação com os outros tipos de morte celular (DANIAL & KORSMEYER, 2004; GREEN, 2005; KROEMER et al., 2009). 1.6.5.1 Alterações morfológicas e bioquímicas da apoptose. De um modo geral, a apoptose é um fenômeno bastante rápido: ocorre uma retração da célula que causa perda da aderência com a matriz extracelular e células vizinhas. As organelas celulares mantêm as suas morfologias, com exceção, em alguns casos, das mitocôndrias, que podem apresentar ruptura da membrana externa. A cromatina sofre condensação e se concentra junto à membrana nuclear, que se mantém intacta. Em seguida, a membrana celular forma prolongamentos (blebs) e o núcleo se desintegra em fragmentos envoltos pela membrana nuclear. Os prolongamentos da membrana celular aumentam de número e tamanho e rompem, originando estruturas contendo o conteúdo celular. Estas porções celulares envoltas pela membrana celular são denominadas corpos apoptóticos. Os corpos apoptóticos são rapidamente fagocitados por macrófagos e removidos sem causar um processo inflamatório (ZIEGLER & GROSCURTH, 2004). Basicamente, três tipos de mudanças bioquímicas se observam durante a apoptose: 1) A ativação das caspases, 2) A fragmentação do DNA e das proteínas, 3) A alteração da membrana celular. Logo no inicio da apoptose, a fosfatidilserina da monocamada interna da membrana se desloca para a monocamada externa. Isso permite o reconhecimento e a fagocitose das células em processo de morte pelos macrófagos. Isto é seguido por uma fragmentação característica do DNA em grandes pedaços de 50 a 300 kilobases. Em seguida, existe a clivagem internucleossomal do DNA em oligonucleosomos múltiplos de 180 a 200 pares de bases pelas endonucleases. 34 Outra característica bioquímica da apoptose é a ativação de um grupo de enzimas chamado caspases. Quando ativadas, as caspases clivam muitas proteínas celulares e também ativam as DNAses que futuramente podem degradar o DNA nuclear (WONG, 2011). 1.6.5.2 Mecanismo da apoptose As caspases são fundamentais para o mecanismo da apoptose, pois são ambos iniciadores e executores. Existem três vias através das quais as caspases podem ser ativadas. As duas principais vias de iniciação da apoptose geralmente descritas são a via intrínseca (ou mitocondrial) e a via extrínseca (ou receptor de morte). Ambas as vias, eventualmente, levam a uma via comum ou à fase de execução da apoptose (Figura 6). BCL 2 BAX Figura 6: As duas principais vias que levam a apoptose. Os reguladores-chave implicados nas vias de sinalização extrínseco e intrínseco da apoptose são destacados (Fonte: Wong, 2011). 35  A via intrínseca Como o próprio nome indica, a via intrínseca é iniciada dentro da célula. Estímulos internos, como os danos genéticos irreparáveis, a hipóxia, as concentrações extremamente altas de cálcio citosólico e o estresse oxidativo grave são alguns disparadores do início da via mitocondrial, resultando num aumento da permeabilidade mitocondrial. Esses estímulos apoptóticos podem desencadear a liberação de fatores apoptogênicos do espaço intermembranar mitocondrial para o citosol, como o citocromo C. Esta via é estreitamente regulada por um grupo de proteínas que pertencem à família de Bcl-2. Existem dois grupos de proteínas da família Bcl-2 (as proteína pró-apoptóticas e antiapoptóticas), que regulam a via. As proteínas pró-apoptóticas são Bax, Bak, Bad, Bcl-Xs, Bid, Bik, Bim e Hrk e as proteínas anti-apoptóticas são Bcl-2, BclXL, Bcl-W, Bfl-1 e Mcl-1. As proteínas pró-apoptóticas promovem a liberação de citocromo C da mitocôndria enquanto que as proteínas anti-apoptóticas promovem seu bloqueio (SANKARI et al., 2012; WONG, 2011). Assim que o citocromo C é liberado no citoplasma, ele forma o complexo apoptossomo (composto de citocromo C, Apaf-1 e caspase-9) que vai ativar a caspase-3. Outros fatores apoptóticos que são liberados a partir do espaço intermembranar mitocondrial para o citoplasma incluem as proteínas AIF, Smac/Diablo e Omi/HtrA2. Smac/Diablo ou Omi/HtrA2 promovem a ativação das caspases ligando-se as proteínas inibidoras da apoptose (IAPs), que posteriormente leva ao rompimento na interação dos IAPs com a caspase-3 ou -9 (SANKARI et al., 2012; WONG, 2011).  A via extrínseca Esta via é mediada pela ativação dos chamados "receptores de morte", que são os receptores da superfície celular que transmitem sinais de apoptose após a ligação com ligantes específicos. Os receptores de morte mais conhecidos são o TNFR1 (Factor de Necrose Tumoral Receptor 1) e a proteína Fas e seus ligantes, TNF e Fas ligante (FasL), respectivamente. Estes receptores de morte possuem um domínio de morte intracelular que recruta as proteínas adaptadoras tais como domínio de morte associada ao TNF receptor 36 (TRADD) e domínio de morte associada à Fas (FADD), assim como as proteases de cisteína, como a caspase 8. A ligação do ligante ao receptor de morte resulta na formação de um local de ligação para uma proteína adaptadora e todo o complexo formado pelo ligante, o receptor e a proteínaadaptadora é conhecido como o complexo de sinalização indutor de morte (DISC). O DISC inicia a montagem e a ativação de pró-caspase-8. A caspase-8 ativa, em seguida, processa as caspases efetoras (como a caspase-3) que posteriormente clivam substratos específicos, resultando na morte celular (SANKARI et al., 2012; WONG, 2011).  A via comum A fase de execução da apoptose envolve a ativação de uma série de caspases. A caspase “upstream” da via intrínseca é a caspase 9, enquanto que a da via extrínseca é a caspase 8. As vias intrínseca e extrínseca convergem para a caspase 3. Em seguida, a caspase 3 cliva o inibidor da desoxirribonuclease ativada por caspase, que é responsável pela apoptose nuclear. Além disso, as caspases “downstream” induzem a clivagem das proteínas quinases, às proteínas do citoesqueleto, as proteínas de reparação do DNA e as subunidades inibidoras das proteínas da família endonuclease. Eles também têm um efeito sobre o citoesqueleto, o ciclo celular e as vias de sinalização, que em conjunto contribuem para as alterações morfológicas típicas da apoptose (WONG, 2011). 1.7 Mitocôndria As mitocôndrias são organelas essenciais, pois fornecem à célula a energia metabólica na forma de ATP gerada pela fosforilação oxidativa. Além disso, elas executam outras reações metabólicas importantes (MARTINOU & YOULE, 2011). As mitocôndrias desempenham um papel muito importante na morte celular por apoptose, liberando proteínas efetoras chaves, como o citocromo c e o Smac/Diablo, a partir do espaço intermembranar mitocondrial. Essa liberação de proteína do espaço intermembranar mitocondrial pode 37 resultar a partir da permeabilização da membrana mitocondrial externa, que é regulada pelas proteínas da família Bcl-2. A maneira com que as proteínas da família Bcl-2 controlam a permeabilização da membrana mitocondrial externa e favorecem a liberação das proteínas do espaço intermembranar mitocondrial está sendo muito investigada. Recentemente, a literatura aponta que a mitocôndria pode liberar as proteínas de seu espaço intermembranar através de dois mecanismos diferentes. Em primeiro lugar, através da permeabilização da membrana externa mediada pelos membros da família Bcl-2. Em segundo lugar, através da indução da transição de permeabilidade mitocondrial, que ocorre principalmente em resposta à liberação do cálcio do retículo endoplasmático (KUWANA & NEWMEYER, 2003). O mecanismo pelo qual a proteína BAX, ou BAK, permeabiliza a membrana externa da mitocôndria para permitir o efluxo de proteínas maiores ainda não é claro, apesar de vários modelos terem sido propostos. Esses modelos revelam que a BAX, sozinha ou combinada com outras proteínas, forma canais de dimensões suficientes para permitir a passagem do citocromo C e outras proteínas (MARTINOU & YOULE, 2011). Outra função alternativa dessas proteínas seria de regular a atividade de alguns canais pré-existentes na membrana da mitocôndria, como o canal Kv1.3, favorecendo assim a permeabilidade da membrana mitocondrial (GROSS, 2001). O cálcio é um dos principais reguladores não só a sobrevivência da célula, mas também da morte celular em resposta a uma variedade de sinais celulares. Os efeitos pró-apoptóticos do cálcio são mediados por uma gama diversificada de fatores sensíveis ao cálcio, que são compartimentados em diversas organelas intracelulares inclusive o reticulo endoplasmático, a mitocôndria e o citoplasma. Certos estímulos apoptóticos levam à liberação do cálcio dos retículos endoplasmáticos, o que por sua vez provoca a sobrecarga do cálcio nas mitocôndrias, a despolarização da membrana mitocondrial, a abertura do PTP mitocondrial, e o aumento de volume da matriz mitocondrial. Consequentemente, a membrana mitocondrial externa se rompe, permitindo que as proteínas pró-apoptóticos escapem para dentro do citoplasma (JEONG & SEOL, 2008; KUWANA & NEWMEYER, 2003). 38 1.8 Sinalização celular em modelos de câncer As proteínas quinases ativados por mitógenos (MAPKs) é uma família de enzimas serina/treonina-quinases conservadas, que são consideradas como sendo os blocos centrais das redes de sinalização intracelular. Há mais de uma dúzia de MAPKs conhecidos em mamíferos, e estas enzimas existem em várias isoformas. Os mamíferos expressam quatro grupos de MAPKs distintamente reguladas: ERK 1/2, p38, JNK/SAPK, ERK5 (CHANG & KARIN, 2001; SHAUL & SEGER, 2007). As MAPKs estão envolvidas na transmissão de sinais a partir de uma grande variedade de estímulos extracelulares, incluindo os fatores de crescimento, hormonios, citocinas e neurotransmissores. De fato, as MAPKs são os principais componentes das vias de sinalização que regulam a grande variedade de eventos intracelulares, tais como a proliferação, a diferenciação, o desenvolvimento, a sinalização aguda em resposta aos hormonios, ao estresse, à morte celular programada e à expressão gênica (GEEST et al., 2009; KIM & CHOI, 2010; MANNA et al., 2007). Nas células eucarióticas, a fosforilação reversível de proteínas específicas é um mecanismo fundamental pelo qual a atividade das vias de sinalização é regulamentada. A fosforilação de um componente da via de sinalização é dependente do equilíbrio da atividade entre proteínas quinases e fosfatases e, portanto, essas proteínas têm atraído um grande interesse no tratamento do câncer. As vias de sinalização que culminam na ativação da MAPK têm atraído atenção intensa em câncer, em particular a da ERK. A ERK é um regulador chave do destino celular, mas também é hiperativa em cerca de 30% dos cânceres humanos, no qual ela desempenha um papel na gênese e na manutenção do tumor e, por conseguinte, na progressão da doença. Isto levou a um grande interesse nesta via como um alvo terapêutico no câncer (Allen et al., 2003). A ERK é bem conhecida por ser crítico para a proliferação celular e induz uma resposta de sobrevivência que neutraliza a morte das células, apesar de existirem outros estudos que comprovem que a ativação de 39 ERK está associada com a apoptose (BACUS et al., 2001; WANG et al., 2000). No entanto, o papel da sinalização de MAPK majoritariamente depende dos estímulos e do tipo de célula (CHANG & KARIN, 2001). A p38 MAPK é ativado em resposta a vários produtos químicos e estresses ambientais (COULTHARD et al., 2009). Além disso, a ativação do p38 MAPK, sob condições de estresse celular, pode induzir à apoptose por fosforilação ou indiretamente, diminuindo os níveis das proteínas de sobrevivência, como Bcl-2 (ROSINI et al., 2000; WATSON et al., 2010). Por outro lado, a via da ERK é essencial para a proliferação e a sobrevivência celular (XIA et al., 1995). 1.9 Espécies reativas de oxigênio O termo espécies reativas de oxigênio (EROS) é usado para entidades difusíveis de vida curta como os radicais: hidroxila (•OH), alcoxila (RO•) ou peroxila (ROO•) e para algumas espécies de radicais de vida médios, como o superóxido (O2-•) ou o radical nitroxil (NO•). Também inclui os não-radicais, tais o peróxido de hidrogênio (H2O2), os hidroperóxidos orgânicos (ROOH) e o ácido hipocloroso (HOCl) (SIMON et al., 2000, WANG & YI, 2008). Como consequência do metabolismo aeróbico, pequenas quantidades de EROS são geradas constantemente no organismo. Os antioxidantes celulares agem em conjunto para desintoxicar essas espécies, mas, quando o equilíbrio é rompido, uma condição conhecida como estresse oxidativo acontece. Se o estresse oxidativo persistir, isso pode levar ao dano de biomoléculas críticas (incluindo o genoma). Esses danos acumulam-se e, eventualmente, resultam em vários efeitos biológicos que variam de alterações na transdução do sinal e a expressão do gene para a mitogênese, a transformação, a mutagênese e a morte celular (MATÉS & SÁNCHEZJIMÉNEZ, 2000, RAY et al., 2012). A apoptose e o câncer são fenômenos opostos, mas as EROS têm sido amplamente relatadas por desempenhar um papel chave em ambos os eventos. Evidências de que a apoptose pode ser induzida pelas EROS são fornecidas por estudos em que os mediadores de apoptose, induzem a 40 produção intracelular de EROS ou são inibidas por meio da adição de antioxidantes (MATÉS & SÁNCHEZ-JIMÉNEZ, 2000). O papel de EROS, como intermediários para a sinalização de apoptose está bem relatada em numerosas investigações, incluindo 1) os antioxidantes inibem a apoptose induzida por uma variedade de agentes apoptóticos, 2) os niveis de EROS estão elevados em células em apoptose 3) as EROS exógenos podem induzir a apoptose nos diversos tipos de células, e 4) a inibição dos níveis de antioxidantes intracelulares, promove a morte celular por apoptose (MOUNGJAROEN et al., 2006). A indução de apoptose tem sido uma estratégia popular para a terapia do câncer. As melhores drogas contra o câncer levam as células tumorais a morrer seja diretamente ativando as vias pró-apoptóticas ou desativando as vias anti-apoptóticas (COTTER, 2009). No entanto, induzir seletivamente as células tumorais a morrer continua a ser uma grande preocupação e desafio para o tratamento do câncer. As EROS têm um papel importante na indução da apoptose em ambas as condições fisiológicas e patológicas. Recentemente, induzir à produção de EROS tornou-se uma nova abordagem para tratar o câncer. A vantagem desta estratégia reside na sua boa seletividade. As células cancerosas estão geralmente sob estresse oxidativo e, portanto, têm um nível basal relativamente elevado de EROS. Uma pequena indução de EROS nas células tumorais pode empurrar o nível de EROS sobre o limiar da vida e da morte, e induzir a morte celular, enquanto que as células normais podem tolerar melhor os insultos oxidativos devido ao seu nível basal inferior de EROS e suas capacidades antioxidantes mais eficientes (SUN et al., 2013). O composto natural feniletil isotiocianato, um novo agente indutor de EROS, exibe seletividade anticâncer superior e está atualmente sob investigação clínica (CHEUNG & KONG, 2010; TRACHOOTHAM et al., 2006; XIAO et al., 2010). Além disso, outro composto natural o Celastrol tem sido mostrado induzir citotoxicidade, causando a acumulação de EROS no ambas as células H1299 do câncer do pulmão e de hepatoma HepG2 (CHEN et al., 2011). Estudos recentes têm demonstrado que as EROS desempenham um papel importante na apoptose induzida pelo Celastrol (CHEN et al, 2011; SEO et al, 2011). 41 Contudo, a indução da produção de EROS intracelular como estratégia anticâncer ainda está no seu inicio. As formas pelas quais os compostos induzem a produção de EROS são diversas, e os efeitos dos indutores de EROS não são idênticos, mas o mecanismo detalhado é incerto. Mais agentes indutores de EROS com diferentes mecanismos são necessários para compreender plenamente os seus potenciais de aplicação no tratamento do câncer (SUN et al., 2013). 1.10 Quimioterapia do câncer As primeiras aplicações da quimioterapia para controlar o câncer foram relatadas nos anos 1940, e décadas após, o tratamento de doentes com produtos químicos tóxicos amplamente representou um dos pilares da oncologia médica, apesar dos efeitos colaterais severos frequentemente associados com tais tratamentos (BAGNYUKOVA et al., 2010; SAK. 2012) . Por definição, o tratamento quimioterapeutico deve interferir com o programa bioquímico que está envolvido ou comprometido com a multiplicação celular e causar seletivamente a morte celular, e a célula hospedeira deve ser capaz de se adaptar e se recuperar da toxicidade. Muitos agentes quimioterapeuticos matam as células cancerosas por via oxidativa por meio da produção de espécies reativas de oxigênio e a indução de apoptose ou necrose nessas células tumorais, enquanto outros agem em vários componentes do metabolismo celular que influenciam as atividades de diferentes enzimas necessárias para a divisão celular (SAK, 2012). O tratamento do câncer é orientado no seu potencial de proliferação e a sua capacidade de formar metástase, portanto, a maioria dos medicamentos quimioterápicos tira vantagem do fato de que as células cancerosas se dividem rapidamente. Agentes quimioterapeuticos podem ser divididos em várias categorias, com base nos fatores tais como a forma como eles funcionam, a sua estrutura química, e sua relação com outra droga (SAK, 2012). 42 As categorias mais importantes de agentes quimioterapêuticos incluem agentes alquilantes (por exemplo, ciclofosfamida, ifosfamida, melfalano, busulfano), antimetabolitos metotrexato, gemcitabina), (por exemplo, antibióticos 5-fluorouracil, anti-tumorais capecitabina, (por exemplo, daunorubicina, doxorubicina, epirubicina), inibidores da topoisomerase (por exemplo, topotecano, irinotecano, etoposido, teniposido), e inibidores de mitose (por exemplo, paclitaxel, docetaxel, vinblastina, vincristina). A maioria dos fármacos quimioterapêuticos atua na maquinaria do ciclo celular baseando na diferença de frequência de divisão celular entre as células cancerosas e as células normais (SAK, 2012). Apesar dos últimos avanços, sabe-se que a instabilidade genética e a alta taxa de mutação nas células cancerosas devido ao uso prolongado da quimioterapia, ainda carrega um alto risco de seleção de clones de células resistentes aos medicamentos (URRUTICOECHEA et al., 2010). O desenvolvimento da resistência a multidrogas (MDR) compromete a eficácia do tratamento quimioterapeutico do câncer. Os tumores podem ser intrinsecamente resistentes ao tratamento quimioterapêutico (MDR intrínseco) e, muitas vezes respondem mal à terapia induzida. Alternativamente, os tumores podem responder bem à terapia induzida, apenas desenvolvendo MDR após a exposição subsequente a droga quimioterapêutica (MDR adquirida). As células MDR apresentam resistência cruzada a uma larga gama de fármacos estruturalmente e funcionalmente diferentes, incluindo antraciclinas (doxorubicina, daunorubicina, epirubicina), alcalóides de vinca (vincristina, vinblastina, vinorelbina) e epidofilotoxinas (etoposido, teniposido). A MDR pode ser mediada por um número de mecanismos, tais como o aumento do efluxo de droga, ou alterações nos alvos de drogas, como os mecanismos apoptóticos ou dos mecanismos de reparação do DNA. Células tumorais resistentes aos medicamentos são susceptíveis a ter envolvido uma dessas alterações. Um entendimento melhor de cada mecanismo que pode mediar a MDR melhorará os nossos regimes terapêuticos atuais e auxiliará no desenvolvimento de novas terapias (BAKER & EL-OSTA, 2004). 43 1.11 Derivados triazóis de quinonas 1.11.1 Naftoquinonas As quinonas (Figura 7) representam uma das maiores famílias de agentes antitumorais. Embora a maioria das drogas anticâncer atuais tenha sido descoberta empiricamente, muitos conhecimentos foram adquiridos sobre os mecanismos pelos quais muitos desses compostos afetam o crescimento celular (ASCHE, 2005; BOUTROS et al., 2007). O conhecimento básico resultante dos estudos das quinonas foi usado para projetar novas drogas anticâncer, melhorando a seletividade e proporcionando uma aplicação terapêutica mais racional desses agentes (FRY & JACOB, 2006; GARRETT & WORKMAN, 1999; DA SILVA JUNIOR et al., 2010). 1,4-Benzoquinona 1,4-Naftoquinona Antraquinona Figura 7: Classificação das quinonas. Particularmente, as naftoquinonas, compostos carbonílicos amplamente distribuídos na natureza, exibem diversas propriedades farmacológicas como antibacteriano, antifúngico, antiviral, anti-inflamatória e antipirética, incluindo a atividade anticâncer (BABULA et al., 2007; KIM et al., 2006). As naftoquinonas com a capacidade de induzir o estresse oxidativo são responsáveis pela iniciação do dano tecidual em células tumorais e isto parece ser uma 44 abordagem promissora para a eliminação seletiva de células cancerosas (SMITH et al., 1985). Os derivados de quinonas podem ser tóxicos para as células por vários mecanismos, incluindo o sistema do ciclo redox, a arilação, a intercalação, o dano de DNA e a geração de radicais livres (MILLER et al., 1986). Como consequência, a estrutura molecular de um grande número de produtos farmacêuticos e de compostos biologicamente importantes contêm um núcleo quinona. Os exemplos representativos desta classe de compostos são os fármacos anti-cancerígenos conhecidos da série de antraciclina, a doxorubicina e a mitoxantrona. Acredita-se que o efeito desses derivados ocorre através da inibição da enzima topoisomerase II (D'ARPA & LIU, 1989; FOGLESONG et al., 1992). Além disso, uma série de análogos de naftoquinona como a plumbagina, shikonina e naftazarina, bem como a β-lapachona, também são inibidores das topoisomerases (FUJII et al., 1992; KRISHNAN & BASTOW, 2000; YANG et al., 2006). As naftoquinonas são consideradas estruturas privilegiadas em química medicinal, devido às suas atividades biológicas e propriedades estruturais (DE CASTRO et al, 2011; PADHYE et al, 2012). O núcleo 1,4-naftoquinona é um potente inibidor do crescimento do câncer e é sugerida como útil na terapia do câncer (KAYASHIMA et al., 2009). No entanto, está bem estabelecida que este núcleo apresente toxicidade em hepatócitos normais. A substituição por um grupo hidroxila no anel quinóide da 1,4-naftoquinona, diminui a toxicidade, enquanto que a substituição com uma hidroxila na posição β no anel benzeno aumenta a toxicidade (OLLINGER & BRUNMARK, 1991). Dessa forma, usando o núcleo 1,4-naftoquinona para obter novos derivados com atividade seletiva têm sido um desafio. 1.11.2 1,2,3-triazóis 1.11.2.1 Estrutura e síntese A síntese de heterocíclicos é de grande importância na química farmacêutica e medicinal. A demanda cada vez maior de novos compostos biologicamente ativos e o laborioso processo de descoberta e otimização resultaram na busca contínua de métodos simples e eficientes para a geração 45 de bibliotecas para a triagem biológica. O núcleo 1,2,3-triazol não foi isolado de compostos naturais, no entanto, o radical 1,2,3-triazol tem sido utilizado em muitas aplicações industrial e farmacêutica. As aplicações de 1,2,3-triazóis são generalizadas, tornando os derivados de 1,2,3-triazol uma classe de molécula altamente estudada (MAYOT et al., 2005). Os triazóis pertencem a uma classe de compostos chamados azóis. Um azol contém um anel aromático de cinco membros com pelo menos um átomo de nitrogênio e outro heteroátomo tal como enxofre, ou oxigênio. A estrutura de 1,2,3-triazol (Figura 8) contém três átomos de nitrogênio adjacentes com três locais disponíveis para substituição encontrados nas posições 1, 4 e 5 (KHARB et al., 2011). Figura 8: Estrutura do núcleo 1H-1,2,3-triazol não substituído. A maioria das reações clássicas para a síntese de compostos heterocíclicos são realizadas por ciclização, desde que as reações de cicloadição possam servir de via para obter heterocíclicos com padrões de substituição bem definidos. A síntese da estrutura do anel 1,2,3-triazol é tipicamente realizada por uma cicloadição 1,3-dipolar com um alcino e uma azida (Figura 9) (PELLISSIER, 2007). 46 Figura 9: A reação de síntese do anel 1,2,3-triazol. 1.11.2.2 Efeitos farmacológicos O triazol e seus derivados têm atraído atenção considerável nessas últimas décadas devido aos seus potenciais quimioterápicos (KHARB et al., 2011). A utilização dos triazóis tem sido encontrada em várias áreas e está crescendo continuamente (KOLB & SHARPLESS, 2003). De acordo com a literatura, os derivados triazóis (Figura 10) possuem uma ampla variedade de atividades farmacológicas, tais como antimicrobiana, analgésica, anti- inflamatória, anestésica local, anticonvulsiva, anti-neoplásica, antimalárica, antiviral e antiproliferativa (KHARB et al., 2011). O anel triazol é um importante heterociclo pentacíclico, com três átomos de nitrogênio e possui aromaticidade e um sistema rico em elétrons. Este tipo de estrutura única favorece os derivados triazóis de ligarem facilmente com uma variedade de enzimas e receptores no sistema biológico através de interações fracas, tais como ligações de coordenação, ligações de hidrogênio, íons-dipolo, efeito hidrofóbico, van der Waals, etc. e, assim, apresentar um amplo espectro de atividades biológicas (ZHOU & WANG, 2012). O interesse em moléculas que contêm o grupo 1,2,3-triazol como agentes quimioterapêuticos para várias doenças tem aumentado, porque esta classe de heterocíclicos é conhecida por exibir uma vasta gama de atividades biológicas, como as citadas acima (DA SILVA et al., 2012) e também o fato do que o anel 1,2,3-triazol não ser tóxico, além de estável. Os triazóis são particularmente interessantes para o uso medicinal, porque eles são mais 47 solúveis em água do que os compostos aromáticos normais, e são estáveis em sistemas biológicos. Além disso, o anel triazol pode ser usado como elo para combinar diferentes fragmentos farmacóforos para produzir medicamentos inovadores bifuncionais, o que proporciona uma via conveniente e eficaz para o desenvolvimento de várias moléculas bioativas e funcionais (ZHOU & WANG 2012). Realmente, a combinação do anel triazol com outros heterociclos tem sido uma abordagem bem conhecida para obtenção de drogas inéditas com novos perfis farmacológicos. Isto pode ser conseguido, por meio do reforço da sua ação ou diminuindo sua toxicidade (KHARB et al., 2011). De fato, a artemisinina (um composto natural), que é uma importante droga antimalárica, não possui atividade anticâncer, mas a incorporação do anel triazol na posição da carbonila dotou o composto resultante de uma atividade inibidora contra diversas células malignas (ZHOU & WANG, 2012). Além disso, a podofilotoxina é conhecida por inibir a montagem da tubulina em microtúbulos através da ligação com a tubulina. No entanto, a sua toxicidade elevada limitou a sua aplicação como um fármaco na quimioterapia contra o câncer. A introdução do anel 1,2,3-triazol na molécula podofilotoxina resultou em um composto de baixa toxicidade, com uma boa atividade antitumoral contra linhagens de células tumorais humanas, como Hela, K562 e K562/A02 (ZHOU & WANG, 2012). Visto que os triazóis e as naftoquinonas são importantes compostos com atividades farmacológicas independentes, torna-se relevante a produção de alguns compostos por hibridização molecular utilizando esses núcleos. A utilização desta abordagem na concepção de novas drogas provou ser útil na modificação do perfil de seletividade e na redução dos efeitos secundários indesejáveis (VIEGAS-JÚNIOR et al., 2007). 48 Antihipertensivo Atividade anti-HIV Atividade muscarínica Atividade hipocolesterolêmica Atividade anticâncer Antagonista do receptor NMDA Antagonista h-NK1 Inibidor do receptor tirosina quinase VEGF Figura 10: Presencia do núcleo 1,2,3-triazóis em várias moléculas com atividades biológicas. (Fonte: Agalave et al., 2011) 49 2. Objetivos 2.1 Objetivo geral Avaliar o potencial anticancerígeno de novos derivados triazóis, sintetizados a partir do núcleo 1,4-naftoquinona. 2.2 Objetivos específicos  Determinar a citotoxicidade de oito compostos derivados do núcleo 1,4naftoquinona em linhagens cancerígenas e normais,  Elucidar o mecanismo de morte induzido pelos compostos nas linhagens mais sensíveis,  Investigar a expressão das proteínas da família Bcl-2 e do citocromo C,  Analisar a produção de EROS intracelular e seus papéis na indução da citotoxicidade dos compostos,  Investigar a participação da via dos MAPKs na citotoxicidade induzida pelos compostos. 50 3. Material e Métodos 3.1 Material 3.1.1 Equipamentos Agitador de placa Certomat ® MO, EUA Agitador de placa MS1 MINISHAKER, IKA, EUA Agitador magnético TE-088 TECNAL, BRASIL Autoclave, PHOENIX LUFERCO, BRASIL Balança analítica MODELO FA2104N, CELTAC, BRASIL Banho Maria com agitação, MULTITEMP III, BRASIL Centrífuga refrigerada, HERMLE Labortedrik GMBH, ALEMANHA CFX96 Real Time System, BIO-RAD, EUA Citômetro de fluxo BD FACS CALIBUR, EUA Espectrofotômetro UV1101, BIOTECH Estufa de CO2 HF 212 UV, ULTRASAFE, CHINA Estufa de secagem, De Leo, BRASIL Fluxo laminar PACHANE, BRASIL Freezer -20ºC FE26, ELECTROLUX, BRASIL Freezer -80ºC ULT390-3-D31 INDREL. EUA Leitora de ELISA ELx800, BIOTEK, ALEMANHA Microondas Panasonic, BRASIL Microscópio de fluorescência, CARL ZEISS, ALEMANHA Microscópio óptico de inversão XS201, TAIMIN, BRASIL pHmetro PHS-3B, LABMETER, BRASIL Refrigerador, Electrolux, BRASIL Ultra-purificador, Scholar-UV, BRASIL Vortex QL-90L, VERTEX, EUA 51 3.1.2 Reagentes e compostos utilizados 2-desoxi-D-ribose, ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), Amresco, EUA Peróxido de hidrogênio (H2O2), Vetec, EUA 2’,7’-diclorofluoresceína-diacetato (DCFH-DA), Invitrogen, EUA Albumina sérica bovina (BSA), Sigma, EUA Duodecil sulfato de sódio (SDS), Fisher Scientific, EUA Ficoll hipaque, GE Healthcare Iodeto de propídeo (IP), Sigma, EUA Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT), Amresco, EUA Fitohemaglutinina, Cultilab, Brasil Acido clorídrico (HCl), Vetec, EUA Penicilina, Sigma, EUA Estreptomicina, Sigma, EUA Soro bovino fetal (SBF), Cripion, Brasil Etoposídeo, Sigma, EUA Tetrametilrodamina, Invitrogen, EUA Kit Annexina V/IP, Invitrogen, EUA SYBR Green, Applied Biosystems, UK 3.1.3 Soluções  Solução Tampão de Fosfato (PBS) Foi utilizada como meio de lavagem no cultivo de células que crescem em monocamada em cultivo in vitro e também depois do tratamento das células com as drogas. Esta solução é livre de Ca2+ e Mg2+, e contém NaCl (137mM), KCl (2,7mM), Na2HPO4 (10mM), KH2PO4 e água MilliQ e o pH desta solução foi ajustado em 7,4. A solução foi esterilizada em autoclave e conservada a 4°C.  Solução de Tripsina-EDTA A solução de tripsina-EDTA foi utilizada para permitir o descolamento das células dos frascos de cultivo e/ou agregação de grumos celulares, através da sua propriedade proteolítica sobre as proteínas intercelulares. Esta solução 52 contém PBS, Tripsina e EDTA. O pH foi ajustado em 7,2 e foi esterilizado por filtração com membranas de 0,4 mm de diâmetro (Millipore) e a conservação das alíquotas foi à temperatura de -20°C.  Corante Azul de Trypan 0,4% Esta solução foi preparada utilizando NaCl 0,81% K2HPO4 0,06% e azul de trypan comercial. Estas substâncias foram dissolvidas em 100 mL de água MilliQ, filtradas com membranas de 28 mm de diâmetro e a conservação das alíquotas foi a 4°C. Este corante foi utilizado para corar as células mortas, diferenciando-as das células vivas, para contagem da viabilidade celular em Câmara de Neubauer.  Dimetilsulfóxido (DMSO) O DMSO é usado na medicina como solvente por apresentar baixa toxicidade, age como criopreservante em concentração de 5%. Foi utilizado para dissolver todos os compostos e também para o congelamento das linhagens celulares. 3.1.4 Compostos estudados Os compostos C1-C8 (Figura 11) foram sintetizados no Laboratório de Síntese de Compostos Bioativos da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) e fornecidos pelos professores doutores Celso de Amorim Camara e Ronaldo de Nascimento Oliveira, conforme o trabalho NASCIMENTO et al. (2011). Os compostos foram dissolvidos em DMSO, na concentração de 20 mM, e guardados sob-refrigeração. Para à realização dos ensaios biológicos, os compostos foram diluídos no meio de cultura, a partir desta solução estoque de 20 mM. À maior concentração testada, portanto, foi de 100 μM, ou seja, 0,5% de DMSO. Esse dispersante, na concentração de 0,5% não demonstrou nenhum efeito sobre as linhagens testadas. 53 OMe OH O O N3 N O O N N N O O C1 C2 N O O N N N O C5 C6 N N N N N C4 O C3 O O OH O O O N N O N N O N O N C7 OAc AcO O O O N O N N C8 Figura 11: Estruturas químicas das 1,2,3-triazol-1,4-naftoquinonas (C2-C8) e seu precursor azida (C1). 3.1.5 Linhagens celulares 3.1.5.1 Linhagens leucêmicas (HL-60, K562, K562-Lucena) HL-60 é uma linhagem de leucemia mielóide aguda (LMA) humana e, K562 é uma linhagem de leucemia mielóide crônica (LMC) humana. A linhagem K562-Lucena é a forma resistente de K562 que superexpressa a glicoproteinaP (P-gp). Todas essas linhagens foram cultivadas em suspensão em frascos estéreis contendo o meio de cultura RPMI 1640, suplementado com 10% de 54 soro bovino fetal (SBF) e com antibióticos (100 U/mL de penicilina, 0,1 mg/mL de estreptomicina). As linhagens foram mantidas em estufa a temperatura de 37°C e uma atmosfera úmida de 5% de CO2. O meio da linhagem K562-Lucena foi acrescido da vincristina para manter a sua resistência. O meio de cada linhagem foi trocado a cada 48 horas para isso a cultura celular foi centrifugada a 400xg, o sobrenadante descartado e o precipitado resuspendido em um novo meio. Essas linhagens celulares foram adquiridas do Banco de Células do Rio de Janeiro/RJ/Brasil (BCRJ). 3.1.5.2 Linhagens de adenocarcinoma de mama (MCF-7) e de cólon (HT29) As duas linhagens são de origem humana e possuem características de células aderentes e crescem em monocamada. Essas células foram cultivadas em frascos estéreis na presença de meio de cultura, DMEM (HT-29) ou RPMI 1640 (MCF-7), contendo 10 % de soro fetal bovino e com antibióticos 100 U/mL de penicilina, 0,1 mg/mL de estreptomicina (meio completo) e mantidas a 37 °C em atmosfera úmida contendo CO2 (5%). O meio de cada linhagem foi trocado a cada 48 horas. Uma vez que essas células são aderentes e atingem a confluência (80% de crescimento), foi necessário fazer a remoção dessas com a solução de tripsina (0,25% + EDTA 1 mM) em tampão PBS, pH 7,4. Em seguida, foram transferidas para tubos cônicos contendo meio de cultura completo. Após centrifugação a baixa rotação, o meio de cultura e tripsina foram desprezados e as células ressuspendidas em um novo meio completo. Essas linhagens celulares foram também adquiridas do Banco de Células do Rio de Janeiro/RJ/Brasil (BCRJ). 3.1.5.3 Células do sangue periférico (PBMC) As bolsas de sangue foram cedidas pelo Hemocentro de João Peessoa (Paraíba). As células mononucleares presentes no sangue periferico foram isoladas através do meio histopaque (densidade 1,119), de acordo com as instruções do fabricante (Sigma Chemical, EUA). O sangue coletado foi 55 adicionado a um tubo contendo Histopaque, na proporção de 5,0 ml sangue/4,5 ml Histopaque. Os tubos foram centrifugados (400 g), em temperatura de 4°C, até a completa separação das bandas celulares. A camada de células mononucleares foi coletada com o auxílio de micropipeta e a seguir as células foram lavadas com meio de cultura RPMI-1640 (Sigma Chemical, EUA) contendo soro fetal bovino (SFB) 10%, através de centrifugação (400 g, 10 min, 4°C), procedimento que foi repetido outras duas vezes. Em seguida, as células foram ressuspensas em 1 ml do mesmo meio. Os procedimentos experimentais foram feitos com o acordo do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Universidade Federal da Paraíba (CEP / HULW / UFPB), protocolo n 655/10-318119. 3.2 Métodos 3.2.1 Teste de viabilidade preliminar das culturas celulares Antes da exposição das células com aos compostos, a viabilidade celular das culturas foi determinada pelo método de exclusão com o corante vital, azul de tripano. Este método é baseado no princípio de que as células viáveis com membranas celulares intactas não coram de azul, surgindo brilhantes quando observadas ao microscópio, enquanto as células mortas ou danificadas surgem coradas de azul. Para determinar a viabilidade das culturas celulares procedeu-se do seguinte modo: após centrifugação das culturas celulares, o precipitado resultante foi ressuspendido em 2 mL de meio de cultura completo. A 90 μL da suspensão celular foram adicionados 10 μL de azul de tripano e 10 μL desse conteúdo resultante foi aplicado numa câmara de Neubauer, procedendo-se a contagem celular. As culturas celulares assim como as PBMCs com a viabilidade celular maior do que 90% foram usadas para os experimentos. 56 3.2.2 Teste de viabilidade celular pelo método colorimétrico do MTT Para a avaliação da viabilidade celular sob efeito dos compostos estudados, foi realizado o ensaio colorimétrico do MTT (brometo de 3-(4,5dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) descrito por MOSMANN (1983). Este método é baseado desidrogenase, que na atividade da se encontra ativa enzima apenas mitocondrial em succinato células viáveis metabolicamente ativas. Esta enzima reduz o sal de tetrazólio solúvel e de cor amarela e converte-o num produto insolúvel de cor violeta (cristais de formazan), cuja quantidade pode ser determinada por espectrofotometria, onde a intensidade da cor resultante da dissolução dos cristais de formazan é proporcional à atividade da enzima e, por conseguinte ao número de células viáveis (VAN MEERLOO et al., 2011). Após um período de incubação de 24 horas, as células (100 µL, 5x104 células) com os compostos (100 µL) de cada concentração desejada, em placas de 96 poços. As placas foram centrifugadas e lavadas com o tampão fosfato (PBS). Em seguida removeu-se 110 µL do sobrenadante e adicionaramse 10 μl/poço de uma solução de 5mg/mL de MTT. As células foram incubadas a 37°C na incubadora durante um período de 3-4 horas, que é o tempo necessário para ocorrer à redução do MTT e levar à formação dos cristais de formazan. Depois foram adicionados 100 μl/poço de SDS/HCL 0,01% e as placas foram deixadas “overnight” para dissolver os cristais de formazan. Por fim, foi medida as absorbâncias num leitor de microplacas (BioTek, EUA) com filtro de referência a 620 nm e filtro de leitura a 570 nm. O percentual de células viáveis em relação aos respectivos controles (células sem tratamento) foi calculado no programa Prisma (EUA) a partir da seguinte fórmula: Viabilidade celular (%) = (absorbância da amostra/absorbância do controle)x100 A concentração que inibe 50% da viabilidade celular (CI50) foi determinada pela curva dose-resposta de cada composto utilizando o programa GraphPad Prisma 5. 57 3.2.3 Ensaio da integridade da membrana plasmática por citometria O teste se baseia na capacidade do iodeto de propídeo (IP) penetrar nas células cuja membrana esteja rompida e após a ligação ao DNA emitir alta fluorescência quando é excitado pelo laser. As células com a membrana íntegra, portanto que não integram o IP, emitem baixa fluorescência. As células (5x105 células/mL) foram tratadas ou não (controle) com os compostos C1, C2 e C3 durante 24 horas. Depois as células foram centrifugadas e lavadas com o PBS. Em seguida o precipitado resultante foi tratado com 500 µL de uma solução de IP a 5 µg/mL (diluído no PBS). Após 15 minutos as amostras foram analisadas por citometria de fluxo FACSCalibur (Bencton Dickinson, EUA) utilizando o filtro para o espetro do vermelho. 3.2.4 Análise do ciclo celular por citometria Esse método consiste na capacidade do iodeto de propídeo se ligar ao DNA das células, cuja membrana plasmática foi primeiramente lisada por um detergente para permitir a entrada do corente no núcleo. O ciclo celular é constituído pelas seguintes fases: G1, S, G2 e M. A quantidade do DNA em cada fase é diferente, portanto a quantidade de fluorescência do IP de cada fase também é diferente, o que vai permitir a quantificação das células em cada fase por citometria de fluxo. Quando as células se apresentam com o DNA fragmentado (Sub-G1), a quantidade de IP incorporada é menor que a das células na fase G1 e, portanto emitem uma fluorescência mais baixa. Para a análise do ciclo celular, 5x105 células foram semeadas em placas de cultura de 24 poços e tratadas com os compostos C2 e C3 por 24 horas a 37°C e 5% de CO2. Em seguida, elas foram centrifugadas a 400 g e lavadas com o PBS. O precipitado resultante foi ressuspendido em solução de IP (0,1% citrato de sódio, 0,1% triton-X-100 e 50 μg/mL IP) acrescido de 1U/mL de RNAse A e incubado por 30 minutos a 4°C no escuro. Em seguida, as amostras foram levadas para ser analisadas no citometro de fluxo FACSCalibur (Bencton Dickinson, EUA). 58 3.2.5 Avaliação da fragmentação do DNA A fragmentação de DNA foi determinada pela técnica de eletroforese horizontal em gel de agarose 1.5%. Esta técnica foi realizada segundo Maniats (1982). As células foram semeadas em placas de 24 poços (1 x 106 células) em presença dos compostos C2 e C3 por 24 h. Os compostos foram utilizados nas concentrações de 10 μM para C2 e 20 μM para C3 em HL-60 e de 45 μM para C2 e C3 em K562. O etoposídeo foi testado nas concentrações de 5 e 50 μM em HL-60 e K562 respectivamente. 3.2.5.1 Extração do DNA A extração de DNA foi realizada mediante o protocolo do fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1). Depois que as culturas celulares foram tratadas com as drogas, foi retirado o meio de cultura e as células foram colocadas em tubo “eppendorf” para ser centrifugado a 400 g por 5 minutos e o precipitado lavado com o PBS e reservado. Em seguida, as células foram lisadas com o tampão de digestão (250 μL) [NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM, EDTA 25 mM, SDS 0,5%] e o lisado colocado no tubo “eppendorf” onde sofreu desproteinização com adição de 400 μL de fenol:clorofórmio: álcool isoamílico na proporção de 25:24:1, homogeneizado e centrifugado a 10.480 g por 10 minutos. A fase aquosa foi transferida para outro “eppendorf” onde foram adicionados 185 μL de acetato de amônio (10 mM) e 1,2 mL de etanol 100 % (Merck) gelado para precipitação do DNA por 12 horas à -4 ° C. Em seguida, foi realizada a centrifugação a 10.480 g por 5 minutos, o precipitado contendo DNA foi lavado duas vezes com etanol 70 % gelado e ressuspenso em tampão TE (Tris-HCl 10 mM e EDTA 1 mM, 7,4) e submetido a eletroforese em gel de agarose. 3.2.5.2 Eletroforese em gel de agarose Os géis foram preparados utilizando-se agarose (Invitrogen) na concentração de 1,5% em tampão TBE (89 mM Tris-Borato; 2 mM EDTA, pH 59 8,0) contendo 0,5 μg/mL de brometo de etídeo. A eletroforese foi realizada em tampão TBE, sob tensão de 60 V por cerca de 1 hora e 30 minutos. O DNA foi visualizado utilizando um transiluminador de luz ultravioleta (Transiluminator, Loccus Biotecnologia, EUA) e o resultado fotografado. 3.2.6 Análise da condensação da cromatina por microscopia de fluorescência Para este teste as células HL-60 (5x104/poço) foram incubadas com os compostos C2 e C3 por 24 horas a 37°C a 5% de CO2 em placas de 96 poços. As células tratatadas foram lavadas e ressuspendidas em 100 μL de PBS e tratadas com o corante laranja de acridina (1 μL da solução a 10 mg/ml). A laranja de acridina emite fluorescência verde por associação ao DNA das células normais ou em processo de morte. As células normais apresentaram uma fluorescência homogênea enquanto nas células apoptóticas com dano no DNA apresentaram uma descontinuidade na fluorescência. As células foram analisadas usando um microscópio de fluorescência (Zeiss Axiovision, sistema Zeiss AxioCam HSm de aquisição de imagens, da Carl Zeiss, Alemanha) e filtro de 480 nm. 3.2.7 Avaliação do potencial da membrana mitocondrial por citometria Essa técnica se baseia na capacidade de um corante fluorescente específico, ser captado e retido pelas mitocôndrias das células viáveis graça as suas diferenças de potencial de membrana. Alterações no potencial de membrana resultam em alterações na intensidade de fluorescência do corante. A tetrametilrodamina metil ester (TMRM) é um corante fluorescente catiônico permeável à membrana celular usado como fluoróforo das mitocôndrias de células viáveis. Alterações no potencial mitocondrial transmembrânico levam ao efluxo da TMRM de dentro da mitocôndria, gerando menor fluorescência. Após o período de incubação de 24 h com os compostos C2 e C3, as células foram recolhidas para análise do potencial transmembrânico e 60 colocadas em tubos tipo “eppendorf”, centrifugadas a 400 g por 5 minutos, e o precipitado ressuspendido em 500 µL da solução de TMRM (10 µM) por 30 minutes, ao abrigo da luz. Em seguida, as células foram centrifugadas a 400 g por 5 minutos e lavadas com 500 µL de PBS. Em fim, as amostras foram analisadas no citômetro de fluxo FACSCalibur (Bencton Dickinson, EUA). 3.2.8 Teste da externalização da fosfatidilserina por citometria O anticoagulante anexina V é uma proteína com propriedades de ligação aos fosfolipídios, como a fosfatidilserina. Em células normais a fosfatidilserina está localizada na região interna da membrana plasmática. Com a morte celular, mesmo nos estágios inicias da apoptose, a fosfatidilserina é translocada para a região externa da membrana, ficando exposta e passível de interação com marcadores como a anexina V (Chen, 2007). As células (5x105 células/poço) foram cultivadas em placas de 24 poços por 24 horas e tratadas com os compostos C2 e C3. Após o tratamento as células foram transferidas para tubos tipo “eppendorf” estéreis e centrifugadas a 400 g por 5 minutos. As células foram lavadas com o PBS e centrifugadas novamente. Para o ensaio da anexina V foi utilizado o kit de detecção de apoptose por Anexina-V marcada com Alexa Fluor 488 (Alexis, Lausen, Suiça). A seguir, as células foram ressuspendidas com 500 μl de tampão de ligação, 5 μl de anexina V conjugada com Alexa Flour 488, e 5 μl de iodeto de propídeo. A reação foi incubada por 5 minutos, a temperatura ambiente, sob abrigo da luz. A intensidade de fluorescência (Alexa Fluor 488 e iodeto de propídio) foi avaliada utilizando o equipamento FACSCalibur (Bencton Dickinson, EUA). Para cada ensaio, foi incluído um controle positivo (Etoposidéo), e um controle negativo (células não tratadas). 61 3.2.9 Análise da externalização da fosfatidilserina por microscopia de fluorescência Para este teste as celulas HL-60 (5x104/poço) foram incubadas com os compostos C2 e C3 por 24 horas a 37°C a 5% de CO2 em placas de 96 poços. As células tratatadas foram lavadas e ressuspendidas em 100 μL de PBS e tratadas com a anexina V-Alexa Fluor (1 μl de solução do kit) foram utilizados. Em caso de apoptose a fosfatidilserina desloca-se para membrana externa e, por sua vez, a anexina V marcada com o fluorocromo (alexa Fluor), se liga a fosfatidilserina e emite uma fluorescência verde. As células foram analisadas usando um microscópio de fluorescência (Zeiss Axiovision, sistema Zeiss AxioCam HSm de aquisição de imagens, da Carl Zeiss, Alemanha) e filtro de 480 nm. 3.2.10 Avaliação da produção das espécies reativas de oxigênio A geração de EROS foi verificada com o auxílio da sonda 2’,7’diclorofluoresceína-diacetato (DCFH-DA), um composto lipossolúvel, que penetra facilmente dentro da célula e é hidrolisado enzimaticamente por esterases intracelulares para formar DCFH não fluorescente. O DCFH é rapidamente oxidado pelas EROS intracelulares e é convertido em 2’,7’diclorofluoresceína (DCF), tornando-se insolúvel em meio lipídico (mantendo-se no interior da célula) e fluorescente (ROYALL AND ISCHIROPOULOS, 1993). Após o período de incubação com os compostos C2 e C3 e a lavagem com o PBS, as células (5x105) foram tratadas com 500 µL da solução de DCFH-DA (10 µM) por 30 minutos. Em seguida, as suspensões celulares foram lavadas com o PBS e ressuspendidas em 500 µL de PBS. A fluorescência foi medida por citometria de fluxo FACSCalibur (Bencton Dickinson, USA) usando comprimentos de onda de excitação e emissão a 488 e 535 nm, respectivamente. O antioxidante, n-acetilcisteina (NAC), foi utilizado para inibir a produção das EROS nas células HL-60. Por isso as células foram pré-tratadas por 1 h 62 com o NAC (1 mM) e em seguida tratadas com os compostos C2 e C3 por 24 h. 3.2.11 Análise da expressão relativa do gene p21. O RNA total das células K562 foi extraído utilizando o reagente Trizol (Invitrogen, EUA) de acordo com o método desenvolvido por Chomczynski e Sacchi (1987). Após 24 horas de incubação com os compostos (C2 e C3), as células foram centrifugagas a 400 g e lavadas com o PBS duas vezes. O precipitado resultante foi adicionado 1 ml de Trizol e 200 μl de clorofórmio, esse complexo foi incubado por 5 minutos a 37°C e centrifugado por 15 minutos a 4°C e 16100 g. A fase superior foi coletada e o RNA foi precipitado com álcool isopropílico por 16 horas a -20°C. Uma nova centrifugação foi realizada e o precipitado de RNA foi então lavado com etanol 70% para posteriormente ser ressuspendido em água tratada com DEPC (dietilpirocarbonato). O RNA foi quantificado por espectrofotometria nos comprimentos de ondas de 260 e 280 nm e armazenado a -80C. A concentração do RNA foi estimada por absorbância ótica pela fórmula: [RNA] µg/µl = (A260fx40/1000), onde f é o fator de diluição e 40 é o fator de conversão. Contaminantes de DNA foram removidos com adição de DNase I (Ambion Inc., EUA) e a integridade do RNA total foi verificada através de um gel de agarose corado com 2 % de brometo de etídeo. Dois µg de RNA total foram utilizados como moldes para a síntese de cDNA na presença de 50 ng de iniciadores randômicos (random primers), 200 U de M-MLV RT (RevertAidTM H Minus Moloney murine leukemia virus-reverse transcriptase, Fermentas Inc., EUA), 200 U/l Rnase Out (Fermentas Inc., EUA), 0,5 mM de dNTPs, 2,5 mM de MgCl2, 1 X de tampão da M-MLV RT em um volume final de 20 l. O ciclo usado na reação foi de: 10 min a 20°C, 45 min a 42°C, 5 min a 95°C e 10 min a 4°C. Foi usado o termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, EUA) Depois da transcrição reversa, o cDNA foi submetido ao CFX96 Real Time System (Bio-Rad, EUA) usando Power SYBR Green Master Mix 63 (Biosystems, CA, EUA). Para a reação foi usado um volume final de 20µl, contendo 0.5 µM de iniciador (primer), 10µl of Power SYBR Green Master Mix 2X e 1µl de cDNA. As reações passaram por 45 ciclos depois da desnaturação inicial (95°C por 2 minutos) com os seguintes parâmetros: 95°C (desnaturação), 15s; 60°C (anelamento e extensão), 60s. Para cada experimento, a reação sem cDNA foi usada como controle negativo. Em adição, a ausência de contaminantes de DNA foi calculada em amostras de RT-negativo. A análise da curva de dissociação dos produtos da PCR foi obtida aquecendo as amostras de 60°C a 95°C a 0.1°C/s, afim de avaliar a especificidade dos iniciadores. A quantificação relativa da expressão gênica foi feita usando o método 2-∆∆Ct, como descrito abaixo, os dados foram normalizados pela expressão gênica de β-actina. Os primers foram sintetizados pela DNA Technologies (EUA). Para a realização de PCR nas células K562 foram utilizados os primers para os genes de interesse listados na tabela 3. A quantificação da amplificação gênica foi realizada pela determinação do limiar de ciclos (cycle threshold, Cq) baseado na fluorescência detectada dentro da região geométrica da curva semi-log do perfil de amplificação. Um perfil de amplificação para cada amostra foi gerado demonstrando o aumento na fluorescência do corante indicador (reporter dye fluorescence, Rn) para cada ciclo da PCR. De cada perfil de amplificação um valor de limiar do ciclo foi calculado, representando o número do ciclo da PCR em que a fluorescência foi detectada acima de um limiar arbitrário, com base na variabilidade das linhas de base dos quinze primeiros ciclos. A quantificação relativa da expressão do gene alvo foi avaliada usando o método comparativo do Cq como descrito previamente (MEDHURST et al., 2000). O valor de ΔCq foi determinado pela subtração do Cq de cada amostra do valor do Cq da β-actina respectiva para cada amostra usada como controle interno. O cálculo do ΔΔCq envolve o uso da média do ΔCq do grupo controle como uma constante arbitrária para subtrair de todos os outros valores médios de ΔCq. As mudanças na expressão gênica do gene de interesse são equivalentes a 2-ΔΔCq. Os valores foram analisados pela ANOVA seguida pela comparação pareada do teste de Tukey, com nível de significância de 5%. 64 Tabela 2: Sequencia dos primers utilizados na realização de PCR em K562. Genes Forward Reverse p21 5’-AGTCAGTTCCTTGTGGAG-3’ 5’-CATTAGCGCATCACAGTC-3’ β-actina 5’-CAGAGCAAGAGAGGCATCCT-3’ 5’-ACGTACATGGCTGGGGTGTTGAA-3’) 3.2.12 Análise da expressão de proteínas por Western blot 3.2.12.1 Preparo das amostras Foram preparados extratos totais a partir das células na situação de controle e após exposição com os compostos durante 24 horas. Depois, as células foram recolhidas e lavadas com PBS, os precipitados celulares obtidos foram incubados com tampão de lise - RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% deoxicolato de sódio e 0,1% de dodecil sulfato de sódio), suplementado com uma mistura de inibidores de proteases e inibidores de fosfatases, e 1 mM ditiotreitol (DTT). As amostras foram mantidas a 4°C durante 30 min com agitação regular. 3.2.12.2 Dosagem de proteína (Método de Bradford): A quantidade de proteína total presente no homogeneizado foi medida pelo método de Bradford (1976), utilizando BSA (Albumina de Soro Bovino) como padrão. Uma vez determinada a concentração de proteína de cada amostra, foi adicionado o tampão de amostras (115 mM tris-HCl pH 6,8; 15% SDS; 10% de glicerol; 100 mM de 2-β-mercaptoetanol; 0,1% de azul de bromofenol) e incubadas a 100°C por 5 minutos, sendo mantidas a -20°C até serem usadas. A quantidade de amostra determinada (50 μg/μL) foi submetida à eletroforese em gel de poliacrilamida 9% contendo SDS. 3.2.12.3 Eletroforese e electrotransferência As amostras foram analisadas por SDS-PAGE em gel de acrilamida de empilhamento (stacking gel) a 4% e de separação numa concentração de 12% 65 (w/v) durante 90 min a 110 V em solução tampão de eletroforese [Tris-HCl 50 mM (pH 8,0-8,5) contendo bicina 50 mM e 0,1% (m/v) de SDS]. Após a eletroforese, as bandas proteicas foram transferidas para a membrana de nitrocelulose utilizando-se tampão com 25 mM de tris, 193 mM de glicina e 20% de metanol. A transferência foi feita em cuba semisseca, por 90 min, sendo a amperagem estabelecida em função da área da membrana. 3.2.12.4 Imunodeteção de proteínas com anticorpos específicos Uma vez terminada a electrotransferência, as membranas foram bloqueadas com uma solução de 5% (m/v) de leite magro em tampão salina de Tris (TBS: Tris 20 mM, pH 7,6;NaCl 137 mM) contendo 0,1% (v/v) de Tween20 (TBS-T), durante 2 horas à temperatura ambiente com agitação suave de modo a evitar a ligação inespecífica aos locais livres na membrana. Em seguida, as membranas foram incubadas por 12 horas, a 4°C, com o anticorpo primário na diluição desejada (Tabela 2) em TBS-T com 1% (m/v) de leite magro, contendo 0,02% (v/v) de azida sódica. Terminada a incubação, as membranas foram lavadas com TBS-T 5 vezes durante 5 min cada lavagem, e em seguida foram incubadas com o respectivo anticorpo secundário conjugado com a fosfatase alcalina [anti-camundongo] durante 2 horas à temperatura ambiente, e com agitação. Por fim, as membranas foram novamente lavadas com TBS-T (5 vezes, 5 min), e depois reveladas com o reagente ECF. As bandas reativas foram visualizadas no Typhoon FLA 9000 (GE Healthcare Bioscience; Suécia). Tabela 3: Anticorpos primários e secundários usados na técnica de Western Blot, e respectivas diluições. Anticorpos Peso Dilução Marca Anticorpos Dilução primários molecular Bcl-2 26 kda 1:2000 Santa Cruz Anti-Camundongo 1:2000 BAX 23 kda 1:1000 Santa Cruz Anti-Camundongo 1:2000 ERK1/2 44 kda 1:2000 Santa Cruz Anti-Camundongo 1:2000 β-Actina 43 kda 1:2000 Santa Cruz Anti-Camundongo 1:2000 secundários 66 Para abordar o papel da fosforilação, pela rota das proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs), tais como a ERK e a p38, na apoptose induzida pelos compostos C2 e C3, a viabilidade celular das células HL-60 cotratadas com os inibidores PD98059 (50 μM) da ERK e SB203580 (20 μM) da p38 MAPK, com C2 (10 μM) e C3 (20 μM) durante 24 horas, foi medida pelo ensaio de MTT. 3.2.13 Análise de proteínas intracelulares por citometria de fluxo As células (1x106/poço) foram semeadas em placas de 24 poços e tradadas com os compostos C2 (10 μM) e C3 (20 μM) durante 24 h. Após as células foram lavadas e centrifugadas a 500 g, 10 min com o tampãp de lavagem (PBS, 1% de albumina de soro bovino). O precipitado foi ressuspendido em 250 μl do tampão de lavagem e as células foram fixadas adicionando 250 μl do tampão I de BDTM Phosflow fix e incubadas a 37°C no banho Maria durante 10 min. As células fixadas foram lavadas duas vezes por centrifugação a 500 g, 10 min. As células fixadas foram permeabilazadas com 250 μl do tampão III gelado de BDTM Phosflow Perm (EUA) em incubação no gelo durante 30 min e após centrifugadas e lavadas a 500 g, 10 min. Para a análise das proteínas BAX e citocromo C, as células fixadas e permeabilizadas foram incubadas com 1:200 a diluição de seus anticorpos primários respectivos durante 1 hora. Depois de lavar duas vezes com o tampão de lavagem, as amostras foram incubadas com anticorpo secundário de camundongo conjugado com FITC na dilução de 1:200 durante mais 1 hora. As amostras foram, em seguida, lavadas duas vezes com o tampão de lavagem antes da análise com a citometria de fluxo. 67 3.3 Análise estatística Os resultados ilustrados representam a média de pelo menos três experimentos independentes. Todos os dados são apresentados como a média ± erro padrão da media. As comparações foram feitas entre o grupo controle e os grupos tratados, usando ANOVA One way seguido do pós-teste de Dunnett, Newman-Keuls ou Tukey (GraphPad Prism 5, EUA), e as diferenças foram consideradas significativas quando p <0,05. Nos experimentos com o citômetro de fluxo, os resultados foram registrados a partir de 10.000 eventos e analisados utilizando o software CellQuest Pro (EUA). 68 4. Resultados 4.1 Efeito citotóxico dos compostos As atividades citotóxicas dos compostos expressos pelos valores de CI50 determinados pelo meio do ensaio de MTT estão resumidas na Tabela 4. As linhagens HL-60 e K562 foram os mais sensíveis aos compostos, comparadas com as demais. Excepcionalmente, o composto C7, com uma CI50 de 20 μM, apresentou atividade citotóxica apreciável na linhagem MCF-7. O composto C1 foi citotóxico em todas as linhagens cancerosas testadas, com CI50 variando entre 2,8 μM e 27,3 μM, no entanto foi também para PBMC (CI50 de 10,5 μM). Os derivados triazóis, particularmente o C2 e o C3, mostraram ser citotóxicos nas linhagens leucêmicas K562 e HL-60. O DMSO na concentração de 0,5% não afetou o crescimento das células quando tratado nas mesmas condições experimentais. Devido a alta toxicidade do C1 nas células controle, foram selecionados para uso nos próximos experimentos apenas os derivados triazóis C2 e C3 e somente as linhagens K562 e HL-60. 69 Tabela 4: Atividade citotóxica em IC50 dos compostos e etoposideo (ETO) em linhagens de câncer humano e normais. Compostos HL-60 K562 K562-Lucena MCF-7 HT-29 PBMC C1 2.8±0.5 13.8±0.3 nt 27.3±1.6 21.2±1.2 10.5±1.1 C2 14.3±2.2 41.7±2.3 73.7±1.4 62.7±1.2 >100 84.1±7.2 C3 24.2±3.5 81.5±2.4 77.2±2.7 >100 >100 99.2±9.9 C4 71.3±6.4 >100 >100 >100 >100 >100 C5 81.2±1.4 >100 >100 >100 >100 >100 C6 45.9±1.3 >100 >100 >100 >100 >100 C7 57.6±3.5 56.9±1.2 >100 20.0±1.5 >100 >100 C8 28.9±8.8 100.2±1.1 >100 nt >100 nt ETO 5.8±1.1 >50 nt >100 >100 >100 HL-60, K562, K562-Lucena linhagens leucêmicas humanas, MCF-7, linhagem celular de adenocarcinoma de mama, HT-29, linhagem celular de adenocarcinoma do cólon e as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram incubadas com os compostos durante 24 horas. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT. Os resultados são apresentados como CI50, em μM e expressos como a média ± erro padrão da média, obtido a partir de pelo menos três experiências independentes em triplicada. Não testado, nt. 70 4.2 Análise da viabilidade celular pela avaliação da integridade da membrana celular. Foi avaliada a redução da viabilidade celular, nas linhagens leucêmicas K562, HL-60 e também nas células normais (PBMC), provocado pelo dano à membrana plasmática. O efeito foi avaliado após 24 horas de exposição com as células, por meio da citometria de fluxo. Os compostos testados (C1, C2 e C3) demonstraram uma redução significativa (p<0,001) da viabilidade celular de ambas as linhagens K562 (Gráfico 1A, B e C) e HL-60 (Gráfico 2A, B e C). Essa redução da viabilidade celular foi dependente da concentração. O gráfico 1D revela que os compostos C1 (5 μM); C2 (20 μM) e C3 (20 μM) induziram a redução, respectivamente, de 41,9%; 48,7% e 45,7% da viabilidade celular de K562. As células HL-60 tratadas com os compostos C1 (2,5 μM); C2 (5 μM) e C3 (5 μM) resultaram na redução da viabilidade celular dessa linhagem de 43,5%; 55,6% e 53,1%, respectivamente (Gráfico 2D). Nas células normais (PBMC) os compostos C2 e C3 não causou dano à membrana plásmica, no entanto o composto C1 mostrou efeito no dano da membrana plasmática (Gráfico 3). O etoposidéo, utilizado como controle positivo e incubado durante 24 horas nas concentrações de 50 μM e 5 μM, induziu a redução da viabilidade celular de 10,5% em K562 e de 44,7% em HL-60. 71 Gráfico 1: Determinação da viabilidade celular pela integridade da membrana plasmática por citometria de fluxo nas células K562. B A C C1 (µM) C2 (µM) C3 (µM) Controle Controle C1 (5 µM) D 96.1 3.9 58.1 ETO (50 µM) C3 (20 µM) C2 (20 µM) 89.5 51.3 48.7 54.3 41.9 10.5 45.7 (A), (B) e (C) representa o efeito de C1, C2 e C3, respectivamente. (D) Ilustração representativa do padrão do histograma de viabilidade celular. A viabilidade foi determinada usando o ensaio de iodeto de propídeo, após 24 h de incubação com as drogas. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média de pelo menos três experimentos em triplicata. As barras pretas (controle) e etoposídeo (ETO). *** p <0,001 em comparação com o controle. 72 Gráfico 2: Determinação da viabilidade celular pela integridade da membrana plasmática por citometria de fluxo nas células HL-60. A B C C1 (µM) C2 (µM) Controle Controle C3 (µM) D 88.4 C2 (5 µM) 45.4 55.6 11.6 C1 (2,5 µM) 55.8 C3 (5 µM) 46.9 53.1 43.5 ETO (5 µM) 55.2 44.7 (A), (B) e (C) representa o efeito de C1, C2 e C3, respectivamente. (D) é a ilustração representativa do padrão do histograma de viabilidade celular. A viabilidade foi determinada utilizando o ensaio de iodeto de propídeo, após 24 h de incubação com as drogas. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média de pelo menos três experimentos em triplicata. As barras pretas (controle) e etoposídeo (ETO). *** p <0,001 em comparação com o controle. 73 Gráfico 3: Determinação da viabilidade celular pela integridade da membrana plasmática por citometria de fluxo nas PBMCs. C1 (μM) C3 (μM) C2 (μM) D Cont role C1 (10 μM) C2 (40 μM) C3 (40 μM) (A), (B) e (C) representa o efeito de C1, C2 e C3, respectivamente. (D) é a ilustração representativa do padrão do histograma de viabilidade celular. A viabilidade foi determinada utilizando o ensaio de iodeto de propídeo, após 24 h de incubação com as drogas. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média de pelo menos três experimentos em triplicata. 74 4.3 Efeito dos compostos no ciclo celular Para determinar se a atividade citotóxica dos compostos está relacionada com a indução à apoptose, as frações do ciclo celular foram analizadas por citometria de fluxo, tendo atenção maior com a fração sub-G1. Os resultados apresentados na Tabela 5 demonstram que, na linhagem celular K562, os compostos C2 e C3 não conseguiram aumentar a população das células em sub-G1 em relação ao controle (p> 0,05), mas induziram parada do ciclo celular na fase S quando incubadas com C2 (45 μM) e C3 (25 μM; 45 μM), oque corresponde a 35,2% e (33%; 33,4%) respectivamente. Em contraste, a incubação dos compostos C2 (10 μM; 25 μM) e C3 (10 μM; 25 μM) com as células HL-60 resultou num aumento significativo das células na fase sub-G1, para (34,2%; 64,1%) e (18,8%; 50,1%), respectivamente (Tabela 6). Como esperado, o etoposídeo (5 μM) induziu a parada do ciclo celular nas fases S e G2/M em K562 e aumentou a população das células em sub-G1 da linhagem HL-60. Para avaliar o efeito dos compostos na distribução do ciclo celular em células normais PBMC, o C2 (10 μM) e o C3 (20 μM) foram testados. Nenhum dos compostos aumentou a fração sub-G1, nem alterou o ciclo celular das células PBMC (Gráfico 4). 75 Tabela 5: Efeito dos triazóis (C2 e C3) sobre a distribuição do ciclo celular em K562. Fases Controle C2 C3 Eto 25 μM 45 μM 25 μM 45 μM 5 μM Sub-G1 0,4±0,1 0,7±0,1 0,7±0,1 0,5±0,1 0,5±0,0 0,8±0,1 G1 50,3±0,9 48,3±0,8 40,7±0,7 52,5±1,5 50,7±0,9 10,0±0,1 S 27,3±0,6 29,1±1,5 35,2±2,8*** 33,0±0,5*** 33,4±0,1*** 49,6±0,5*** G2/M 20,5±1,1 23,3±0,4* 22,0±0,4 15,2±2,1 16,9±1,5 40,3±0,5*** As células (5x105 por poço) foram tratadas durante 24 h com os compostos nas concentrações indicadas, a coloração com iodeto de propidio e analisadas por citometria de fluxo. Os dados são expressos como valores de percepção. Cada resultado foi realizada em duplicado e os dados são apresentados como média ± erro padrão da média de pelo menos três experiências independentes. * P <0,05; *** P <0,001 comparado ao controle. ETO: etoposidéo. 76 Tabela 6: Efeito dos triazóis (C2 e C3) sobre a distribuição do ciclo celular em HL-60. Fases Controle C2 10 μM C3 25 μM ETO 10 μM 25 μM 5 μM Sub-G1 10,3±0,6 34,2±3,9*** 64,1±4,8*** 18,8±3,0* 50,1±9,1*** 72,9±2,4*** G1 53,8±1,4 35,9±2,2 22,6±2,4 40,8±1,4 27,4±5,0 5,0±0,7 S 20,5±1,2 16,7±0,7 9,7±1,9 21,5±0,2 13,0±2,2 10,5±1,5 G2/M 14,9±1,6 12,8±1,1 3,6±0,7 18,4±1,4 9,2±1,9 12,7±1,5 As células (5x105 por poço) foram tratadas durante 24 h com os compostos nas concentrações indicadas, coradas com o iodeto de propídeo e analisadas por citometria de fluxo. Os dados são expressos como valores de percepção. Cada resultado foi realizado em duplicado e os dados são apresentados como média ± erro padrão da média de pelo menos três experiências independentes. * P <0,05; *** P <0,001 comparado ao controle. ETO: etoposidéo. 77 Gráfico 4: Histogramas representativos do efeito dos compostos C2 e C3 na distribuição do ciclo celular em PBMC após 24 horas de incubação. Sub-G1: 3,95 G1: 51,40 S: 25,12 G2/M 20,43 Sub-G1: 3,05 G1: 51,89 S: 24,29 G2/M 21,01 Sub-G1: 4,15 G1: 50,49 S: 25,02 G2/M 19,89 As células (5x105 por poço) foram tratadas durante 24 horas com os compostos nas concentrações indicadas. Depois as células foram tratadas com o iodeto de propídeo e analisadas por citometria de fluxo. 78 4.4 Avaliação do dano do material genético A condensação e a fragmentação do DNA genômico são eventos característicos da morte celular por apoptose que ocorre nas etapas finais da mesma. Assim, se avaliou estes eventos por microscopia de fluorescência e eletroforese em gel de agarose. A Figura 12A mostra que os compostos testados induziram a fragmentação do DNA em células HL-60 após 24 horas de tratamento. Alem disso, os compostos induziram a condensação do material genético dessa linhagem (Figura 13). Nas células K562, C2 (45 μM) e C3 (45 μM) não foram capazes de induzir a fragmentação do DNA até 24 horas de exposição (Figura 12B). Como esperado, o etoposidéo, 5 μM em HL-60 e 50 μM em K562, indiziu a fragmentação do DNA em ambas as linhagens celulares, após 24 horas de exposição, porém o efeito foi menos intenso em K562. A HL-60 B 3000 bp 3000 bp 2000 bp 1500 bp 2000 bp 1000 bp 500 bp 300 bp K562 1500 bp 1000 bp 500 bp 200 bp 300 bp 200 bp 100 bp 100 bp Figura 12: Analise da fragmentação do DNA por eletroforese nas células HL-60 e K562. As figuras são representativas de dois experimentos independentes. (A) A pista 1 é o marcador; pista 2 é o controle de HL-60 (sem tratamento); pista 3 é o etoposideo (5 μM); pista 4 é C2 (10 μM) e a pista 5 é C3 (20 μM). (B) A pista 1 é o marcador; pista 2 e 3 são os controles de K562 (sem tratamento); pista 4 é C2 (45 μM); pista 5 é C3 (45 μM) e a pista 6 é o etoposideo (50 μM). 79 Controle ETO (5 μM) C2 (10 μM) C2 (25 μM) C3 (10 μM) C3 (25 μM) Figura 13: indução da condensação do material genético. As células (5x104/poço) foram tratadas durante 24 h com os compostos nas concentrações indicadas, coradas com a laranja de acridina e observadas no microscópio de fluorescência. As figuras são representativas de dois experimentos diferentes. As setas brancas indicam a condensação do material genético. ETO: Etoposideo.Aumento de 400 vezes. 80 4.5 Efeito dos compostos na despolarização do potential da membrana mitocondrial Já é conhecido que a perda do potencial da membrana mitocondrial é um dos primeiros eventos que ocorrem durante a apoptose. Assim, investigouse se o efeito citotóxico dos compostos triazóis pode estar relacionado a esse evento bioquímico. Como mostrado no gráfico 5, os compostos C2 (10 - 45 μM) e C3 (10 - 45 μM) induziram a despolarização da membrana mitocondrial das células HL-60 para ( de um modo dependente da concentração (p <0,05). Enquanto C2 (45 μM) e C3 (45 μM) apresentaram apenas um ligeiro efeito de 20,4% e 13,3%, respectivamente, nas células K562 (Gráfico 11A e B). Os compostos não mostraram efeito em PBMC (Gráfico 6). 81 Gráfico 5: Avaliação do efeito de C2 e C3 sobre a despolarização da membrana mitocondrial. A C2 (µM) B C3 (µM) C Cont . C2 (25 μM) C2 (25 μM) HL-60 Cont . C2 (25 μM) C2 (25 μM) K562 As células (5x105/poço) foram semeadas em placas de 24 poços e tratadas com os compostos C2 e C3 nas concentrações indicadas durante 24 h. (A) e (B) representam os efeitos de C2 e C3 respectivamente; (C) histogramas representativas. Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média de pelo menos três experimentos independentes. Cont. (controle); * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001 versus o controle. 82 Gráfico 6: Avaliação do efeito de C2 e C3 sobre a despolarização da membrana mitocondrial em PBMC. C2 (μM) C3 (μM) As PBMC (5x105/poço) foram semeadas em placas de 24 poços e tratadas com os compostos C2 e C3 nas concentrações indicadas, durante 24 h. Os resultados são apresentados como média ± erro padrão da média de pelo menos três experimentos independentes em duplicata. Cont. (controle). 83 4.6 Avaliação da exteriorização da fosfatidilserina A análise da exteriorização da fosfatidilserina em culturas de células expostas aos compostos testados durante 24 horas foi realizada por citometria de fluxo utilizando dois corantes fluorescentes, o IP e a anexina V, que marcam respectivamente o DNA e os resíduos de fosfatidilserina. Verificou-se que os compostos testados induziram significativamente a externalização da fosfatidilserina nas células HL-60 (p <0,05) de um modo dependente da concentração (Gráfico 7A). Essa externalização da fosfatidilserina também foi observida no microscópio de fluorescência (Figure 14). Estes resultados sugerem que, os compostos C2 e C3 induziram a apoptose em HL-60. Como mostrado no Gráfico 7B, as células K562 não apresentaram um aumento significativo na externalização da fosfatidilserina (p>0,05), quando foram tratadas com os compostos C2 e C3 nas várias concentrações. Mesmo o etoposídeo a 50 μM não foi capaz de induzir a externalização da fosfatidilserina nesta linhagem. Em contraste, de todas as concentrações dos compostos testados, apenas nas concentrações elevadas, se observa o aumento do número das células marcadas positivamente com o IP (p <0,05), sugerindo a indução da necrose nas células K562. 84 Gráfico 7: Avaliação da indução da apoptose e da necrose nas células HL60 e K562 pelos compostos C2 e C3. A C2 (µM) C3 (µM) C2 (µM) C3 (µM) B C Cont role C2 (25 μM) C3 (25 μM) ETO (5 μM) HL-60 Cont role C2 (45 μM) C3 (45 μM) ETO (50 μM) K562 As células (5x105/poço) foram tratadas com as concentrações indicadas, durante 24 horas, lavadas com PBS e coradas com anexina V/PI. A análise foi feito por citometria de fluxo. Os resultados foram representados como média ± erro padrão da média de três experimentos diferentes realizados em duplicata. (A) e (B) mostram respectivamente os efeitos em HL-60 e K562. (C) Mostra os citogramas representativos * p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001 versus o controle. 85 Controle C2 (10 μM) C3 (10 μM) ETO (5 μM) C2 (25 μM) C3 (25 μM) Figura 14: Efeito do C2 e C3 na externalização da fosfatidilserina As células (5x104/poço) foram tratadas durante 24 h com os compostos nas concentrações indicadas, coradas com a anexina V-Alexa Fluor e observadas no microscópio de fluorescência. Pares de figuras: de fundo escuro, sonda excitada, à direita; e de fundo claro sem excitação, figuras a esquerda. As figuras são representativas de dois experimentos diferentes. ETO: Etoposideo. Aumento de 400 vezes. 86 4.7 Avaliação da expressão do RNAm do p21 O ciclo celular é um processo muito bem controlado por algumas proteínas como as cíclinas, as quinases dependentes de cíclinas e seus inibidores. Como o efeito dos compostos C2 e C3 nas células K562 revelou uma parada do ciclo celular, precisamente na fase S, e para saber se esse efeito dos compostos está relacionado com a regulação de uma proteína implicada no controle do ciclo celular, foi analisado o nível de expressão do gene p21, inibidor dos complexos ciclina A/CDK2 e ciclina E/CDK2, nas células K562 tratadas com os compostos C2 e C3 durante 24 horas. O gráfico 8 mostra que ambos os compostos C2 (45 μM) e C3 (45 μM) induziram 14 vezes o aumento da expressão do RNAm do p21 nas células tratadas. Gráfico 8: Expressão do RNAm do p21 nas células K562. As células K562 (5x106/poço) foram incubadas com os compostos C2 e C3 à concentração de 45 μM durante 24 horas. O nível do RNAm do p21 foi analisado por q-PCR. A expressão da β-actina foi usada como controle interno. Os resultados foram representados como média ± erro padrão da média de dois experimentos diferentes realizados em triplicata. ** p <0,01 versus o controle. 87 4.8 Análise da expressão das proteínas BAX e Bcl-2 Para melhor investigar o mecanismo pelo qual os compostos induzem a apoptose na linhagem HL-60, a expressão de várias proteínas associadas a esta via foi avaliada. Uma vez que a via apoptótica mitocondrial tem sido descrita como uma sinalização importante de morte celular por apoptose em células de mamífero, foi analisado por Western blot as alterações nos níveis da proteína proapoptótica BAX e da proteína anti-apoptótica Bcl-2. Essas proteínas desempenham um papel importante na regulação da apoptose mediada por mitocôndria. Como mostrado na Figura 15, a exposição das células HL-60 com varias concentrações dos compostos C2 ou C3 durante 24 horas, aumentou a expressão da proteína pró-apoptótica BAX com uma concomitante diminuição na expressão da proteína anti-apoptótica Bcl-2. O aumento da expressão de BAX nas células HL-60 tratadas com C2 e C3 foi confirmado por citometria de fluxo (Gráfico 9). C2 (μM) Cont. ETO 10 20 C3 (μM) 10 20 BAX Bcl-2 β-Actina Figura 15: Efeito de C2 e C3 na expressão das proteínas associadas a apoptose nas células HL-60. As células HL-60 (5x106 por poço) foram tratadas com as concentrações indicadas de C2 e C3 durante 24 horas. As células foram lisadas e a expressão das proteínas Bcl-2 e BAX foram analisadas por western blot. A β-actina foi usada como padrão interno. Cont.: Controle; ETO: Etoposideo (5 μM). 88 Gráfico 9: Efeito do C2 e C3 na expressão da proteína BAX nas células HL-60. A B Controle C2 (10 μM) C2 (20 μM) ETO (5 μM) C2 (μM) C Controle C3 (10 μM) C3 (20 μM) ETO (5 μM) D C3 (μM) As células (1x106/poço) foram semeadas em placas de 24 poços e tradadas com os compostos C2 e C3 durante 24 h. Após incubação, as células foram lavadas e tratadas com o anticorpo primário e em seguida com o secundário marcado pelo FITC. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo. O deslocamento dos histogramas para a direita em relação o controle indica um aumento da expressão de BAX (A e C), que são histogramas representativos e (B, D) gráficos da análise estatística. Os resultados são representativos de dois experimentos em duplicata.*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 versus o controle. 4.9 Avaliação da via de indução da apoptose em HL-60 O citocromo C é uma proteína que é armazenada no espaço intermembranas da mitocôndria, participando do transporte de elétrons da cadeia respiratória. Uma vez liberado dentro do citosol, esta proteína é capaz de formar um complexo com o APAF-1, a pro-caspase 9 e o ATP chamado apoptossomo e desencadeia a morte por apoptose via ativação de caspase 3. 89 O gráfico 10 mostra que os compostos C2 e C3 induziram a liberação do citocromo C dentro do citosol nas células HL-60. Gráfico 10: Gráfico 10: Efeito do C2 e C3 na liberação do citocromo C dentro do citosol nas células HL-60. Controle C2 (10 μM) C2 (20 μM) ETO (5 μM) C2 (μM) C Controle C3 (10 μM) C3 (20 μM) ETO (5 μM) D C3 (μM) As células (1x106/poço) foram semeadas em placas de 24 poços e tradadas com os compostos C2 e C3 durante 24 h. Após tratamento, as células foram lavadas e tratadas com o anticorpo primário e em seguida com o secundário marcado pelo FITC. As amostras foram analisadas por citometria de fluxo. O deslocamento dos histogramas pela direita em relação o controle indica um aumento do nível de citocromo C citosolica. (A, C) histogramas representativos e (B, D) gráficos da análise estatística. Os resultados são representativos de dois experimentos em duplicata.*p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 versus o controle. 90 4.10 Nível de EROS intracelulares e efeito do NAC Tem sido demonstrado que as EROS estão implicadas nas atividades pró-apoptóticas de uma variedade de agentes anticânceres. Para explorar o envolvimento de EROS no mecanismo de apoptose induzido pelos compostos triazóis testados, o fluoróforo DCFH-DA foi usado para medir a produção de EROS na cultura de células tratadas com os compostos C2 e C3. Como mostrado no gráfico 11, os níveis de EROS foram aumentados nas células HL60 de um modo dependente da concentração. As células K562 foram resistentes à produção de EROS. De fato, H2O2 (400 μM) induziu apenas 36,4% de aumento no nível de EROS nas células K562. Nas células normais PBMC também não houve um aumento do nível de produção de EROS intracelular quando tratadas com o C2 (10 μM) e C3 (20 μM) (Gráfico 12). A produção de EROS intracelular nas células HL-60 foi diminuída quando as células foram co-cultivadas com os compostos e o antioxidante Nacetil-cisteina (NAC, 1 mM) (Gráfico 13). Para determinar se as EROS estavam envolvidas na apoptose induzida pelos compostos, o NAC (1 mM) foi co-incubado com os compostos C2 (10 μM) e C3 (20 μM). Após 24 horas de co-incubação, A NAC foi capaz de manter a viabilidade das células, frente ao efeito citotóxico dos compostos (Gráfico 14) e também diminuiu significativamente a indução da apoptose nas células HL-60 (Gráfico 15). O que demonstra a participação das EROS na indução da apoptose nas células HL-60. 91 Gráfico 11: Avaliação do nível de EROS intracelulares após 24 h de tratamento com os Compostos. C2 (µM) C3 (µM) As células (5x105) foram tratadas com as concentrações indicadas, durante 24 horas. A produção de EROS foi determinada por citometria de fluxo utilizando o DCFH-DA. H2O2 (400 μM) foi utilizado como controle positivo. Os resultados representam a média ± erro padrão da média de três experimentos diferentes realizados em duplicata. *p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 comparado com o controle; Cont. (controle). 92 Gráfico 12: Gráfico 12: Avaliação do nível de produção de EROS em PBMC. A Controle C2 C3 B As células (5x105) foram tratadas com as concentrações indicadas, durante 24 horas. A produção de EROS foi determinada por citometria de fluxo utilizando o DCFH-DA. (A) histograma representativo e (B) gráfico da análise estatística. Os resultados são representativos de dois experimentos em duplicata. C2 (10 μM) e C3 (20 μM). 93 Gráfico 13: Inibição da produção de EROS intracelular pelo NAC nas células HL-60 tratadas com C2 ou C3. A C Controle C2+NAC C2 B Controle C3+NAC C3 D As células (5x105) foram pré-incubadas com o NAC (1 mM) e 1 h depois tratadas com C2 (10 μM) ou C3 (20 μM), durante 24 horas. A produção de EROS foi determinada por citometria de fluxo utilizando o DCFH-DA. (A, C) histogramas representativos e (B, D) gráficos da análise estatística. Os resultados são representativos de três experimentos em duplicata. ***p<0,001 comparado com controle; ###p<0,001 comparado com o grupo tratado só com C2 ou C3. 94 Gráfico 14: Efeito do NAC sobre a citotoxicidade do C2 (A) e C3 (B) nas células HL-60. A ** ## *** B ** ## *** As células (5x105) foram pre-tratadas com o NAC (1 mM) e 1 h depois com C2 (10 μM) ou C3 (20 μM), durante 24 horas. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT. Os dados são expressos como a média ± erro padrão da média, obtido a partir de três experimentos independentes em triplicada. **P<0,01; ***p<0,001 versus o controle. ##p <0,01 versus o grupo tratado só com C2 ou C3. 95 Gráfico 15: Efeito do NAC na indução da apoptose nas células HL-60. A Cont role C2 (10 μM ) + NAC (1 mM ) C2 (10 μM) 5 5 5 4 4 4 3 3 3 2 2 2 1 1 1 1 2 3 4 C3 (20 μM) 5 1 2 3 4 1 5 C3 (20 μM) + NAC (1 mM) 2 3 4 5 NAC (1 mM ) 5 4 3 2 1 1 2 3 4 5 B C As células (5x105/poço) foram semeadas numa placa de 24 poços e incubadas com C2 e C3 só e com o NAC durante 24 h. A externalização da fosfatidilserina foi analisada por citometria de fluxo utilizando o kit anexina V-Alexa fluor/PI. As experiências foram realizadas três vezes em triplicado. *** P <0,001 versus o controle; ## P <0,01; ### P <0,001 versus o grupo tratado só com C2 ou C3. 96 4.11 Investigação da via de MAPK O tratamento com os compostos C2 e C3 diminuiu significativamente a viabilidade celular em relação ao grupo controle. Por outro lado, a viabilidade das células foi reduzida quando tratadas com PD98059 (50 μM), apenas. Incubando apenas SB203580 (20 μM), não se verificou efeito na redução da viabilidade celular. O co-tratamento dos compostos C2 e C3 com os inibidores da ERK e da p38 MAPK reduziu a viabilidade celular, quando comparando ao controle. Em comparação com o tratamento com os compostos C2 e C3 incubados separadamente, o co-tratamento com o inibidor da ERK (PD98059) diminuiu a viabilidade celular (p<0,05) (Gráfico 16). Também foi investigado o nível de expressão da proteína ERK e a sua forma fosforilada (p-ERK) pelo ensaio de western blot. O resultado na Figura 16 mostra que os compostos induziram a acumulação da proteína ERK não fosforilada com uma diminuição simultânea da forma fosforilada. Esse resultado sugere que os compostos C2 e C3 atuam inibindo a fosforilação da proteína ERK. Portanto, a via de ERK pode ser um possível alvo no qual os compostos induzem a apoptose nas células HL-60. 97 Gráfico 16: Participação das MAPKs na inibição da proliferação celular induzido pelos compostos. A *** *** *** # *** B *** *** # *** *** As células HL-60 foram tratadas com o PD98059 e SB203580, com ou sem o C2 (A) e o C3 (B) durante 24 horas. A viabilidade das células foi medida pelo ensaio de MTT. Os dados são apresentados como a média ± erro padrão da média, obtidos a partir de três experimentos independentes. ***p<0,001 versus o controle; # p<0,05 comparado com o grupo tratado só com C2 ou C3. 98 C2 (μM) Cont. ETO 10 C3 (μM) 20 10 20 p-ERK 1/2 0,78 0,67 0,68 0,55 0,69 0,59 0,35 0,50 0,63 0,70 0,53 0,69 ERK 1/2 β-actina Figura 16: Efeito de C2 e C3 na expressão da proteína ERK em células HL60. As células (5x106) foram tratadas com as concentrações indicadas durante 24 horas. As proteínas totais foram extraído, quantificado e 50 μg de proteínas foram colocadas em cada poço do gel. A expressão das proteínas ERK e p-ERK foram analisadas por western blot usando anticorpos específicos. Os valores abaixo das bandas representam o nível de expressão da proteína, relativo à β-actina. 99 Discussão A química medicinal é dedicada à descoberta e desenvolvimento de novos agentes para o tratamento de doenças. Os compostos inorgânicos continuam a ser importantes na terapêutica, mas as moléculas orgânicas, com atividades farmacológicas cada vez mais específicas, são claramente dominantes. Um dos principais objetivos da química medicinal é o de produzir novos compostos que possam ser usados como medicamentos para a prevenção, o tratamento e a cura das doenças dos seres humanos ou animais (SHANGHAL et al., 2011). Embora a demanda por novos materiais químicos e moléculas biologicamente ativas continue a crescer, os químicos medicinais começaram a explorar o vasto conjunto de compostos potencialmente ativos (AGALAVE et al., 2011). As naftoquinonas podem servir como exemplo desta estratégia, combinando o núcleo 1,4-naftoquinona, com o núcleo 1,2,3-triazol. Foi nesse contexto que este trabalho, teve como objetivo avaliar o potencial citotóxico de novos compostos triazóis derivados do núcleo 1,4naftoquinona. Os testes de citotoxicidade in vitro são importantes para verificar a toxicidade de novos compostos nos estágios iniciais de desenvolvimento do fármaco (PUTNAM et al., 2002). Também são úteis e necessários tanto para definir a citotoxicidade basal, ou seja, a habilidade intrínseca de um composto em causar alterações e morte celular, que é uma consequência do dano às funções celulares básicas, como para definir o limite de concentração para testes in vitro posteriores, Além de também fornecer informações significativas sobre outros parâmetros celulares a serem pesquisados (EISENBRAND et al., 2002). Neste estudo foi utilizado o ensaio de MTT para avaliar os efeitos citotóxicos dos compostos testados em linhagens celulares cancerígenas HL60, K562, K562-Lucena, MCF-7 e HT-29 e também em células normais PBMC. 100 HL-60 e K562 são as linhagens que mais mostraram sensibilidade aos compostos. A azida que foi usada como precursora para a síntese dos derivados triazóis apresentou uma toxicidade elevada nas células normais PBMC. No entanto, os derivados foram menos tóxicos em PBMC, pois apresentaram IC50 acima de 80 μM. Então, a ciclização do grupamento funcional azida do composto C1 em triazol parece atenuar a toxicidade dos derivados triazóis resultantes. Além disso, o tipo de grupamento substituído na posição C-4 no anel do triazol é muito importante para a seletividade dos compostos resultantes. De fato, a introdução de um grupamento apolar na posição C-4 resultou em derivados triazóis (C2 e C3), com melhor seletividade para as células cancerosas do que a introdução de um grupamento polar (C4 e C5). Esses resultados sugerem que variar a natureza química do substituinte na posição C-4 do anel triazol é importante para desenvolver novos compostos com melhores atividades citotóxicas. Neste trabalho, demonstramos que alguns triazóis derivados a partir de 1,4-naftoquinona possuem potencial efeito citotóxico. Vários autores já relataram também, que combinando o núcleo 1,2,3-triazol com outros farmacóforos é possível obter novos compostos com atividades citotóxicas atraentes. Assim, uma série de 1,2,3-triazóis combinados com as podofilotoxinas foram sintetizados, a maioria desses compostos mostraram ser mais potentes do que o etoposidéo em várias linhagens celulares de cânceres humanos (SF-295, A-549, PC-3, Hep-2, HCT-15 e MCF-7) (REDDY et al., 2011). Alem disso, outra série de 1,2,3-triazóis análogos de combretastatina A4, preparados por Odlo e colaboradores (2008), mostrou que um dos análogos triazóis exibiu uma atividade citotóxica potente contra várias linhagens celulares de cânceres humanos (MDA-MB231, SK-BR3, SKOV, OVCAR, WM35, WM239) com valores de CI50 na ordem de nanomolar. Outros 1,2,3triazóis, que possuem como grupo farmacofórico o híbrido β-lactam-chalcona bifuncionais, foram sintetizados por Singh e colaboradores (2012). Estudos preliminares sobre essas moléculas mostraram que vários desses compostos exibiram atividades citotóxicas. Outra característica citotóxica que foi utilizada para avaliar nossos compostos foi a análise da integridade da membrana plasmática. Esse ensaio 101 foi realizado pela citometria de fluxo com o auxilio do fluorocromo IP. Esta análise mostrou que os compostos apresentaram efeito sobre a membrana plasmática, tanto nas células K562, como nas células HL-60. Como a necrose é o mecanismo de morte mais conhecido, implicando em dano a membrana plasmática, os resultados obtidos mostravam este possível efeito citotóxico. Entretanto, não foi o que se observou quando fomos analisar o tipo de morte induzido pelos compostos usando a técnica de dupla marcação com a anexina V e o IP. Assim, o efeito observado estaria ligado ao mecanismo pelo qual os compostos atravessam a membrana plasmática. No trabalho de Hussein et al. (2013) foi demonstrado que as naftoquinonas possuem capacidades de interagir com os fosfolipídios da membrana plasmática e induzir sua desorganização. Isso pode ter acontecido com os nossos compostos. De fato, compostos que são lipófilicos típicos, como os óleos essenciais, também passam através da membrana citoplasmática, afetando a estrutura das diferentes camadas de polissacarídeos e dos fosfolípidos, possibilitando a permeabilização da membrana. A citotoxicidade desses compostos parece incluir tais danos de membrana (BAKKALI et al., 2008). Mas na concentração menor o efeito desses compostos sobre a membrana não permite a indução da necrose, apenas quando a concentração testada for maior (SHARMA et al., 2010). Tem sido reconhecido que a regulação alterada do ciclo celular é uma indicação do crescimento dos tumores, por isso constitui um importante alvo no tratamento do câncer (GHOBRIAL et al., 2005). A análise do ciclo celular mostrou que no intervalo de 24 horas, os compostos C2 e C3 induziram a parada do ciclo celular nas células K562 na fase S. Na linhagem HL-60 os compostos induziram uma acumulação das células em sub-G1. A fase sub-G1 corresponde a um grupo de células com dano no material genético, ou seja formação de células apoptóticas. Isso sugere uma possivel indução da apoptose pelos compostos C2 e C3 em HL-60. A alteração observada no ciclo celular das células K562 indica que é provavelmente um dos principais mecanismos responsáveis pela ação anticancérigeno dos compostos C2 e C3 nessas células leucêmicas. 102 Os genes supressores de tumor como p53, p21 e p27 atuam com papel crítico na regulação do ciclo celular (COQUERET, 2003; VOUSDEN & LANE, 2005). O p21 é um dos membros da família das proteínas Cip/Kip; essas proteínas promovem a parada do ciclo celular pelo fato de eles se ligarem e inibirem as CDKs (NATH, 2005). Estas últimas, quando acopladas com suas cíclinas específicas, facilitam a progressão ordenada do ciclo celular. O p21 também é estreitamente regulado no nível transcripcional pelo p53 e, provavelmente, serve como efetor do p53 no controle do ciclo celular (NATH, 2005). Alguns autores relatam que os compostos à base de triazol possuem a capacidade de inibir as proteínas quinases (DHIGE et al., 2012; LE CORRE et al., 2010). Nesse estudo demonstramos que os compostos C2 e C3 após 24 h de incubação com as células K562 induziram o aumento da expressão do gene p21. Isso pode justificar o efeito dos compostos na parada em fase S do ciclo celular em K562. Várias mudanças na biogênese e na função da mitocôndria estão associadas com a indução da apoptose. A queda do potencial da membrana mitocondrial ocorre antes da fragmentação do DNA em fragmentos oligonucleossomal (MIGNOTTE & VAYSSIERE, 1998). O papel bem esclarecido da mitocôndria no processo da apoptose é a liberação de moléculas pró-morte no interior do citosol. Uma destas moléculas é o citocromo c, que atua nas mitocôndrias como um transportador de elétrons. Uma vez libertado para o citosol, ele ativa Apaf-1, o que por sua vez ativa a caspase-9 e caspase-3 (ZOU et al., 1997). Smac/Diablo é outra molécula pró-morte que tem sido demonstrado ser libertada da mitocôndria durante o processo apoptótico. Esta molécula ativa as caspases, impedindo a inibição dos IAPs (GOYAL, 2001). O fator de indução da apoptose (AIF) é outra molécula libertada da mitocôndria durante a apoptose. Quando liberado da mitocôndria, AIF leva à condensação da cromatina e fragmentação do DNA em larga escala (SUSIN, et al., 1999). Assim, a mitocôndria pode fazer contribuições substanciais para o processo de apoptose, uma vez que todos esses fatores armazenados dentro do espaço intermembranas da mitocôndria são liberados no interior do citosol. A liberação dessas proteínas mitocondriais está no controle das proteínas da família de Bcl-2. Os membros da superfamília de proteínas Bcl-2, que incluem 103 as anti-apoptóticas (Bcl-2, Bcl-XL e Bcl-w) e as pró-apoptóticas (Bax, Bak, Bad, Bim e Bid), são importantes na permeabilização da membrana externa mitocondrial (KELEKAR & THOMPSON, 1998; WONG & PUTHALAKATH, 2008). A diminuição da expressão do Bcl-2 e/ou o aumento da expressão de Bax, conduz à redução da proporção Bcl-2/Bax, o que leva à disfunção mitocondrial, desencadeando consequentemente, submete à ativação as células da cascata à de apoptose caspase e, (WONG & PUTHALAKATH, 2008). Os compostos C2 e C3 apresentaram efeito na despolarização da membrana mitocondrial na linhagem HL-60. Porém, em K562 os compostos não mostraram ter efeito sobre a membrana mitocondrial. Além disso, a análise da expressão das proteínas Bcl-2 e BAX revelou que nas células HL-60 quando tradadas com os compostos durante 24 horas, mostrou diminuição da expressão da proteína Bcl-2 e paralelamente um aumento da expressão da proteína BAX. Mais ainda, os compostos induziram a liberação do citocromo C no citosol. Com esses dados podemos afirmar que em HL-60 o efeito citotóxico dos compostos é devido à indução da apoptose e implica a via intrínseca. A indução da apoptose é usada como uma estratégia para o tratamento do câncer. A compreensão da apoptose forneceu a base para novas terapias direcionadas para a quimioterapia do câncer (GHOBRIAL et al., 2005). A apoptose é uma forma de morte celular, que desempenha um papel muito importante durante o desenvolvimento e a homeostasia dos organismos multicelulares. Muitas evidências mostram que o processo de apoptose requer maquinário especializado (GERL & VAUX, 2005; GHOBRIAL et al., 2005). Os passos iniciais da apoptose incluem a condensação da cromatina, a vesiculação da membrana nuclear e a retração do citoplasma. As etapas tardias incluem a perda da aderência, a degradação do DNA, a condensação do citoplasma e a formação de corpos apoptóticos (COMPTON, 1992; GERCHENSON & ROTELLO, 1992). Uma das técnicas mais usadas para a confirmação da apoptose é a identificação dos fragmentos de DNA (WYLLIE, 1980). Tipicamente, a apoptose envolve a clivagem intra-nucleossomal da cromatina com endonucleases em múltiplos de 180 pb que levam à produção dos fragmentos de DNA típicos (LECOEUR et al., 1997). Para elucidar se os 104 compostos C2 e C3 diminuem a sobrevivência das células HL-60 e K562 por indução da fragmentação de DNA, o DNA genômico foi isolado a partir das células expostas aos compostos e submetido à eletroforese. O tratamento das células HL-60 levou a fragmentação do DNA como esperado para células em apoptose. Também, foi observado por microscopia de fluorescência a condensação do material genético nas células HL-60 tratadas com C2 ou C3. Nas células K562 não foi observado à fragmentação do DNA. Esses resultados confirmam os obtidos na citometria que mostrou acúmulo das células HL-60 tratadas com os compostos na fase sub-G1. A presença do pico sub-G1 no histograma da distribuição de DNA é indicadora de um grupo de população de células em apoptose (LECOEUR et al., 1997; WYLLIE, 1980). A fosfatidilserina ocorre exclusivamente na camada interna da membrana plasmática em células viáveis, mas fica exposta na camada externa normalmente durante as fases iniciais de apoptose e antes da perda da integridade da membrana. (BHUSHAN et al., 2006). A externalização da fosfatidilserina foi verificada nas células HL-60 tratadas com os compostos C2 ou C3, o que confirma claramente o acontecimento da apoptose nessa linhagem; enquanto nas células K562 à maior concentração observa-se a indução da necrose. O mecanismo de citotoxicidade induzida por alguns derivados triazóis foi recentemente relacionado com a indução da parada do ciclo celular e a apoptose (DUAN et al., 2013; MAJEED et al., 2013). Também foi demonstrado que os triazóis derivados do ácido betulínico induziram a apoptose em linhagens celulares de leucemia (THP-1 e HL-60) por meio da perda do potencial de membrana mitocondrial e da fragmentação de DNA (MAJEED et al., 2013). Estes relatos estão de acordo com os nossos resultados, pois foi demonstrado que os derivados triazóis de 1,4-naftoquinona (C2 e C3) são também indutores de apoptose em células HL-60. A iniciação da apoptose resulta de sinais de duas vias distintas, mas convergentes: as vias extrínseca e intrínseca. A via intrínseca é muitas vezes referida como a morte celular mediada pela mitocôndria, e resulta na ativação do iniciador caspase 9. A caspase 8 é a caspase iniciadora da via extrínseca, que também é conhecida como a via induzida pelo receptor de morte (CHEUNG et al., 2006). A indução da apoptose nas células HL-60, pelos 105 compostos C2 e C3, pode ser mediada pela via intrínseca, devido os seus papeis na despolarização da membrana mitocondrial, mas também devido de seus efeitos na liberação do citocromo C dentro do citosol. Nesse estudo a linhagem K562 se mostrou resistente na indução da apoptose. Dessa forma, esta resistência pode estar associada com a expressão da proteína oncogênica BCR-ABL quinase, que é um fator de resistência dessa linhagem de leucemia mielóide crônica na indução da apoptose (MCGAHON et al., 1997). O estresse oxidativo é considerado uma condição importante para promover a morte celular em resposta a uma variedade de sinais. As EROS podem ativar uma série de vias de sinalização e também são mediadores da apoptose por meio de um mecanismo dependente da mitocôndria (BIRONAITE et al, 2004; FLEURY et al, 2002). Neste contexto, a geração de EROS mitocondrial modifica a permeabilidade da membrana, resultando na despolarização da mitocôndria, a relocalização de BAX, a libertação do citocromo C, e a ativação das caspases (ASCHE, 2005;. FLEURY et al, 2002). Além disso, a geração de EROS também está correlacionada com a diminuição do potencial da membrana mitocondrial. De fato, tem-se demonstrado que as EROS podem induzir a despolarização da membrana mitocondrial, por sua vez levar à ativação da via de apoptose mitocondrial, implicando vários fatores próapoptóticos mitocondriais (WANG, 2001). As quinonas são compostos altamente reativos conhecidos para gerar as EROS por meio do mecanismo de redução de elétrons ou por meio da reação com o grupamento tiol. Devido à presença do núcleo quinona na estrutura da plumbagina, a sua atividade citotóxica tem sido atribuída à geração de EROS (KAWIAK et al., 2007). O composto natural feniletil isotiocianato, um novo agente indutor de EROS, exibe seletividade anticâncer superior e está atualmente sob investigação clínica (Cheung & Kong, 2010; Trachootham et al., 2006; Xiao et al., 2010). Além disso, outro composto natural o Celastrol tem sido mostrado induzir citotoxicidade, causando a acumulação de EROS no ambas as células H1299 do câncer do pulmão e de hepatoma HepG2 (CHEN et al., 2011). Estudos recentes têm demonstrado que as EROS desempenham um papel 106 importante na apoptose induzida pelo Celastrol (CHEN et al, 2011; SEO et al, 2011). Nesse estudo, foi revelado que os compostos C2 e C3, nas células HL60, induziram o aumento do nível das EROS intracelulares. Esse efeito está na origem de sua citotoxicidade nessa linhagem, já que os experimentos com o NAC revelou que inibindo a produção das EROS, protege as células HL-60 contra os efeitos citotóxicos dos compostos C2 e C3 assim como diminuindo a apoptose demonstrando a associação das EROS com a indução da apoptose. Estudos demonstraram que os níveis de EROS elevados podem induzir danos celulares (HSEU et al, 2008; LI et al, 2007) e também podem desempenhar um papel importante na mediação da apoptose (GARCIA-RUIZ et al, 1997). Também, foi mostrado que as EROS induzem seletivamente a morte das células cancerosas (KUO et al, 2007; SCHUMACKER, 2006). Por exemplo, HILEMAN et al. (2004) demonstraram que as EROS geradas pelo 2metoxiestradiol (2-ME), preferencialmente, mata as células leucêmicas humanas sem exibir qualquer citotoxicidade significativa contra linfócitos normais. No entanto, a menor citotoxicidade dos compostos C2 e C3 observado nos PBMC pode ser devido ao fato de eles não induzirem a produção de EROS nessas células. Investigando a participação da via das MAPKs na citotoxicidade dos compostos C2 e C3 em HL-60, os resultados obtidos mostraram a inibição da fosforilação da ERK. O tratamento das células HL-60 com os compostos C2 ou C3 em 24 horas reduziu a fosforilação da proteína ERK, indicando que os compostos provavelmente atuam inibindo a fosforilação da ERK. Além disso, o co-tratamento com os compostos e o inibidor da ERK (PD98059) aumentou a citotoxicidade induzida pelos compostos, confirmando a idéia de que os compostos inibem a via da ERK. O co-tratamento do inibidor de p38 MAPK não teve diference significativa, comparando com o efeito dos compostos testados separadamente. Esses resultados ainda não são conclusivos para saber o papel do p38 MAPK na indução de apoptose em HL-60, mas sugere que esta via não está implicada no mecanismo de ação dos compostos. Assim são 107 precisos experimentos complementares para elucidar melhor o papel de p38 MAPK na indução da apoptose pelos compostos C2 e C3, nas células HL-60. Vários estudos têm mostrado que a ERK ativada fosforila as proteínas anti-apoptoticas, Bcl-2 e Mcl-1, membros da família Bcl-2 e aumenta suas atividades (DIMMELER et al., 1999; DOMINA et al, 2000, TAMURA et al., 2004). A perturbação simultânea de ambos as vias de Bcl-2 e de MAPK aumenta sinergicamente a apoptose em células que apresentam uma ativação constitutiva da MAPK (MILELLA et al., 2002). Esses dados corroboram com os nossos resultados, pois foi mostrado que os compostos C2 e C3 induziram a redução de expressão de Bcl-2, inibiram a fosforilação da ERK e consequentemente levaram as células HL-60 a apoptose. Dessa forma, este estudo demonstrou que os compostos C2 e C3 podem ser considerados como protótipo de moléculas anti-leucêmicas. Os mapas conceituais esquemáticos para o mecanismo de ação dos compostos nas células HL-60 e K562, são mostrados nas Figuras 17 e 18. 108 MAPA CONCEITUAL 1 Figura 17: Proposição do mecanismo de ação dos compostos C2 e C3 na linhagem de leucemia mielóide aguda (HL-60). Ψm é a diferencia do potencial da membrana mitocondrial. 109 MAPA CONCEITUAL 2 Figura 18: Proposição do mecanismo de ação dos comopostos C2 e C3 na linhagem de leucemia mielóide crônica (K562). Ψm é a diferencia do potencial da membrana mitocondrial. 110 Conclusão A partir dos resultados desse trabalho, podemos concluir que:  Os derivados triazóis particularmente os compostos C2 e C3 foram citotóxicos para as linhagens leucêmicas HL-60 e K562.  Os compostos C2 e C3 foram mais seletivos e apresentaram menor efeito citotóxico nas células normais PBMC.  Os compostos C2 e C3 induziram a despolarização da membrana mitocondrial, a externalização da fosfatidilserina, a fragmentação do DNA e a liberação do citocromo C, além de diminuir a expressão de Bcl2 e aumentar a expressão de BAX, consequentemente levando as células HL-60 à apoptose.  Na linhagem K562, os compostos induziram o aumento da expressão do RNAm do p21 e a parada do ciclo celular na fase S.  Os compostos alteraram os níveis de EROS intracelulares seletivamente nas células HL-60. A produção de EROS intracelulares em HL-60 tem um papel importante na citotoxicidade dos compostos C2 e C3.  Os compostos C2 e C3 podem ser considerados como protótipos de moléculas anti-leucêmicas. 111 Referências bibliográficas Agalave, S.G., Maujan, S.R., Pore, V.S., 2011. Click Chemistry: 1,2,3-Triazoles as Pharmacophores. Chemistry-An Asian Journal 6, 2696-2718. Alison, M.R., 2001. Cancer. Encyclopedia of life sciences, Nature publishing group. 1-8. Allen, L.F., Sebolt-Leopold, J., Meyer, M.B. (2003). CI-1040 (PD184352): a targeted signal transduction inhibitor of MEK (MAPKK). Seminars in Oncology 30(5), 105–116. Asche, C., 2005. Antitumor quinones. Mini-Reviews in Medicinal Chemistry 5, 449–467. Babula, P., Adam, V., Havel, L., Kizek, R., 2007. Naphthoquinones and their pharmacological properties. Ceská a Slovenská Farmacie 56, 114–120. Bacus, S.S., Gudkov, A.V., Lowe, M., Lyass, L., Yung, Y., Komarov, A.P., Keyomarsi, K., Yarden, Y., Seger, R., 2001. 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