REPOSITORIO INSTITUCIONAL DA UFOP: Polpa de açaí modula a produção de espécies reativas de oxigênio por neutrófilos e a expressão gênica de enzimas antioxidantes em tecido hepático de ratos.

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  UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

  LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA METABÓLICA

  

Polpa de Açaí Modula a Produção de Espécies Reativas de

Oxigênio por Neutrófilos e a Expressão Gênica de Enzimas

Antioxidantes em Tecido Hepático de Ratos

  Joyce Ferreira da Costa Guerra

  Ouro Preto 2011 UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

  LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA METABÓLICA

  

Polpa de Açaí Modula a Produção de Espécies Reativas de

Oxigênio por Neutrófilos e a Expressão Gênica de Enzimas

Antioxidantes em Tecido Hepático de Ratos

  Joyce Ferreira da Costa Guerra a Orientadora: Profª. Dr . Maria Lúcia Pedrosa Co-orientador: Prof. Dr. Marcelo Eustáquio Silva

  • – Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração: Bioquímica Metabólica e Fisiológica.

  Ouro Preto 2011 G934p Guerra, Joyce Ferreira da Costa. Polpa de açaí modula a produção de espécies reativas de oxigênio por neutrófilos e a expressão gênica de enzimas antioxidantes em tecido hepático de ratos [manuscrito] / Joyce Ferreira da Costa Guerra. - 2011. xiv, 77f.: il. color; grafs., tabs.

  Orientadora: Profª. Dra. Maria Lúcia Pedrosa. Co-orientador: Prof. Dr. Marcelo Eustáquio Silva Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto.

  Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas. Área de concentração: Bioquímica Metabólica e Fisiológica.

  1. Diabetes - Teses. 2. Espécies reativas de oxigênio (ERO) - Teses.

  3. Neutrófilos - Teses. 4. Estresse oxidativo - Teses. 5. Açaí - Teses.

I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.

CDU: 616.379-008.64:613.2.038

  Catalogação: sisbin@sisbin.ufop.br

  Este trabalho foi realizado no Laboratório de Bioquímica Metabólica e no

  

Laboratório de Nutrição Experimental do Núcleo de Pesquisa em Ciências Biológicas da

  Universidade Federal de Ouro Preto, na vigência de auxílio concedido pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), Comissão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

  Dedico esta dissertação a Leonardo Matoso Leal, por sempre me incentivar a ser o melhor que posso ser.

AGRADECIMENTO ESPECIAL

  Aos meus professores e orientadores Maria Lúcia Pedrosa e Marcelo Eustáquio Silva, pela dedicação, carinho, confiança e ensinamentos passados a mim durante esses anos. Sou muita grata a vocês por terem me dado a oportunidade de descobrir meu caminho, pelo aprendizado que vocês me proporcionaram, e pelos exemplos que levarei durante toda a minha vida profissional.

  AGRADECIMENTOS

  A Deus por me abençoar sempre e guiar o meu caminho; Aos meus pais e minha avó Lourdes, por não medirem esforços para que eu chegasse até aqui e por sempre acreditarem em mim; Aos meus irmãos Jéssica e Lucas, por estarem sempre presentes em todos os momentos da minha vida; À professora Daniela Caldeira Costa, pela colaboração, competência, todas as discussões e sugestões durante o desenvolvimento deste trabalho; Ao professor Elísio Alberto Evangelista, por toda a atenção, carinho e disponibilidade; À Cíntia Lopes de Brito Magalhães pelo auxílio na realização dos experimentos, companheirismo e pelo incentivo; Ao Jair Pastor Mota e a Maria Aparecida Reis Trópia, por sempre tornar as coisas mais fáceis e pelo apoio constante; À Maísa e Larissa, grandes amigas, por estarem sempre presentes e dispostas a ajudar e tornar todos os momentos no laboratório sempre mais descontraídos; A todos os amigos dos Laboratórios de Bioquímica Metabólica e Nutrição

  Experimental, em especial a Aline, Ana Flávia, Bárbara, Bianca, Bruno, Emerson,

  

Fabiano, Fernanda, Glaucy, Joamyr, Heberth, Lorena, Melina, Poliane, Rogério,

Sandra, Simone a minha gratidão e a certeza de que, sem vocês, este trabalho não teria sido

  possível; Aos laboratórios do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da UFOP por gentilmente cederem o uso dos equipamentos;

  Aos professores do Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas pelos ensinamentos; Aos colegas da pós-graduação pela agradável convivência; As queridas amigas Raquel e Carol pela companhia durante esses anos, pelo apoio diário e por tornar todos os momentos mais alegres; Obrigada!

  RESUMO

  Açaí (Euterpe oleracea Mart.) recentemente foi identificado como uma fonte promissora de antioxidantes naturais. O estresse oxidativo e a redução dos mecanismos de defesa antioxidante são fatores importantes no desenvolvimento das complicações do diabetes. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar o possível efeito protetor da polpa de açaí sobre a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) por neutrófilos e sobre o sistema de defesa antioxidante hepático em ratos controle e diabéticos. Ratas Fischer foram divididas em 4 grupos de 8 animais de acordo com o tratamento recebido, Controle (C), Açaí (A), diabético (D), e diabético + açaí (DA). O diabetes foi induzido por uma única injeção intraperitoneal de estreptozotocina (35mg/kg de peso corporal) no primeiro dia do experimento. Os grupos C e D receberam dieta padrão (AIN-93), os grupos A e DA receberam dieta padrão acrescida com 2% da polpa de açaí. Ao final de 4 semanas os animais foram anestesiados e eutanasiados. A suplementação da dieta com 2% da polpa de açaí por 30 dias aumentou os nív eis de mRNA para γ-glutamilcisteína sintetase (γ-GCS) e glutationa peroxidase (GPx) no tecido hepático, aumentou o conteúdo de glutationa total e reduziu a produção de EROs por neutrófilos em ratos controle. Os ratos diabéticos apresentaram redução na expressão de mRNA que codificam para a Zn-superóxido dismutase (Zn-SOD), GPx and γ-GCS e aumento nos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e proteínas carboniladas quando comparado aos ratos controle. A suplementação com a polpa de açaí não alterou a expressão de enzimas antioxidantes em ratos diabéticos, no entanto apresentou efeito protetor, através da redução da peroxidação lipídica e aumento de glutationa total no fígado desses animais. Esses resultados sugerem que a polpa de açaí pode modular a produção de ROS por neutrófilos a apresentar efeito favorável sobre o sistema de defesa antioxidante hepático.

  Palavras-Chave: Açaí, Diabetes, Espécies Reativas de Oxigênio, Estresse oxidativo, Neutrófilos, Ratos.

  ABSTRACT

  Açai (Euterpe oleracea Mart.) has recently been identified as a promising source of natural antioxidants. Because increased oxidative stress and impaired antioxidant defense mechanisms are important factors in the development of diabetic complications, the present study was undertaken to evaluate the possible protective effects of açai on the production of reactive oxygen species (ROS) by neutrophils and on the liver antioxidant defense system in control and streptozotocin-induced diabetic rats. Female Fischer rats were divided into four groups, control (C), açai (A), diabetic (D), diabetic + açai (DA). Diabetes was induced by a single intraperitoneal injection of streptozotocin (35 mg/kg body weight). Animals in groups C and D were fed a standard diet (AIN-93); those in groups A and DA were given the standard diet with 2% (w/w) açai pulp added for 30 days. Supplementation of the diet with 2% açai for 30 days was found to increase levels of mRNA for gamma-glutamylcysteine synthetase (

  γ-GCS) and glutathione peroxidase (GPx) in liver tissue, to increase the glutathione (GSH) content of the liver and to decrease ROS production by neutrophils. Compared to control animals, diabetic rats exhibited lower levels of mRNA coding for Zn-superoxide dismutase (Zn-SOD), GPx and

  γ-GCS and higher levels of thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS) and carbonyl proteins in hepatic tissues. Although açai supplementation did not change the level of expression of mRNAs coding for antioxidant enzymes in diabetic rats, it showed a protective effect, decreasing lipid peroxidation and increasing GSH content in the liver. These findings suggest that açai can modulate ROS production by neutrophils and that it has a significant favorable effect on the liver antioxidant defense system.

  Keywords: Açai, Diabetes, Reactive Oxygen Species, Oxidative Stress, Neutrophils, Rats.

  LISTA DE TABELAS

  Tabela 1. Composição das dietas experimentais ............................................................ 27 Tabela 2. Conteúdo de polifenóis e antocianinas totais na polpa de açaí ....................... 39 Tabela 3. Efeitos da suplementação com a polpa de açaí sobre níveis de glicose, insulina, peso corporal e peso do fígado em ratos controle e diabéticos ........................ 42

  LISTA DE FIGURAS

  Figura 1. Fotos do Açaí (Euterpe oleraceae Martius) ..................................................... 5 Figura 2. Estrutura química das antocianinas presentes no açaí ...................................... 7 Figura 3. Estrutura química das principais classes de polifenóis ..................................... 9 Figura 4. Estrutura química das principais classes de flavonóides ................................ 10 Figura 5. Indução da transcrição gênica de enzimas antioxidantes por polifenóis, através da ativação do Elemento de Resposta Antioxidante (ARE) mediada fator de transcrição Nrf2 ................................................................................................................................. 11 Figura 6. Formação de espécies reativas no diabetes e ação de enzimas antioxidantes . 19 Figura 7. Ativação do complexo NADPH oxidase ......................................................... 20 Figura 8. Percentual de inibição do radical DPPH, por diferentes concentrações da polpa do açaí e do antioxidante de referência Trolox em 30 minutos ...................................... 40 Figura 9. Teste de tolerância oral a glicose .................................................................... 41 Figura 10. Efeito da suplementação com a polpa de açaí sobre a produção de espécies reativas de oxigênio por neutrófilos de ratos controle e diabéticos ................................ 43 Figura 11. Efeitos da suplementação com a polpa de açaí sobre a atividade da catalase e conteúdo de glutationa total em tecido hepático de ratos controle e diabéticos ............. 44 Figura 12. Efeitos da suplementação com a polpa de açaí sobre os níveis de proteínas carboniladas e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico em tecido hepático de ratos controle e diabéticos ....................................................................................................... 45 Figura 13. Efeitos da suplementação com a polpa de açaí sobre a expressão gênica das enzimas antioxidantes Zn-SOD e Mn-SOD em tecido hepático de ratos controle e diabéticos ........................................................................................................................ 47 Figura 14. Efeitos da suplementação com a polpa de açaí sobre a expressão gênica das enzimas antioxidantes γ-GCS e GPx em tecido hepático de ratos controle e diabéticos 48 Figura 15. Efeitos da suplementação com a polpa de açaí sobre a expressão gênica da enzima antioxidante catalase em tecido hepático de ratos controle e diabéticos ............ 49

  LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

  A, grupo Açaí; AIN, do inglês, American Institute of Nutrition; ARE, Elemento de Resposta Antioxidante; BHT, butil-hidroxi-tolueno;

  C, grupo Controle; CAT, catalase; cDNA, ácido desoxirribonucléico complementar; C , do ingês, Threshold cycle;

  T

  D, grupo diabético; DA, grupo diabético + açaí; DM, diabetes mellitus; DNA, ácido desoxiribonucléico; DNPH, 2,4-dinitrofenil-hidrazina; dNTP, desoxiribonucleosídeo trifosfatado; DPPH, 2,2-difenil-1- picril-hidrazil; DTNB, ácido 5,5´ditio-bis (2-nitrobenzóico); EDTA, ácido etilenodiaminotetracético; ERO, espécies reativas de oxigênio; GAPDH, gliceraldeído 3- fosfato desidrogenase; GSH, glutationa reduzida; GSSG, glutationa oxidada; GPx, glutationa peroxidase; H O , peróxido de hidrogênio;

  2

  2

  iNOS, óxido nítrico sintase indutível; Keap1, do inglês, Kelch-like ECH associating protein; MDA, malondialdeído; mRNA, RNA mensageiro; NADPH, nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato; NO, óxido nítrico; NOS, óxido nítrico sintase;

  Nrf2, fator nuclear derivado de eritróide 2;

  O , radical superóxido;

  2

  • OH , radical hidroxil; OMS, Organização Mundial de Saúde;
    • ONOO , peroxinitrito; pH, potencial hidrogeniônico; PKC, proteína quinase C; qRT-PCR, reacão em cadeia da polimerase quantitativa pós-transcrição reversa; RNA, ácido ribonucléico; RLU, unidade reativa de luz; SDS, dodecil sulfato de sódio;

  STZ, estreptozotocina; SOD, superóxido dismutase; TBA, ácido tiobarbitúrico; TBARS, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico; TCA, ácido tricloroacético; TNB, ácido 5-tio-2-nitrobenzóico; TTOG, teste de tolerância oral a glicose; γ-GCS, gama-glutamilcisteína sintetase.

  SUMÁRIO 1.

  INTRODUđấO ................................................................................................................... 1

  2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .......................................................................................... 3

  2.1. Alimentos Funcionais ................................................................................................. 3

  2.2. O Fruto do Açaí e seu Papel como Alimento Funcional ............................................ 4

  2.2.1. Composição Química da Polpa do Açaí ....................................................... 6

  2.2.2. Compostos bioativos presentes na polpa do açaí .......................................... 6

  2.2.3. Polifenóis ...................................................................................................... 8

  2.2.4. Flavonóides ................................................................................................... 9

  2.2.5. Estudos com o fruto do açaí conduzidos in vitro ........................................ 12

  2.2.6. Estudos com o fruto do açaí conduzidos in vivo ......................................... 13

  2.3. Diabetes Mellitus, Estresse Oxidativo e Antioxidantes ............................................ 15

  2.3.1. Espécies reativas de oxigênio e estresse oxidativo ..................................... 15

  2.3.2. Diabetes mellitus ........................................................................................ 17

  2.3.3. Uso de antioxidantes no diabetes ................................................................. 20

  3. OBJETIVOS ...................................................................................................................... 22

  3.1. Objetivo Geral ........................................................................................................... 22

  3.2. Objetivos Específicos ................................................................................................ 22

  4. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................. 23

  4.1. Polpa de Açaí ............................................................................................................. 23

  4.2. Conteúdo de Polifenóis e Antocianinas Totais na Polpa de Açaí.............................. 23

  4.3. Capacidade Antioxidante in vitro contra o Radical DPPH........................................ 25

  4.4. Animais ...................................................................................................................... 26

  4.5. Dietas ......................................................................................................................... 26

  4.6. Desenho Experimental ............................................................................................... 27

  4.7. Teste de Tolerância Oral a Glicose ........................................................................... 28

  4.8. Níveis Plasmáticos de Glicose, Insulina e Frutosamina ............................................ 28

  4.9. Produção de ERO por Neutrófilos ............................................................................ 30

  4.10. Defesas Antioxidantes e Biomarcadores do Estresse Oxidativo ............................ 31

  4.11. Ensaio de RT-PCR quantitativa em Tempo Real .................................................... 35

  4.12. Análise Estatística ................................................................................................... 38

  5. RESULTADOS ................................................................................................................. 39

  5.1. Conteúdo de Polifenóis e Antocianinas Totais na Polpa de Açaí.............................. 39

  5.2. Capacidade Antioxidante in vitro contra o Radical DPPH........................................ 39

  5.3. Teste de Tolerância Oral a Glicose ........................................................................... 40

  5.4. Níveis Plasmáticos de Glicose, Insulina e Frutosamina ............................................ 42

  5.5. Produção de ERO por Neutrófilos ............................................................................. 43

  5.6. Defesas Antioxidantes e Biomarcadores do Estresse Oxidativo ............................... 44

  5.7. Ensaio de RT-PCR quantitativa em Tempo Real ...................................................... 46

  

6. DISCUSSÃO ...................................................................................................................... 50

  

7. CONCLUSÃO .................................................................................................................... 59

  

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 60

ANEXO ................................................................................................................................... 73

  Anexo I. Protocolo aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UFOP ... 73 Anexo II. Protocolo da dosagem de insulina .................................................................. 74

  Anexo III. Trabalho aceito para publicação .................................................................... 77

1. INTRODUđấO

  Açaí, fruto da palmeira Euterpe oleracea Mart., nativa da região amazônica, tem recebido muita atenção devido a sua alta capacidade antioxidante e seu papel como “alimento funcional” (Schauss et al. 2006a; Marcason 2009). O açaí é um dos principais produtos de exportação da região amazônica, sendo distribuído e comercializado na forma de polpa congelada, suco ou vinho (Ribeiro et al. 2010). Estudos bioquímicos revelaram que o açaí é rico em compostos fitoquímicos, particularmente os polifenóis, da classe dos flavonóides tais como, antocianinas e pró-antocianidinas, dentre outros (Schauss et al. 2006b).

  A polpa de açaí apresenta alta capacidade antioxidante in vitro, demonstrada através de diferentes ensaios, especialmente contra os radicais peroxil e superóxido. No organismo

  humano a neutralização do radical superóxido ( O ) inibe a formação de outras espécies

  2

  reativas como o radical hidroxil (OH ), peroxinitrito (ONOO ), e peróxido de hidrogênio (H O ), e constitue uma importante linha de defesa contra o estresse oxidativo (Schauss et al.

  2

  2

  2006a). O consumo da polpa de açaí também demonstrou efeito protetor contra o estresse oxidativo in vivo, em modelos experimentais e humanos (Mertens-Talcott et al. 2008; de Souza et al. 2010).

  Espécies reativas de oxigênio (ERO) são constantemente formadas como produtos do metabolismo aeróbio e são reconhecidas tanto por desempenhar funções fisiológicas quanto por seus efeitos deletérios. ERO abrangem radicais livres derivados do oxigênio tais como,

    • O , OH , peroxila (ROO ) e alcoxila (RO ) e também derivados não radicais do oxigênio

  2 como o peróxido de hidrogênio (H O ) (Halliwell & Cross 1994).

  2

2 Sobre condições normais a produção de espécies reativas é balanceada pelos sistemas

  de defesa antioxidante, cuja ação envolve mecanismos enzimáticos e não enzimáticos, que podem ser classificados como mecanismos de prevenção, interceptação ou inativação e reparo (Sies 1993).

  As defesas antioxidantes enzimáticas incluem a superóxido dismutase (SOD), catalase, glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR) (Figura 6). Antioxidantes não enzimáticos incluem ácido ascórbico (vitamina C), α-tocoferol (vitamina E), tióis, bilirrubina, glutationa, carotenóides e flavonóides (Maritim et al. 2003).

  De acordo com Haliwell (2007), antioxidante é qualquer substância que retarda, previne ou remove o dano oxidativo a uma molécula alvo. A superprodução de ERO resulta em estresse oxidativo, um processo que pode ser mediador de importantes danos a estruturas celulares como proteínas, lipídios e DNA e está envolvido na etiologia e patogênese de diversas doenças, tais como câncer, doenças cardiovasculares e diabetes mellitus (Halliwell 1987; Cross et al. 1987; Baynes 1991).

  O Diabetes mellitus (DM) é uma desordem metabólica crônica, que afeta mais de 170 milhões de pessoas em todo o mundo, (Wild et al. 2004) caracterizada por hiperglicemia e insuficiência na produção ou ação da insulina, associada ao dano e disfunção em diversos tecidos que alteram a qualidade de vida e longevidade.

  O estresse oxidativo exerce papel central na patogênese e desenvolvimento das complicações do diabetes. A progressão da doença é usualmente acompanhada por aumento na produção de espécies reativas de oxigênio e/ou redução na eficiência dos sistemas de defesa antioxidante (Baynes 1991). Os mecanismos envolvidos no aumento do estresse oxidativo são parcialmente conhecidos como, ativação de fatores de transcrição, formação dos produtos finais de glicação avançada e ativação da proteína quinase C (PKC) (Maritim et al. 2003).

  Muitos estudos têm sido conduzidos in vivo e in vitro a procura de novos tratamentos para controle do diabetes. As terapias utilizadas atualmente incluem insulina e vários agentes anti-diabéticos sintéticos, usados isoladamente ou em combinação, porém muitos apresentam uma série de efeitos colaterais adversos (Modak et al. 2007). Dessa forma o manejo do diabetes sem efeitos colaterais ainda é um desafio, o qual gera o crescente interesse no uso de antioxidantes naturais como estratégia para reduzir as complicações do diabetes.

  Compostos dietéticos como os polifenóis podem exercer papel importante em melhorar o status antioxidante, desde que eles são capazes de neutralizar ERO, atuar como quelantes de íons metálicos e moduladores de enzimas (Lodovici et al. 2001). Portanto podem oferecer proteção contra as complicações do diabetes causadas pelo aumento do estresse oxidativo. Assim é importante aumentar o número de alimentos ou compostos dietéticos disponíveis que podem apresentar benefícios no tratamento do diabetes.

  Nesse contexto nós decidimos investigar o papel da suplementação com açaí sobre a produção de ERO por neutrófilos, balanço oxidante/antioxidante e regulação da expressão gênica de enzimas do sistema de defesa antioxidante hepático in vivo.

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Alimentos Funcionais

  Nas últimas décadas, vários estudos têm demonstrado a associação entre dieta e doenças crônicas tais como obesidade, diabetes e hipertensão arterial sistêmica. Desde então os alimentos já não são vistos somente como fonte de nutrientes e calorias, necessários a manutenção corporal, pois podem apresentar benefícios fisiológicos adicionais relacionados à redução do risco de doenças e aumento da qualidade de vida. No entanto, a crença no poder medicinal dos alimentos não é recente, Hipócrates, considerado o pai da medicina moderna, declarou cerca de 2500 anos atrás “faça do alimento o seu medicamento” (Milner 1999; Hasler 2000).

  Neste contexto em meados de 1980, o Japão foi pioneiro ao introduzir o conceito de alimentos funcionais, onde através de um programa do governo, indústrias passaram a enriquecer alimentos com ingredientes específicos, diferenciando-os com relação aos benefícios oferecidos à saúde, quando comparados aos alimentos nas formas tradicionais (Anjo 2004).

  Não existe uma definição universalmente aceita de alimentos funcionais, embora, várias organizações têm procurado definir esta categoria de alimentos. No Brasil, alimento funcional é definido pela Secretaria de Vigilância Sanitária do Ministério da Saúde como, “alimento ou ingrediente que além de funções nutricionais básicas, quando se tratar de nutriente, pode produzir efeitos metabólicos e ou fisiológicos e ou efeitos benéficos à saúde, devendo ser seguro para consumo sem supervisão médica” (Ministério da Saúde 1999).

  A ausência de uma legislação que padronizasse mundialmente o termo fez com que surgissem várias denominações, tais como nutracêuticos e alimentos medicinais. A American Dietetic Association (ADA) ressalta que alimentos funcionais incluem além de alimentos convencionais, aqueles fortificados e enriquecidos que possuem potenciais efeitos benéficos para a saúde quando consumidos como parte de uma dieta variada. Portanto diferem dos “nutracêuticos” que foram recentemente reconhecidos como "os suplementos dietéticos que proporcionam uma forma concentrada de um agente bioativo de um alimento, apresentados em uma matriz não alimentar, e usado para melhorar a saúde em dosagens que excedem aquelas que poderiam ser obtidas através da alimentação normal (Hasler et al. 2004). Os componentes químicos relacionados aos efeitos funcionais destes alimentos são denominados compostos bioativos, que podem ser de origem vegetal (fitoquímicos), ou animal (zooquímicos) (Hasler 2000).

  Os fitoquímicos, também denominados metabólitos secundários são compostos não- nutrientes, encontrados em frutas, grãos e vegetais e têm sido relacionados a prevenção de doenças crônicas. Estes podem ser classificados como carotenóides, compostos fenólicos, alcalóides, compostos nitrogenados e organosulfurados (Liu 2004).

  Diante dos benefícios à saúde atribuídos a estes compostos, consumidores, indústrias de alimentos, autoridades públicas e a comunidade científica têm buscado cada vez mais informações sobre essas substâncias.

2.2. O Fruto do Açaí e seu Papel como Alimento Funcional

  Martius é uma palmeira nativa da região Amazônica, amplamente

  Euterpe oleraceae

  difundida especialmente nos estados do Pará, Maranhão e Amapá. Pertence à família Arecaceae e seu fruto é conhecido como açaí. As palmeiras podem atingir entre 15 a 30 metros de altura e produzem de três a quatro cachos de frutos com peso entre 3 a 6 kg. Os frutos são globosos, com diâmetro de aproximadamente 1,7 cm e peso de 2 a 3 g, e possuem uma semente grande (correspondendo até 85% do fruto), que é cercada por uma fina camada de celulose e coberta por uma casca (Del Pozo-Insfran et al. 2004). A cor do fruto maduro pode ser púrpura a quase preta e embora possam ser colhidos ao longo de todo o ano, as maiores produções são obtidas durante os meses secos de agosto a Dezembro (Rodrigues et al. 2006).

  O cultivo do açaí é de grande importância socioeconômica, devido ao enorme potencial de aproveitamento integral de matéria-prima. Além da extração dos frutos, as sementes do açaí também são aproveitadas no artesanato e como adubo orgânico. A planta fornece ainda um ótimo palmito, considerado uma iguaria, e as suas folhas são utilizadas para cobertura de casas dos habitantes do interior da região (Embrapa 2005).

  O principal produto extraído do fruto do açaí é a polpa, também chamada vinho-de- açaí, ou simplesmente açaí, obtido a partir de um processo de extração no qual, os frutos são macerados com água e separados de suas sementes (Figura 1). A polpa é também consumida na forma de creme, licor, geléia, sorvete, bebidas energéticas e uma variedade de outras bebidas.

  O açaí vem ganhando novos mercados desde a década de 90, devido principalmente ao seu elevado valor nutricional e propriedades antioxidantes. No ano 2000, foi iniciada a exportação de polpa congelada de açaí para os Estados Unidos e para a Itália expandindo-se também para o Japão e Holanda. Esse mercado externo vem crescendo 20% ao ano nos últimos três anos. Estima-se que em 2003 foram comercializados por volta de US$ 2,12 milhões, e em 2005 pelo menos US$ 5,49 milhões correspondendo a aproximadamente 2 a 3 mil toneladas da bebida (Albarici et al. 2007).

  Relatos populares, especialmente das regiões norte e nordeste do Brasil, indicam o efeito positivo do uso medicinal do açaí no tratamento de diversas desordens, tais como febre, dor e gripe (Matheus et al. 2006).

  A B C

Figura 1. Fotos mostrando A: Palmeira Euterpe oleraceae Martius; B: O fruto do açaí; C:

Despolpamento mecânico, polpa e suco de açaí.

  Fonte: www.agrosoft.org.br.

  2.2.1. Composição química da polpa do açaí

  O açaí é considerado um alimento altamente nutritivo e muitos efeitos benéficos a saúde são associados ao seu consumo (Bobbio et al., 2000; Menezes et al., 2005). Schauss et al. (2006b) determinaram a composição nutricional da polpa de açaí e encontraram 32,5% de lipídios, 52,2% de carboidratos (dos quais 44,2% de fibras e 1,3 % de açúcares) e 8,1% de proteínas. Os ácidos graxos poliinsaturados, monoinsaturados, e saturados representam 11,1%, 60,2% e 28,7% do total de ácidos graxos, respectivamente. Dessa forma os lipídios encontrados na polpa de açaí são predominantemente insaturados (73,9%). O ácido graxo predominante é o ácido oléico (56,2%), seguido pelo ácido palmítico (24,1%) e linoléico (12,5%). Dentre os fitoesteróis presentes na composição química do açaí, destacam-se o -sitosterol, campesterol e estigmasterol. Quanto aos micronutrientes, minerais como o cálcio e ferro também foram encontrados além de vitaminas como a vitamina A e C em pequenas quantidades, no entanto os valores observados para estes compostos divergem bastante de acordo com a fonte bibliográfica.

  O fruto do açaí também apresenta um potencial relevante como fonte de fibra alimentar, possuindo valores superiores aos relatados para outros frutos como morango, figo e goiaba (Ramulu & Udayasekhara Rao 2003).

  2.2.2. Compostos bioativos presentes na polpa do açaí

  Dentre os compostos fitoquímicos encontrados na polpa de açaí destacam-se os polifenóis, predominantemente os flavonóides e antocianinas que são antioxidantes naturais. Assim, devido à sua composição fitoquímica, foi atribuído ao mesmo um possível papel como alimento funcional.

  As antocianinas predominantes na polpa de açaí são a cianidina-3-glicosídeo e cianidina-3-rutenosídeo (Schauss et al. 2006b; Pacheco-Palencia et al. 2007; Pacheco- Palencia et al. 2009; Ribeiro et al. 2010). Outras são encontradas em menores quantidades como a cianidina-3-sambiosídeo, peonidina-3-glicosídeo e peonidina-3-rutenosídeo (Schauss

  

et al. 2006b) (Figura 2). A contribuição das antocianinas para a capacidade antioxidade do

  açaí, ainda é controversa. Enquanto Del Pozo-Insfran et al. (2004) relataram que estas são os principais compostos responsáveis pelas propriedades antioxidantes do açaí, Lichtenthaler et

  (2005) propõem que as antocianinas respondem por somente 10% da capacidade al. antioxidante total deste fruto.

  Também são encontrados na polpa do açaí outros polifenóis tais como, os flavonóides; isovitexina, pró-antocianidinas, catequinas, epicatequinas, (Schauss et al. 2006b; Pacheco- Palencia et al. 2009) orientina, luteolina, vitexina, quercetina, dihidrocanferol, (Kang et al. 2010) ácidos fenólicos; como ácido gálico (Ribeiro et al. 2010) e ácido ferúlico (Del Pozo- Insfran et al. 2004), resveratrol da classe dos estilbenos (em concentrações muito baixas) (Schauss et al. 2006b) e lignanas (Chin et al. 2008).

  Figura 2. Estrutura química das antocianinas presentes na polpa do açaí Fonte: Adaptado de Schauss et al. (2006b).

2.2.3. Polifenóis

  Polifenóis ou compostos fenólicos são originados do metabolismo secundário das plantas, amplamente encontrados em frutas, vegetais e cereais. Os polifenóis são os antioxidantes mais abundantes na dieta e estima-se que o consumo destes compostos seja de aproximadamente 1g por dia. (Scalbert & Williamson 2000).

  Na última década houve um grande crescimento no interesse científico em estudar as propriedades destes compostos, principalmente devido as suas propriedades antioxidantes e efeitos benéficos à saúde humana associados ao seu consumo. Estudos epidemiológicos sugerem que o consumo de polifenóis dietéticos está associado à proteção contra o desenvolvimento de doenças como, câncer, doenças cardiovasculares, osteoporose e diabetes (Arts & Hollman 2005; Graf et al. 2005).

  Os polifenóis são classificados em diferentes grupos em função do número de anéis aromáticos e padrão de substituição. As principais classes de polifenóis incluem ácidos fenólicos, flavonóides, estilbenos e lignanas e suas estruturas estão representadas na figura 3. As classes por sua vez são divididas em diversas subclasses (Pandey & Rizvi 2009).

  Os compostos fenólicos apresentam atividade antioxidante devido a sua habilidade em neutralizar espécies reativas diretamente, por meio da transferência de átomos de hidrogênio (Rice-Evans et al. 1996) e indiretamente através da ativação dos sistemas de defesa antioxidante.

  Outro mecanismo de ação antioxidante dos polifenóis é a sua capacidade de quelar metais tais como íons ferro e cobre, prevenindo ou minimizando a participação destes na reação de Fenton, a qual dá origem ao radical hidroxil e outras ERO. (Halliwell et al. 1995).

  Além disso, polifenóis podem modular a atividade de proteínas quinases (Agarwal 2000) e proteases (Moon et al. 2003), além de atuar como ligantes de fatores de transcrição promovendo alterações na expressão gênica (Amakura et al. 2003).

  Figura 3. Estrutura química das diferentes classes de polifenóis.

  Fonte: Pandey & Rizvi (2009).

2.2.4. Flavonóides

  Os flavonóides são compostos de baixo peso molecular, consistem em 15 átomos de carbono e podem ser encontrados na forma conjugada com carboidratos (glicosídios) ou agliconas (não conjugadas) (Pandey & Rizvi 2009). Apresentam dois anéis aromáticos, denominados anel A e B, unidos por três carbonos que formam um anel heterocíclico, denominado anel C. Variações no padrão de substituição do anel C resultam em diferentes classes de flavonóides, como flavonóis, flavonas, flavanonas, flavanóis (ou catequinas), isoflavonas e antocianinas (Figura 4). Substituições dos anéis A e B originam diferentes compostos dentro de cada classe. Estas substituições podem incluir oxigenação, alquilação, glicosilação, acilação e sulfação (Hollman & Katan 1999).

  A classe das antocianinas é a predominante e de maior interesse na polpa do açaí (Del Pozo-Insfran et al. 2004).

  Figura 4. Estrutura química das principais classes de flavonóides.

  Fonte: Pandey & Rizvi (2009). Tem sido demonstrado que polifenóis, principalmente da classe dos flavonóides, são capazes de estimular a transcrição de enzimas do sistema de defesa antioxidante, através da ativação do Elemento de Resposta Antioxidante (ARE) pelo fator de transcrição Nrf2 (fator nuclear derivado de eritróide 2) (Masella et al. 2005). Nrf2 se localiza no citoplasma em um complexo inativo ligado a proteína repressora Keap1 (Kelch-like ECH associating protein 1), que apresenta muitos resíduos de cisteína, estes atuam como sensores do estado redox celular.

  Os mecanismos que parecem estar envolvidos na estabilização de Nrf2 e rompimento de sua ligação a Keap1 incluem, fosforilação de resíduos de serina e treonina em Nrf2 e oxidação ou modificação covalente de resíduos de cisteína em Keap1. Nrf2 por sua vez pode sofrer translocação para o núcleo e formar um heterodímero com outros fatores de transcrição, tais como Maf, e se ligar a sequências regulatórias de ARE, na região promotora de diversos genes alvo, ativando sua transcrição (Itoh et al. 1997). O mecanismo exato da ação dos polifenóis na ativação de ARE permanece desconhecido. Acredita-se que polifenóis podem influenciar a ativação de ARE, por modificar a capacidade de ligação de Keap 1 a Nrf2, ou mesmo através da ativação de proteínas MAPK (proteínas quinases ativadas por mitógeno), envolvidas na fosforilação e conseqüente estabilização de Nrf2 (figura 5). Dentre os genes alvo que apresentam a sequência de ARE na região promotora, encontram-se o gene da

  γ-GCS (Chan & Kwong 2000), glutationa peroxidase (GPx), superóxido dismutase (SOD), catalase e glutationa S-transferase (GST) (Kong et al. 2001).

  

Figura 5. Indução da transcrição gênica de enzimas antioxidantes por polifenóis, através da

ativação do Elemento de Resposta Antioxidante (ARE) mediada fator de transcrição Nrf2.

  Polifenóis podem (i) modificar a capacidade de Keap 1 em sequestrar Nrf2 e ou/ (ii) ativar proteínas quinases ativadas por mitógeno (MAPK) provavelmente envolvidas na estabilização de Nrf2. Nrf2 pode então sofrer translocação para o núcleo e ativar a expressão de enzimas antioxidantes através da ligação a sequência ARE na região promotora destes genes. ARE/EpRE, elemento de resposta antioxidante/eletrófilo; Nrf2, fator nuclear derivado de eritróide 2. Fonte: Masella et al. (2005).

2.2.5. Estudos com o fruto do açaí conduzidos in vitro

  Diversos estudos têm sido conduzidos in vitro para identificar as propriedades do fruto do açaí. Dentre eles, Matheus et al. (2006) avaliaram os efeitos de extratos obtidos a partir de diferentes partes (flores, frutos e espigas) da palmeira Euterpe oleracea Mart. sobre a produção de óxido nítrico (NO), capacidade de neutralização do NO e expressão de enzima óxido nítrico sintase indutível (iNOS) em cultura de células RAW 264.7 (macrófagos de camundongos). Os resultados mostraram que todas as frações inibiram a produção de NO, através da redução na expressão de iNOS. Em outro estudo também relacionado ao óxido nítrico, extratos hidroalcólicos obtidos a partir da semente do açaí induziram efeito vasodilatador na camada mesentérica vascular, isolada de ratos Wistar, após tratamento prévio

  • – com norepinefrina e a formação de óxido nítrico (NO) em células endoteliais. O extrato (0.3 100

  μg) induziu vasodilatação de longa duração dependente de ativação da via NO-cGMP (Rocha et al. 2007).

  A polpa de açaí também apresenta uma possível propriedade antiinflamatória, demonstrada pela sua habilidade de inibir a atividade das ciclooxigenases, COX-1 e COX-2, em cultura de células (Schauss et al. 2006a).

  Além disso, a atividade anticarcinogênica do açaí tem sido demonstrada em diversos trabalhos na literatura. Frações de polifenóis, extraídas da polpa de açaí, apresentaram atividade antiproliferativa e pró-apoptótica em células leucêmicas HL-60, através de mecanismo mediado pela caspase-3 (Del Pozo-Insfran et al. 2006).

  Os efeitos antiproliferativos de extratos obtidos a partir da polpa de açaí também foram avaliados em cultura de células de adenocarcinoma humano HT-29, e apresentaram efeito inibitório de até 90,7% sobre a proliferação celular. Além disso, a absorção de polifenóis presentes nos extratos foi determinada utilizando células intestinais humanas Caco-2, um modelo in vitro para transporte através do epitelio intestinal. Ácidos fenólicos tais como p-hidroxibenzóico, vanílico, siríngico, e ácido ferúlico, na presença de DMSO, foram prontamente transportados a partir do ápice para o lado basolateral juntamente com flavanóis monoméricos, tais como catequina e epicatequina (Pacheco-Palencia et al. 2008).

  Hogan et al. (2010) demonstraram que um extrato enriquecido em antocianinas obtido a partir da polpa de açaí apresentou grande capacidade antiproliferativa em células C6 (glioma cerebral), sendo que nenhum outro extrato, obtido de outros frutos (Berries do inglês) ricos em antocianinas, como mirtilo, morango, framboesa, e amora apresentou atividade similar nas mesmas condições. A análise de fragmentação do DNA indica que este efeito pode ser devido a indução da apoptose nas células C6, após 48 horas de tratamento com 100 e 200 μg/mL do extrato. Os mesmos resultados não foram observados em células de câncer de mama MDA-

  468, sugerindo que a atividade antiproliferativa do extrato pode ser específica para determinados tipos celulares como as células C6.

  Dentre as propriedades atribuídas ao fruto do açaí, destaca-se o seu potencial como antioxidante, evidenciado em diversos estudos através de ensaios químicos como a capacidade de seqüestrar radicais peroxil avaliada pelo método ORAC (Oxygen Radical

  FL

  ) (Schauss et al. 2006a), inibição dos radicais

  Absorbance Capacity DPPH• (Kuskoski et al.

  • 2006; Rufino et al. 2009) e

  ABTS• (Ácido 2,2’-azino-bis-(3-etilbenzotiazolina)-6-sulfônico) (Rufino et al. 2010), e inibição da produção de ERO em eritrócitos e granulócitos (Honzel et

  2008). A ação do açaí sobre biomarcadores do estresse oxidativo e enzimas antioxidantes al.

  

in vitro também foi demonstrada por Spada et al. (2009) em tecidos isolados do córtex

  cerebral, hipocampo e cerebelo de ratos. O pré-tratamento com a polpa de açaí reduziu o dano oxidativo induzido por H O em lipídios e proteínas e a atividade das enzimas antioxidantes

  2

  2 superóxido dismutase e catalase a níveis basais nestes tecidos.

2.2.6. Estudos com o fruto do açaí conduzidos in vivo

  Os resultados obtidos em estudos conduzidos in vivo reforçam o papel do açaí em promover benefícios à saúde. Dentre eles um estudo clínico realizado em humanos saudáveis, com idade entre 21-31 anos, demonstrou que o consumo de uma única dose de açaí (7mL/Kg de peso) foi capaz de aumentar a capacidade antioxidante do plasma em até 2,3 e 3 vezes para o suco e polpa de açaí, respectivamente e também evidenciou a biodisponibilidade das antocianinas, já que estas foram quantificadas no plasma após um período de 0 a 12 horas do consumo das bebidas, atingindo o pico de concentração plasmática após 2,2 horas para polpa e 2 horas para o suco clarificado (Mertens-Talcott et al. 2008).

  Jensen et al. (2008) investigaram as propriedades antiinflamatórias e antioxidantes in e in vivo da bebida Monavie, uma mistura de sucos de diferentes frutas com conhecida

  vitro

  atividade antioxidante, sendo que o açaí é o ingrediente predominante. A análise da composição fitoquímica do Monavie mostrou que os antioxidantes predominantes são as antocianinas cianidina 3-rutenosídeo e cianidina 3-glicosídeo, também predominantes na polpa de açaí. O ensaio de proteção antioxidante celular em eritrócitos, (CAP-e), demonstrou que os antioxidantes presentes na bebida são capazes de atravessar a membrana plasmática da célula viva e exercer proteção contra o dano oxidativo induzido por H O . A adição do suco in

  2

  2

vitro em células polimorfonucleares sanguíneas, isoladas de humanos saudáveis, entre 19 e 52

  anos, causou redução da produção de ERO (induzida por H O ) e redução da migração

  2

  2

  estimulada por agentes quimiotáticos pró-inflamatórios. Neste estudo também foi realizado um ensaio randomizado, duplo-cego com doze indivíduos saudáveis, no qual o consumo de 120 mL da bebida causou um aumento da capacidade antioxidante do plasma e inibição da peroxidação lipídica no soro, após intervalo de duas horas do consumo.

  De Souza et al. (2010) demonstraram que a suplementação com 2% da polpa de açaí na dieta de ratos alimentados com dietas padrão e hipercolesterolêmica melhorou o perfil lipídico e de biomarcadores do estresse oxidativo no soro. Animais hipercolesterolêmicos apresentaram redução nos níveis séricos de colesterol total e colesterol não HDL após seis semanas de suplementação com a polpa de açaí. Além disso, a suplementação com açaí reduziu os níveis de proteínas carboniladas, aumentou a concentração de grupos sulfidrila livres e ligados a proteína e a atividade da enzima paraoxonase no soro de ratos alimentados com ambas as dietas e também reduziu significativamente a atividade da superóxido dismutase apenas nos ratos hipercolesterolêmicos.

  Sun et al. (2010) avaliaram o efeito da suplementação da dieta com 2% da polpa de açaí sobre a longevidade e transcrição gênica no organismo modelo Drosophila melanogaster. A suplementação com a polpa de açaí aumentou em 22% a longevidade de moscas alimentadas com dieta hiperlipídica, e em 18% a longevidade de moscas submetidas ao estresse oxidativo causado pelo silenciamento do gene da superóxido dismutase 1, através da ativação da transcrição gênica de vias de resposta ao estresse oxidativo e supressão da expressão do gene que codifica para a fosfoenolpiruvato carboxiquinase, uma enzima chave envolvida na gliconeogênese.

  Ribeiro et al. (2010) avaliaram efeitos anti-genotóxicos do tratamento agudo (24h) e subagudo (14 dias consecutivos) com a polpa de açaí. As doses selecionadas de polpa de açaí foram 3,33; 10,0 e 16,67 g/kg peso corporal, administradas por gavagem, em camundongos Swiss albinos seguido por injeção intraperitoneal do agente indutor de danos no DNA doxorrubicina (DXR) ou salina nos controles. O efeito protetor da polpa de açaí contra a indução de danos no DNA foi demonstrado em ambos os tratamentos agudo e subagudo em células de fígado, rim e sangue periférico. O teste de micronúcleos demonstrou que a polpa de açaí também reduziu significativamente a genotoxicidade induzida por DXR em eritrócitos da medula óssea e do sangue periférico de camundongos. O tratamento subagudo com a polpa de açaí foi mais efetivo em inibir a genotoxicidade e formação de micronúcleos em todas as células analisadas independente do tecido.

2.3. Diabetes Mellitus, Estresse oxidativo e Antioxidantes

2.3.1. Espécies reativas de oxigênio e estresse oxidativo

  Define-se como radical livre toda espécie que possui um ou mais elétrons desemparelhados (Halliwell 1987). Na natureza existem duas importantes substâncias que podem gerar radicais livres, o oxigênio no estado fundamental (O ) e o óxido nítrico (NO).

  2 Espécies reativas derivadas do oxigênio representam a classe mais importante em sistemas biológicos (Miller et al. 1990) e englobam radicais e não-radicais.

  A idéia de que o oxigênio pode causar danos não é recente, em 1954 Gerschman et al. propuseram que os efeitos tóxicos do oxigênio podiam ser atribuídos a formação de radicais livres. No entanto estas espécies ganharam notoriedade somente após o descobrimento em 1968 da enzima superóxido dismutase, específica para a neutralização do ânion superóxido (McCord & Fridovich 1969).

  Organismos aeróbios produzem espécies reativas de oxigênio (ERO) mesmo sob condições basais, por isso a um há um contínuo requerimento para a neutralização destas espécies pelos sistemas de defesa antioxidante. Contudo, mesmo nestas condições o balanço entre a produção de espécies reativas e defesas antioxidantes não é perfeito, de forma que o dano mediado por estas espécies ocorre continuamente (Halliwell 2007).

  A principal fonte celular de ERO é a cadeia respiratória mitocondrial, onde ocorre a redução unieletrônica do oxigênio molecular a água, na qual a entrada de 4 elétrons na molécula de oxigênio promove a formação de intermediários reativos entre eles o ânion

  • •) •

    • superóxido ( O

  2 ), o peróxido de hidrogênio (H

  2 O 2 ) e o radical hidroxil (OH , conforme mostrado na equação 1 .

  (1) Outras fontes endógenas de produção de ERO incluem as enzimas, NADPH oxidase, xantina oxidase, mieloperoxidase, ciclooxigenases, lipooxigenases e o citocromo P450 (Steinbrenner & Sies 2009).

  A exposição a espécies reativas desencadeia respostas celulares, que podem variar, desde o estímulo a proliferação celular, diferenciação e senescência, até a morte celular por apoptose ou necrose, de acordo com o tipo celular e outros fatores, como a presença de receptores de superfície, mecanismos de transdução de sinais e defesas antioxidantes (Sarsour

  2009).

  et al.

  ERO desempenham papéis fisiológicos quando em baixas concentrações tais como, atuar em mecanismos de defesa contra agentes infecciosos e modular vias de sinalização redox celulares (Halliwell 2007). No entanto são conhecidas por seus efeitos deletérios sobre biomoléculas celulares. Estas moléculas possuem meia vida extremamente curta e devido à sua alta reatividade, quando não neutralizadas, podem modificar e causar dano em diversos componentes celulares como proteínas, lipídios, ácidos nucléicos e carboidratos, característico do estresse oxidativo (Sies 1993).

  O estresse oxidativo é definido como um desequilíbrio entre a produção de ERO e a capacidade dos sistemas de defesa antioxidante em neutralizá-las e prevenir seus efeitos deletérios (Sies 1986). Porém, baseado no papel das ERO sobre diversas vias de sinalização celulares, recentemente, foi proposto um novo conceito de estresse oxidativo, sendo este caracterizado por uma

  “disfunção da sinalização redox e mecanismos de controle” (Jones 2006). Diversas doenças humanas como câncer, doenças cardiovasculares, desordens neurológicas e diabetes tem sido relacionadas ao estresse oxidativo (Halliwell 1987; Cross et

  1987; Baynes 1991; Valko et al. 2007).

  al.

2.3.2. Diabetes mellitus

  O diabetes mellitus (DM) é um dos mais importantes problemas de saúde pública mundial, sua prevalência vem crescendo a cada ano e a Organização Mundial da Saúde (OMS) prevê que até o ano 2025, 300 milhões de pessoas apresentarão a doença. Neste contexto o Brasil se encontra entre os 10 países com maior número de casos de diabetes no mundo (Wild et al. 2004).

  O diabetes caracteriza-se por hiperglicemia crônica com distúrbios no metabolismo de carboidratos, lipídios e proteínas e pode ser classificado em diabetes tipo 1, resultante da destruição auto-imune ou idiopática das células beta ou diabetes tipo 2, caracterizado por alterações na resposta celular a insulina em tecidos alvo como músculo e tecido adiposo e/ou defeitos secretórios nas células beta. O DM tipo 2 representa mais de 80% do total dos casos de diabetes, no entanto, o DM tipo 1, que atinge 5 a 10% dos indivíduos diabéticos, representa um grave problema de saúde pública, desde que esta patologia têm início na infância ou juventude e leva ao desenvolvimento de complicações crônicas (Daneman 2006).

  A progressão da doença resulta em alterações patológicas e complicações que envolvem diversos tecidos tais como, fígado, rim, retina, sistema cardiovascular e sistema nervoso central e periférico (Fajans et al. 1978). Tais complicações comprometem a produtividade, qualidade de vida e sobrevida dos indivíduos, além de envolver altos custos no seu tratamento. A Sociedade Americana de Diabetes (2008) estima que em 2007 foram gastos 174 bilhões de dólares no tratamento do diabetes, dos quais 58 bilhões foram utilizados no tratamento das complicações associadas a doença.

  O desenvolvimento das complicações do diabetes está intimamente relacionado ao aumento do estresse oxidativo. Alterações nos sistemas de defesa antioxidante endógeno associadas ao aumento na produção de espécies reativas de oxigênio, desempenham um papel fundamental no desenvolvimento do dano tecidual inicial observado no diabetes, que posteriormente evolui para as complicações tardias da doença (Stadler et al. 2004).

  Muitas fontes estão relacionadas ao aumento do estresse oxidativo no diabetes, tais como enzimáticas, não enzimáticas e vias mitocondriais (figura 6). A hiperglicemia pode estimular diretamente a produção de ERO através do aumento do fluxo de elétrons pela cadeia de transporte mitocondrial. Normalmente durante os processos de transferência de energia na mitocôndria, cerca de 1 a 3% dos elétrons podem

  “escapar” da cadeia de transporte e gerar o ânion superóxido, sob condições de hiperglicemia este processo é acentuado (Valko et al. 2007).

  As fontes não enzimáticas estão relacionadas a reações bioquímicas de oxidação da glicose por vias secundárias a via glicolítica. Moléculas de glicose podem reagir com grupos amino livres de proteínas e iniciar o processo de formação dos produtos finais de glicação avançada (AGES), estes compostos por sua vez, podem se ligar a receptores celulares e estimular a produção de ERO (Yan et al. 1994). A formação dos AGES também se relaciona com a patogenia das complicações do diabetes, pois leva a disfunção da sinalização celular através da modificação de proteínas intracelulares e componentes da matriz extracelular.

  Além disso, a hiperglicemia também resulta na depleção de defesas antioxidantes, pois favorece a conversão enzimática da glicose em sorbitol, através da via dos polióis, reduzindo as concentrações celulares de NADPH e glutationa. O sorbitol por sua vez pode ser convertido à frutose, levando a um aumento da síntese de novo do diacilglicerol, principal ativador fisiológico da proteína quinase C (PKC). A ativação de PKC está relacionada à patogênese de diversas complicações do diabetes, pois pode estimular vias pró-inflamatórias e produção de ERO pela NADPH oxidase, dentre outros efeitos (Brownlee 2001).

  E por fim, o aumento da glicose intracelular leva a conversão de frutose-6-fosfato em uridina difosfato-N-acetil glucosamina, substrato para a glicosilação de importantes componentes intracelulares, incluindo fatores de transcrição, levando a alterações na expressão gênica e funções de proteínas, que juntamente contribuem para as complicações do diabetes (McClain & Crook 1996).

  

Figura 6. Formação de espécies reativas no diabetes e ação de enzimas antioxidantes.

  O oxigênio é convertido ao ânion superóxido, através da ativação das vias enzimáticas e não enzimáticas, este por sua vez é dismutado em peróxido de hidrogênio (H O ) pela ação da

  2

  2

  superóxido dismutase (SOD). O H O é convertido em água através de reação catalisada pela

  2

  2

  catalase ou glutationa peroxidase. A glutationa reduzida (GSH) é reciclada pela ação da glutationa redutase. O ânion superóxido, quando não é neutralizado pode reagir com o óxido

  • nítrico e formar o peroxinitrito (ONOO ) uma espécie não radicalar, mas muito reativa. Fonte: Adaptado de Johansen et al. (2005).

  As fontes enzimáticas que contribuem para o aumento de ERO no diabetes incluem a óxido nítrico sintase (NOS), xantina oxidase e a NADPH oxidase de neutrófilos (Guzik et al. 2002).

  A NADPH oxidase é formada por subunidades associadas a membrana (Gp91 e

  phox

  p22 ) e subnidades citosólicas (p47 p67 e p40 ), quando ativadas, algumas

  phox phox, phox, phox,

  subunidades são fosforiladas e sofrem translocação para a membrana, e o complexo se torna cataliticamente ativo (Kitada et al. 2003). Uma vez ativada a NAPH-oxidase catalisa a

  redução do oxigênio a ânion superóxido ( O ), através da doação de um elétron fornecido pelo NADPH (Figura 7) (Babior 1994). Guzik et al. (2002) utilizando inibidores da NOS, xantina oxidase, NADPH oxidase e da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial

  • -

  demonstrou que o aumento da produção de O em vasos sanguíneos de indivíduos diabéticos

  

2

é predominantemente mediado pela NADPH oxidase.

  Figura 7. Ativação do complexo NADPH oxidase.

  Fonte: Assari (2006).

2.3.3. Uso de Antioxidantes no Diabetes

  Estudo clínico realizado pelo The Diabetes Control and Complications Trial Research (DCCT) com um total de 1441 pacientes diabéticos do tipo 1 demonstrou que o

  Group

  controle rigoroso da glicemia retarda o início e desenvolvimento das complicações clínicas significativamente, no entanto, não é suficiente para prevenir completamente o surgimento de complicações, sugerindo que estratégias de tratamento associadas podem ser necessárias (1993).

  Diante do papel do estresse oxidativo no desenvolvimento das complicações do diabetes, o uso de antioxidantes pode ser uma estratégia eficaz associada ao tratamento da doença. Dados da literatura mostram que compostos antioxidantes obtidos a partir da dieta, podem oferecer proteção contra o estresse oxidativo nos estágios iniciais do diabetes mellitus e suas complicações em modelos experimentais e humanos. Estes compostos, principalmente os flavonóides, tem apresentado uma correlação positiva com o metabolismo de glicose em diversos estudos. Mekinova et al. (1995) demonstraram que a suplementação com as vitaminas C e E melhorou o status antioxidante no rim em modelo experimental de diabetes induzido por estreptozotocina.

  Em outro estudo, a administração de um extrato aquoso de chá verde rico em polifenóis por 15 dias melhorou a tolerância a glicose, reduziu a glicemia, aumentou a atividade da superóxido dismutase e os níveis de glutationa no fígado de ratos com diabetes induzido por aloxana (Sabu et al. 2002).

  Em relação aos flavonóides, a administração por via intraperitoneal do flavonóide quercetina, 3 dias antes da indução do diabetes com estreptozotocina, e posteriormente por 14 dias preveniu a perda de células B e reduziu biomarcadores do estresse oxidativo no pâncreas de ratos (Coskun et al. 2005). Outros efeitos como redução da glicemia e melhora na sensibilidade a insulina já foram demonstrados após a suplementação na dieta com 0,2% da antocianina cianidina 3-glicosídeo por 5 semanas em camundongos com diabetes tipo 2 (Sasaki et al. 2007) .

  Banini et al. (2006) demonstraram que o consumo de 150 mL de vinho sem alcóol, preparado a partir da uva muscadínia, uma vez ao dia, durante 28 dias reduziu os níveis sanguíneos de insulina de jejum em indivíduos diabéticos tipo 2, no entanto, o consumo do suco e vinho convencional não mostraram diferenças em relação ao controle.

  Diante desses dados promissores relacionados ao uso de antioxidantes dietéticos, sobre o estresse oxidativo e perfil glicêmico em modelos experimentais e clínicos de diabetes, o consumo de açaí, um alimento rico em flavonóides pode apresentar efeitos benéficos em relação às complicações associadas a esta patologia.

3. OBJETIVOS

  3.1. Objetivo Geral

  Avaliar os efeitos da suplementação com a polpa de açaí sobre o balanço oxidante/antioxidante em ratos controle e diabéticos, condições que representam situação fisiológica basal e patológica de estresse oxidativo, respectivamente.

  3.2. Objetivos Específicos

  Avaliar a composição fitoquímica e capacidade antioxidante da polpa de açaí in vitro; I. Em ratos Fischer controle e diabéticos suplementados ou não, com 2% da polpa de açaí na dieta objetivamos avaliar:

  II. A produção de ERO em neutrófilos de sangue periférico;

  

III. Os efeitos da suplementação com a polpa de açaí sobre o perfil glicêmico, tolerância a

  glicose e insulinemia;

  IV. O status antioxidante e biomarcadores do estresse oxidativo em tecido hepático; V. A expressão gênica de enzimas antioxidantes no fígado.

4. MATERIAL E MÉTODOS

  4.1. Polpa de Açaí

  A polpa de açaí pasteurizada (Euterpe oleracea Mart.) foi obtida da Icefruit Comércio de Alimentos Ltda. (Tatuí, São Paulo, Brasil). Para as análises fitoquímicas e determinação da capacidade antioxidante a polpa foi centrifugada (2000 g a 4°C por 15 min) para remoção de resíduos sólidos e lipídios e o sobrenadante foi recolhido e filtrado.

  4.2. Conteúdo de Polifenóis e Antocianinas Totais na Polpa de Açaí

4.2.1. Polifenóis totais

  O conteúdo de polifenóis totais foi determinado pelo método de Folin

  • –Ciocalteu como descrito por George et al. (2005) . Neste método o reagente de Folin-Ciocalteu, que é uma mistura dos ácidos fosfotungstico (H PW O ) e fosfomolíbdico (H PMo O ), se reduz ao

  3

  12

  

40

  3

  12

  40

  oxidar os compostos fenólicos, produzindo óxidos de tugstico (W O ) e molibdenio (Mo

  8

  23

  8 O ) de cor azul que absorvem no comprimento de onda de 760nm. Inicialmente 100

  23

  μL da polpa de açaí foram diluídos em 9,9 mL de água destilada. Em tubos de ensaio, 2,5 mL do reagente de Folin diluído em água destilada (1:10) foi adicionado a 500

  μL da amostra diluída ou solução padrão de ácido gálico em diferentes concentrações (5, 10, 15, 20, 25mg/L) para obtenção da curva de calibração. O branco foi preparado utilizando água destilada. Após 2 minutos, a temperatura ambiente, adicionaram-se 2 mL de solução carbonato de sódio (7,5%) e misturou-se vigorosamente. Após incubação por 15 minutos a 50° C a mistura foi colocada em um banho de gelo. As absorbâncias relativas ao branco foram determinadas a 760nm. Todas as análises foram realizadas em triplicatas. Foi construído um gráfico utilizando os valores de absorbância versus a concentração do ácido gálico. Após análise de regressão linear e obtenção da equação da reta, os valores de absorbância da amostra foram utilizados para o cálculo da concentração de polifenóis. O conteúdo de polifenóis totais foi expresso em miligramas de equivalentes de ácido gálico (GAE) por 100g de polpa fresca.

4.2.2. Antocianinas totais

  O teor de antocianinas totais foi determinado pelo método do pH diferencial de acordo com Giusti & Wrolstad (2001). Esta metodologia permite a quantificação das antocianinas monoméricas totais em função do comportamento espectral diferenciado das monoméricas em relação às poliméricas em condições de pH distintas. Em função dos comprimentos de onda empregados é possível eliminar a interferência de compostos de degradação. A amostra é submetida a dois tampões aquosos distintos, pH 1,0 e 4,5, e as soluções obtidas têm a absorbância medida em dois comprimentos de onda, 700nm e comprimento de máxima absorção (λmáx). Resumidamente, 10ml da polpa de açaí foram diluídos em 30 mL de água destilada. Em dois balões volumétricos de 10 mL foram adicionados 500

  μL da amostra diluída e então, o volume final foi ajustado com tampão cloreto de potássio 0,025 M (pH 1.0) ou tampão acetato de sódio 0.4 M (pH 4.5), separadamente. As absorbâncias das soluções foram determinadas simultaneamente em máximos de absorção na região visível e a 700 nm após incubação no escuro por 30 minutos a temperatura ambiente. Água destilada foi utilizada como branco. O conteúdo de antocianinas monoméricas totais foi expresso em miligramas de equivalentes de cianidina-3-glicosídio por 100g de polpa fresca. Foi utilizado o coeficiente de

  • 1 -1

  extinção molar de 26.900 M cm e massa molecular de 449,2g/mol que correspondem à cianidina-3-glicosídio.

  Para a quantificação das antocianinas totais (AT) foram consideradas as absorbâncias a 510 e 700nm das amostras diluídos nas soluções tampão pH 1.0 e 4.5 e os cálculos de acordo com a equação 2.

  (2)

  Onde; AT são as antocianinas monoméricas totais expressas em mg de cianidina-3- glucosídeo, antocianina majoritária, presentes em 100g de amostra.

  (Abs510 e Abs700)pH 4.5 são as absorvâncias lidas da solução em pH 4.5 nos comprimentos de onda 510 e 700 nm, respectivamente.

  PM é o peso molecular da cianidina-3-glucosídeo; FD é o fator de diluição da amostra ε é o coeficiente de extinção molar da cianidina 3-glucosídeo em solução tampão pH

  1,0 à 510 nm, cujo valor é de 26.900 Lcm -1mol -1; 100 é utilizado para expressar o valor por 100 gramas de amostra.

  • 4.3. Capacidante Antioxidante in vitro contra o Radical DPPH

  A capacidade antioxidante da polpa de açaí foi determinada de acordo com o método previamente descrito por Brand-Williams et al. (1995). Este método se baseia na transferência de elétrons de um composto antioxidante para o radical DPPH• (2,2-difenil-1- picril-hidrazil) em solução de metanol. A redução do DPPH por antioxidantes presentes na amostra é acompanhada pela redução da absorbância a 515nm.

  Resumidamente, as determinações foram realizadas adicionando-se em tubos de ensaio, 3,9 mL de solução de DPPH 60 μM, dissolvidos em metanol 80% e 100 uL da polpa de açaí em diferentes concentrações (0,01; 0,025; 0,5 e 0,1 g/mL), ou o mesmo volume para as soluções padrões, e água destilada (controle). A mistura foi homogeneizada e mantida na ausência de luz por 30 minutos à temperatura ambiente. A absorbância da solução foi determinada a 515 nm. Metanol 80% foi utilizado como branco.

  Utilizou-se Trolox (6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2-ácido carboxílico) em diferentes concentrações ( 200, 400, 600, 800 μM) em metanol 80%, como antioxidante de referência. A atividade antioxidante foi determinada através da redução da absorbância do radical DPPH a 515nm e o percentual de inibição foi determinado de acordo com a equação 3.

  % de inibição do radical DPPH = (A A / A ) x 100

  controle 515 amostra 515 controle 515 (3)

  Onde; A é a absorbância da amostra obtida a 515 nm,

  amostra 515

  A é a absorbância da solução de DPPH sem a presença de antioxidantes

  controle 515 obtida a 515 nm (controle).

  4.4. Animais

  Ratas Fisher, com aproximadamente três meses de idade, pesando cerca de 180 g foram obtidas do laboratório de Nutrição Experimental da Escola de Nutrição, Universidade Federal de Ouro Preto (UFOP). Os animais foram acondicionados em caixas de polipropileno, com quatro animais por caixa, mantidos em ambiente com condições de temperatura, luz e umidade controladas, e receberam comida e água ad libitum. Os procedimentos com animais foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA) da UFOP (Protocolo nº 2010/04, que consta no anexo I deste trabalho).

  4.5. Dietas

  Os animais foram alimentados com dieta padrão AIN-93M (Reeves et al. 1993), ou dieta padrão acrescida de 2% da polpa de açaí (peso seco) conforme descrito na tabela 1. Foi utilizada polpa de açaí congelada, pasteurizada, livre de corantes e conservantes, obtida da Icefruit Comércio de Alimentos Ltda. (Tatuí, São Paulo, Brasil). A polpa foi

  o mantida à -20 C até o preparo das dietas.

  A polpa foi descongelada e adicionada à dieta, que em seguida foi colocada em estufa ventilada a 60ºC por um período de 3h, para redução da umidade. A porcentagem de umidade da polpa utilizada, foi determinada de acordo com o Manual do Instituto Adolfo Lutz (1985), e foi encontrado um teor de umidade de 90%. Dessa forma, para o preparo da dieta padrão com 2% da polpa de açaí (peso seco), 20 mL da polpa de açaí foram adicionados a cada 100 gramas (g) de dieta.

  A composição da polpa de açaí utilizada nos experimentos foi previamente determinada de acordo com o Manual do Instituto Adolfo Lutz (1985) em nosso laboratório e apresenta a cada 100g de peso seco, 42g de gorduras totais, 7,0g de proteínas, 1,1g de açucares e 43g de fibras (de Souza et al. 2010).

  Todas as dietas foram confeccionadas no Laboratório de Nutrição Experimental da Escola de Nutrição, Universidade Federal de Ouro Preto. Acondicionadas em sacos plásticos e armazenadas a -20°C.

  Tabela 1. Composição das dietas experimentais (g/Kg de dieta).

  Nutrientes Dietas

  Padrão Padrão + Açaí Caseína 140,0 140,0 Amido de milho 722,5 702,5 Óleo de soja 40,0 40,0 Colina 2,5 2,5

  1 Mistura de minerais 35,0 35,0

  2 Mistura de vitaminas 10,0 10,0

  Celulose 50,0 50,0 Polpa de açaí

  20 1 Valor Calórico (Kcal) 3810 3812

  Mistura de minerais (expresso em g/kg da mistura): NaCl

  • – 139,3 / KI- 0,79 / MgSO -
  • 4

      7H 2 O- 57,3 / CaCO 3

    • – 381,4 / MnSO4.H O .7H O . 5H O .6H O PO 2 – 4,01 / FeSO
    • 4 2 – 0,548 / CuSO 4 2 – 0,477 / CoCl 2 2 – 0,023 / KH 2 4 2 389,0. Os sais foram adquiridos da Reagen, Rio de Janeiro, Brasil.

        Mistura de vitaminas (expresso em mg/kg da mistura): Acetato de retinol

      • – 690; colecalciferol – 5; ácido p-

        amino benzóico – 10 000; inositol – 10 000; niacina – 4000; riboflavina – 800; tiamina HCL – 500; ácido fólico

      • – 200; biotina – 40; cianocobalamina – 3; dl- - tocoferol – 6 700; sacarose – q.s.p. 1000. As vitaminas foram

        adquiridas da Merk, Darmstadt, Alemanha. A polpa de açaí contém: 82 kcal/20 g, Fatores de conversão: proteínas 4 kcal/g, lipídios 9 kcal/g, açucares 4 kcal/g.

      4.6. Desenho Experimental

        Trinta e dois animais foram divididos em quatro grupos (n=8) de acordo com o tratamento recebido, Controle (C), Açaí 2% (A), Diabético (D), Diabético + Açaí 2% (DA). O diabetes foi induzido por uma única injeção intraperitoneal de estreptozotocina (STZ) (35mg/Kg de peso) em 0,1 M de tampão citrato (pH 4,5), os ratos do grupo C e A receberam uma injeção somente com o veículo. Os animais foram considerados diabéticos quando a glicose sanguínea apresentou valores maiores que 15 mM após 72 horas da injeção de STZ. Os grupos C e D receberam dieta padrão (AIN-93), os grupos A e DA receberam dieta padrão acrescida com 2% da polpa de açaí. Após 30 dias de tratamento os animais foram deixados em jejum por 8 horas, anestesiados com isoflurano e eutanasiados por exsanguinação. O sangue foi recolhido para a obtenção do plasma e dos neutrófilos. O fígado foi coletado, imerso em nitrogênio líquido e imediatamente armazenado a -80°C para análises posteriores.

        4.7. Teste de Tolerância Oral a Glicose (TTOG)

        Os animais permaneceram em jejum por 12 horas e amostras de sangue foram coletadas da veia caudal antes (tempo 0) e após 30, 60 e 120 minutos da administração de uma solução de 2,5g de glicose por Kg de peso corporal em 1 mL de água, por gavagem. Os níveis de glicose foram determinados através do glicosímetro digital (Accu-Check Active; Roche Diagnosis, Basel, Switzerland).

        4.8. Níveis Plasmáticos de Glicose, Insulina e Frutosamina

        Os níveis de glicose, frutosamina foram determinados por método colorimétrico utilizando Kits Labtest (Lagoa Santa, MG, Brasil) de acordo com as instruções do fabricante. O método para determinação da glicose baseia-se na oxidação da glicose catalisada pela glicose oxidase de acordo com a seguinte reação:

        Glicose oxidase

        Glicose + O + H O Ácido Glucônico + H O

        2

        2

        2

        2 O peróxido de hidrogênio formado reage com 4-aminoantipirina e fenol, sob ação

        catalisadora da peroxidase, através de uma reação oxidativa de acoplamento, formando uma antipirilquinonimina vermelha cuja intensidade de cor é proporcional à concentração da glicose na amostra.

        Peroxidase

        2 H O + 4-Aminoantipirina + fenol Antipirilquinonimina + 4 H O

        2

        2

        2 Resumidamente, em um tubo de polipropileno foram adicionados 10

        μL de plasma ou solução padrão de glicose (100mg/dL) e 1 mL do reagente 1 (tampão 50 mmol/L; pH 7,5; glicose oxidase 11.000 U/L; peroxidase 700 U/L; 4-aminoantipirina 290 mol/L; fenol 1 mmol/L e azida sódica 7,5 mmol/L).

        Os tubos foram misturados vigorosamente e colocados em banho-maria a 37 ºC durante 15 minutos. As absorbâncias das amostras teste e do padrão foram determinadas a 505 nm. O regente 1 foi utilizado como branco. Os resultados foram expressos em mmol/L.

        A concentração de glicose foi calculada de acordo com a equação 4.

        Glicose (mg/dL) =

        (4)

        O método para a dosagem de frutosamina, formada pela ligação da glicose com as proteínas plasmáticas, baseia-se na sua capacidade redutora em meio alcalino. Em cubetas foram adicionados 50

        μL do plasma ou do calibrador (359 μmol/L) e 1 mL do reagente de trabalho (tampão fosfato 50mM; tampão carbonato 250 mM, azul de nitrotetrazólio 580

        μM, uricase 3000 U/L, detergentes e estabilizadores em pH 10,3). As amostras foram misturadas e incubadas a 37°C e após exatamente 10 minutos as absorbâncias (A ) foram determinadas em 530 nm, acertando o zero com água destilada. As amostras foram

        1

        incubadas a 37°C por mais exatamente 5 minutos e as absorbâncias (A ) determinadas

        2 conforme etapa anterior.

        A concentração de frutosamina foi calculada de acordo com a equação 5. Frutosamina (

        μmol/L) =

        (5)

        Onde;

      • A )

        2 1 .

        ∆ das absorbâncias é dado pela diferença das absorbâncias (A Os níveis de insulina foram determinados pelo método de imunoensaio do tipo Elisa sanduíche utilizando o Kit Ultra sensitive Rat insulin Elisa Kit (Crystal Chem, Downers

        Grove, IL., USA). O princípio desta dosagem e o respectivo protocolo estão descritos no anexo II deste trabalho.

      4.9. Produção de ERO por Neutrófilos

        4.9.1. Isolamento de neutrófilos

        O sangue foi obtido por exsanguinação do plexo braquial e coletado em tubos heparinizados. Os neutrófilos foram então isolados usando 2 gradientes de densidades diferentes, Monopaque (d = 1.08) e Leucopaque (d = 1.12), de acordo com o procedimento descrito por (Bicalho et al. 1981) com modificações.

        Resumidamente, 4 ml de sangue periférico heparinizado foram adicionados sobre 6 ml de gradiente duplo de Leucopaque e Monopaque (densidade = 1,08 e 1,12, respectivamente) em tubos siliconizados. Após centrifugação a 100 g por 20 minutos foram obtidas duas fases distintas separadas por dois anéis interfásicos, sendo o anel superior formado por células mononucleares e o inferior por neutrófilos. O anel rico em neutrófilos foi colocado em tubo siliconizado com o auxílio de uma pipeta e lavado duas vezes em solução de Hanks pH 7,4. Após as duas lavagens as células foram ressuspendidas em 1,0 ml de solução de Hanks pH 7,4. Depois de isoladas, os neutrófilos, foram utilizados para o ensaio de quimioluminescência.

        A viabilidade celular de cada amostra foi sempre maior que 95% como determinado pelo teste de exclusão com azul de tripan.

        4.9.2. Ensaio de quimioluminescência

        Ensaios de quimioluminescência foram realizados para determinar a produção de ERO como descrito por Martins et al. (2000). O ensaio de quimioluminescência permite avaliar, diretamente, a atividade da NADPH oxidase, a enzima responsável pela geração de espécies reativas de oxigênio, durante a ativação das células fagocíticas (Babior, 1994). Esta técnica baseia-se na reação entre luminol (5-amino-2,3-diidro-1,4-fitalazinediona, Sigma) e os

        6

        intermediários reativos gerados. Para a realização do procedimento experimental, 1 x 10

      • 4

        neutrófilos (em solução de Hanks pH 7,4) foram incubados com 500 l de luminol (10 M). A emissão de fótons foi determinada a cada minuto por 30 min. Os ensaios de quimioluminescência foram realizados em um luminômetro (Lumat, LB 9507, Berthold, Germany). Os valores foram expressos em unidade relativa de luz por minuto (RLU/min).

        

      4.10. Defesas Antioxidantes e Biomarcadores do Estresse Oxidativo em Tecido

      Hepático

      4.10.1. Catalase

        A atividade da catalase foi determinada de acordo com Aebi (1984). O método baseia- se na decomposição do H O pela enzima observada durante 5 min por espectrofotometria a

        2

        2

        240nm. Resumidamente, 100 mg de tecido hepático foram homogeinizados em 1 mL de tampão fosfato 100mM, (pH 7,2) e em seguida centrifugado a 10.000 g por 10 minutos à 4ºC. O sobrenadante foi retirado e usado como amostra biológica. Em um tubo de polipropileno colocaram-se 50

        L de tampão fosfato 100 mM, (pH 7,2) e 40 L de água destilada, o qual foi mantido em banho maria 30ºC por 1 minuto. Em seguida adicionaram-se 10 L da amostra e a reação foi iniciada pela adição de 900 O (10 mM). As absorbâncias

        L de H

        2

        2

        foram determinadas exatamente a cada minuto, durante cinco minutos a 240 nm. Água destilada foi utilizada como branco.

        A atividade da catalase foi calculada segundo a lei de Lambert Beer (equação 6).

        (6)

        Onde; A é a absorbância,

      • 1 -1

        cm ε é o coeficiente de extinção molar em unidades de Mol b é caminho óptico,

      • 1

        C é a concentração da enzima expresssa em mol L A absorbância utilizada corresponde ao delta de absorbância por minuto. Foi utilizado

      • 1 -1

        o coeficiente de extinção molar do peróxido de hidrogênio (39,4 M cm ) Os resultados foram expressos em unidade por miligrama de proteína. Uma unidade de catalase é equivalente a hidrólise de 1umol de H O por minuto.

        2

        2

      4.10.2. Glutationa total

        O conteúdo de glutationa total foi determinado em homogenato de fígado utilizando um Kit Sigma CS0260 (St. Louis, Mo., USA). Este ensaio utiliza um método cinético baseado na redução do DTNB (ácido 5,5´ditio-bis (2-nitrobenzóico)) a TNB (ácido 5-tio-2- nitrobenzóico) que pode ser detectado espectrofotometricamente a 412nm conforme descrito nas reações abaixo:

        1) 2GSH + DTNB  GSSG + 2TNB

        2) GSSG + NADPH + H Glutationa redutase

        2GSH + NADP A combinação das duas reações:

        DTNB + H + NADPH Glutationa redutase

        2TNB + NADP GSSG/GSH Para o procedimento experimental, 100 mg do tecido hepático foram homogeneizados com 1mL de ácido de sulfosalicílico 5%, e em seguida centrifugado por 10 minutos à 4ºC. O sobrenadante foi retirado e usado como amostra biológica.

        Em uma microplaca foram adicionados 10 µL da amostra, em seguida adicionaram-se 150 µL da mistura de trabalho composta por (95 mM de tampão fosfato, pH 7,0, 0,95 mM de EDTA, 48 µM de NADPH, 0.031 mg/ml de DTNB, 0.115 unidades/ml de glutationa redutase, e 0.24% de ácido de sulfosalicílico. As amostras foram então incubadas por 5 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, 50 µL de NADPH 0,16mg/mL foram adicionados às mesmas e o cronômetro disparado. As absorbâncias das amostras foram lidas durante 5 minutos a cada minuto, no leitor de ELISA à 412 nm.

        As absorbâncias de diluições seriadas de uma solução padrão de glutationa reduzida foram determinadas conforme descrito anteriormente, para obtenção da curva de calibração. Após análise de regressão linear, foi determinado a equação da reta (Concentração = a*(delta das absorbâncias) + b). Esta equação foi utilizada para determinar a concentração em nmoles de glutationa total em 10 µL de amostra, e este valor convertido para 1 mL de amostra.

      4.10.3. Proteínas carboniladas

        Os níveis de proteínas carboniladas foram determinados de acordo com o método de Levine et al. (1994). A oxidação de proteína por ERO leva à formação de derivados carbonilados. Estes podem ser mensurados por métodos sensíveis, particularmente aqueles que utilizam o 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH). O DNPH reage com grupos carbonílicos gerando a hidrazona correspondente, a qual pode ser analisada espectrofotometricamente.

        Resumidamente, 400 mg de tecido hepático foram homogeneizados em 2 mL de tampão fosfato 50 mM, (pH 6,7) e em seguida centrifugado a 10000g por 15 minutos à 4ºC. O sobrenadante foi retirado e utilizado no procedimento experimental. 500

        L do sobrenadante do homogenato foram transferidos para dois tubos de polipropileno denominados, Amostra (A) e Controle (C), a cada tubo, foi adicionado igual volume de ácido tricloroácetico (TCA) 10% e após centrifugação, a 5000g por 10 minutos a 4°C, o sobrenadante foi descartado. Em seguida foram adicionados ao tubo A 500 L de DNPH 10 mM, em 2 M de ácido clorídrico (HCl), e ao tubo C 500 L de HCL 2M. Ambos foram mantidos no escuro à temperatura ambiente por um período de 30 minutos e a cada 15 minutos misturava-se vigorosamente. No passo seguinte foram adicionados 500

        L de TCA 10% em cada tubo. Logo após, os tubos foram centrifugados a 5.000 g por 10 minutos a 4°C e os sobrenadantes foram descartados. Em seguida, os precipitados em ambos os tubos foram lavados com 1 mL da mistura etanol/acetato de etila, na proporção de 1:1, misturados no vórtex e novamente centrifugados conforme descrito na etapa anterior, o sobrenadante foi descartado. Este último passo foi repetido por duas vezes. Ao final do processo de lavagem, foi adicionado em ambos os tubos 1 mL de SDS 6%, misturados no vórtex e centrifugados à 10.000 g por 10 minutos à 4°C. Finalmente as absorbâncias dos sobrenadantes foram determinadas a 370 nm. Os resultados foram expressos em nmol de DNPH incorporado/mg de proteína.

        O conteúdo de DNPH incorporado foi calculado utilizando o coeficiente de extinção

      • 1 -1 molar do DNPH (22000 M cm ) segundo a lei de Lambert Beer.

        4.10.4. Proteínas totais

        A concentração de proteínas totais foi determinada de acordo com o método de Lowry (1951). O princípio do método baseia-se na redução do reagente de Folin Ciocalteau, ao et al. reagir com aminoácidos aromáticos, catalisada por íons cobre, em meio alcalino, formando uma coloração azul.

        Inicialmente foram preparadas as soluções de trabalho conforme descrito abaixo: Reagente A: Foram dissolvidos 0,25 g de sulfato de cobre (CuSO

        5H O) e 0,5 g de

        4

        2 citrato de sódio em 100 mL de água destilada.

        Reagente B: Foram dissolvidos 5 g de carbonato de sódio e 1 g de hidróxido de sódio em 250 mL de água destilada. Reagente C: Em 50 mL de reagente B foram adicionados 1 mL de reagente A. Reagente D: Em 1 mL de reagente de Folin foram adicionados 1 mL água destilada. Para a realização do ensaio, 10

        L do sobrenadante do homogenato de tecido hepático, foram diluídos em 90 L de água destilada. Em tubos de polipropileno foram adicionados 100

        L da amostra diluída ou soluções padrão de albumina e água destilada (branco). Em seguida foram adicionados 1 ml do reagente C. Os tubos foram agitados no vórtex e incubados a temperatura ambiente por 15 minutos. Posteriormente foram adicionados 100 L do reagente D em todos os tubos, misturou-se vigorosamente e após 30 minutos de incubação no escuro as absorbâncias das amostras relativas ao branco foram determinadas a 660 nm. Diluições seriadas de uma solução de concentração conhecida de albumina bovina sérica foram utilizadas para a construção da curva de calibração. Após análise de regressão linear, foi determinada a equação da reta, esta foi utilizada para determinar a concentração de proteínas totais no homogenato hepático.

        4.10.5. Níveis de TBARS

        A peroxidação lipídica foi determinada através do ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico utilizando o método de Buege & Aust (1978). A determinação da concentração de TBARS se baseia na capacidade do ácido tiobarbitúrico (TBA) em se ligar a lipídeos oxidados. Resumidamente, 100 mg do tecido hepático foram homogeneizados com 1 mL de tampão Tris HCL 20 mM (pH 7,4) e em seguida centrifugado por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante foi retirado e usado como amostra biológica. 500 µL do sobrenadante do homogenato foram misturados com TCA (28% p/v em HCl 0,25N), TBA (1% em ácido acético 0,25M) e BHT (125mM em etanol), aquecido por 15min a 95°C e em seguida colocado em um banho de gelo. O precipitado foi removido por centrifugação a 10000g por 15 minutos a 4°C, e a absorbância do sobrenadante foi determinada a 535 nm. Água destilada foi utilizada como branco.

        Os níveis de TBARS foram calculados utilizando o coeficiente de extinção molar do

      • 1 -1 MDA (154000 M cm ) segundo a lei de Lambert Beer.

      4.11. Ensaio de RT-PCR quantitativa em tempo real

        4.11.1. Extração do RNA total

        O RNA total do tecido hepático de ratos foi isolado utilizando o sistema RNAgents Total RNA Isolation System (Promega Corporation, Madison, USA) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 50 mg do tecido hepático foram homogeneizados com 600

        μL de solução desnaturante. A separação da fase aquosa foi feita através da adição de 60 μL de acetato de sódio 2M e 600 μL de fenol: clorofórmio, álcool isoamílico (25:24:1) e centrifugação a 10000 g por 20 minutos a 4°C. Para a precipitação do RNA adicionou-se à fase aquosa igual volume de isopropanol, a mistura foi então incubada a -20°C por 20 minutos e depois centrifugada a 10000 g a 4°C. O precipitado foi lavado com etanol 75%, seco a temperatura ambiente por 15 minutos e posteriormente resuspendido com 100

        μL de água deionizada livre de RNAse. A concentração e pureza do RNA total foi verificada a 260 e 280 nm no espectrofotômetro Nano Vue da GE Healthcare (Reino Unido).

        4.11.2. Síntese do cDNA

        O ácido desoxirribonucléico complementar (cDNA) foi sintetizado a partir de 2 μg de

        RNA total utilizando o kit Hight-Capacity cDNA Reverse Transcription da Applied Biosystems, (Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O meio de reação continha 2

        , pH μL de tampão 10x (500 mM de KCl, 100 mM deTris-HCl, 25 mM de MgCl

        2

        8,3), 0,8 μL da mistura de desoxiribonucleotídeos trifosfato (dNTPs) 100 mM, 2 μL de primers randômicos e 1

        μL da enzima transcriptase reversa MultiScribe (50 U/μL). A reação foi realizada nas seguintes condições, 10 minutos a 25°C, seguido de 120 minutos a 37°C e 5 minutos a 85°C no termociclador Biocycler modelo MJ96+.

        4.11.3. Desenho dos primers

        Os primers utilizados para a amplificação dos transcritos de interesse foram desenhados de acordo com sequências de nucleotídeos publicadas por Xiong et al. (2010) para Catalase, Glutationa Peroxidase, yGCS, Zn-SOD e Mn-SOD e GAPDG.

        4.11.4. RT-PCR quantitativa em tempo real

        Para a análise da expressão dos genes em estudo foi utilizada a técnica da reacão em cadeia da polimerase quantitativa pós-transcrição reversa (qRT-PCR). A quantificação dos produtos formados durante os ciclos de amplificação foi realizada com o reagente Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). As reações foram realizadas em placas de 96 poços, com um volume final de reação de 12

        μL, foram pipetados 1 μL de cDNA (100 ng), 0,5

        μL de cada primer (forward e reverse, 10 μM), 6 μL de SYBR® Green Master Mix, o volume final foi ajustado com água livre de DNAse. As reações foram realizadas nas seguintes condições, 50°C por 2min, 95° C por 10 min e então 40 ciclos de 95°C por 15s (desnaturação) e 60°C por 1min (anelamento dos primers e extensão dos produtos) no termociclador ABI 7300 (Applied Biosystems). O gerenciamento do termociclador e a coleta dos dados gerados durante a amplificação foram realizados pelo programa 7000 System SDS

        (Applied Biosystems). Todas as análises foram realizadas em triplicata técnica. A

        Software

        especificidade dos produtos obtidos foi confirmada pela análise das curvas de dissociação do produto amplificado ao final de cada reação.

        Os dados obtidos foram analisados utilizando o método de quantificação relativa da expressão gênica (C ) que permite quantificar diferenças no nível de

        T T ,

        comparativo ou ∆∆C expressão de um gene específico entre as diferentes amostras. A expressão dos genes alvo foi determinada em função da expressão do gene controle endógeno GAPDH e uma amostra calibradora (grupo C) foi utilizada como base para os resultados de expressão comparativa. De posse dos valores de C (threshold cycle), que corresponde ao número de ciclos na fase

        T

        exponencial do PCR de em que a fluorescência ultrapassa o valor basal, foi calculado o ∆C T cada amostra, de acordo com a equação 7, na qual o valor do C do gene controle endógeno

        T (GAPDH) foi subtraído do C do gene alvo. T

        (7)

        de acordo com a equação 8, na qual Em seguida foram calculados os valores de ∆∆C T, das amostras teste

        T T

        o valor do ∆C da amostra calibradora (grupo C) foi subtraído do ∆C (demais grupos experimentais).

        (8)

        obtidos foram utilizados em uma fórmula aritmética para o

        T

        Os valores do ∆∆C cálculo final da diferença de expressão dos genes entre as amostras analisadas, dada por

        ∆∆CT 2 .

      4.11.5. Curva de eficiência dos primers

        Para determinar as eficiência da amplificação dos genes alvo e do gene controle endógeno foram construídas curvas padrões para cada amplicon, a partir de diluições seriadas do cDNA de uma mesma amostra. A análise de regressão linear dos valores de CTs em função do logaritmo da respectiva diluição forneceu o coeficiente angular da reta (a, em y = ax+b) que foi utilizado para o cálculo da eficiência de amplificação do produto pelos primers, utilizando a equação 9:

        (9)

      4.12. Análise Estatística

        Os dados foram expressos como média ± desvio padrão. Todos os dados foram submetidos ao teste de normalidade Kolmogorov

      • –Smirnov. Dados com distribuição normal foram submetidos ao teste-t de Student. Para a análise da capacidade antioxidante in vitro da polpa de açaí foi utilizada a análise de variância univariada (ANOVA one-way) seguida pelo teste de Tukey para comparação das médias. Diferenças foram consideradas significantes para

        < 0,05. Todas as análises foram realizadas utilizado o software GraphPad Prism versão

        p 5.00 para Windows (San Diego, California, USA).

      5. RESULTADOS

        5.1. Conteúdo de Polifenóis e Antocianinas totais na Polpa de Açaí

        O conteúdo de polifenóis totais, antocianinas monoméricas totais da polpa de açaí foram determinados e os resultados obtidos são apresentados na tabela 2.

        Tabela 2. Conteúdo de polifenóis e antocianinas totais na polpa de açaí

        Compostos Concentração

        Polifenóis (mg EAG/100g) 118,3 ± 0,96 Antocianinas monoméricas totais (mg/100g) 28,4 ± 0,69 Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão de determinações em triplicata.

        GAE, equivalentes de ácido gálico.

        5.2.Capacidade Antioxidante in vitro contra o Radical DPPH

        A capacidade antioxidante da polpa de açaí e do antioxidante de referência Trolox foi determinada em quatro diferentes concentrações e expressa em percentual de inibição do radical DPPH. A habilidade da amostra em reduzir a absorbância do DPPH é indicativa de sua capacidade de neutralizar radicais livres. E este é um dos métodos químicos mais utilizados para determinar a capacidade antioxidante de um composto por ser considerado prático, rápido e estável (Espin et al. 2000).

        Os resultados apresentados na figura 8 mostram que a polpa de açaí apresentou alta capacidade de neutralização do radical DPPH, de maneira dose-dependente, semelhante ao antioxidante padrão Trolox na faixa de 200 a 800 μM após 30 minutos.

        

      Figura 8. Percentual de inibição do radical DPPH, por diferentes concentrações da polpa do

        açaí e do antioxidante de referência Trolox, em 30 minutos. Os dados estão expressos como média e desvio padrão de determinações em triplicata. Letras sobrescritas indicam diferença estatística entre as diferentes concentrações de açaí, determinada por análise de variância univariada e pós teste de Tukey.

      5.3. Teste de Tolerância Oral a Glicose (TTOG)

        Com o objetivo de avaliar alterações na homeostase de glicose foi realizado um teste de tolerância oral 72 horas antes da eutanásia dos animais (27° dia de experimento). Conforme pode ser visualizado na figura 9 os animais do grupo C e CA apresentaram perfis semelhantes de glicemia em todos os tempos avaliados e nenhuma diferença significativa foi observada entre estes grupos. Os animais do grupo D apresentaram glicemia de jejum média acima de 19,05 mM, sendo que esta após 30 minutos da administração da solução de glicose atingiu a concentração de 28,27 mM e um pico aos 60 minutos de 30,69 mM, após 120 minutos verificou-se uma redução da glicemia para 25,21 mM. O grupo DA apresentou valores menores de glicemia em todos os momentos, exceto aos 30 minutos, em relação ao grupo D, porém tais diferenças não foram estatisticamente significativas. Em todos os tempos avaliados os animais dos grupos diabéticos (D e DA) apresentaram glicemia significativamente (p < 0,001) maior que o grupo controle.

        35

        30

      • 25
      • L

        C

        20 ol/

        CA mm

        D

      15 DA

        Glicose

        10

        5 30' 60' 120'

        Tempo em minutos

        Figura 9. Teste de tolerância oral a glicose (TTOG) realizado 72 horas antes da eutanásia dos

        animais. Glicemia de ratos do grupo controle (C) controle + açaí (CA), diabético (D) e diabético + açaí (DA) no tempo 0 e após 30, 60 e 120 minutos após a administração de solução contendo 2,5g de glicose por Kg de peso corporal. Os dados estão expressos como média ± desvio padrão. (n=8). *** p < 0,001 em relação ao controle para os grupos D e DA.

        Os dados relacionados ao perfil glicêmico tomados em conjunto demonstram que nestas condições experimentais a polpa de açaí não altera significativamente a homeostase de glicose, níveis de proteínas glicadas (frutosamina) e insulina.

      5.4. Níveis Plasmáticos de Glicose, Insulina e Frutosamina

        Desde que dados da literatura sugerem um papel de antioxidantes dietéticos sobre a homeostase de glicose e insulina, primeiramente foram avaliados os efeitos da ingestão do açaí sobre níveis de glicose, frutosamina, insulina e tolerância a glicose.

        Como esperado, ao final de 30 dias, ratos diabéticos foram caracterizados por aumento nos níveis de glicose e frutosamina e redução nos níveis de insulina (tabela 3). Os animais do grupo D apresentaram aumento de 4,4 e 2,1 vezes nos níveis de glicose e frutosamina respectivamente, enquanto os níveis de insulina foram cerca de 4,4 vezes menores em relação ao grupo controle. A suplementação dietética com 2% da polpa de açaí não alterou os níveis de glicose, insulina e frutosamina em ratos controle e diabéticos.

        Em relação ao peso corporal, os resultados na tabela 3 mostram que ao início do experimento os animais de todos os grupos experimentais apresentavam em média um peso de 180g. Entretanto, os animais dos grupos controle (C) e controle + açaí (CA) apresentaram um aumento no peso corporal, relativo ao crescimento normal enquanto os animais dos grupos diabético (D) e diabético + açaí (DA) apresentaram uma redução significativa do peso corporal ao longo do experimento e ao final apresentavam redução de 34,7 e 37,84% respectivamente em relação ao controle.

        O peso do fígado não apresentou diferença entre grupos.

        

      Tabela 3. Efeitos da suplementação com a polpa de açaí sobre níveis de glicose, insulina,

      peso corporal e peso do fígado em ratos controle e diabéticos.

        Variáveis Grupos Experimentais Controle Açaí Diabético Diabético + Açaí

        Peso corporal inicial 180,5 ± 16,26 180,1 ± 17,41 180,6 ± 7,49 180,8 ± 8,29 (g)

      Peso corporal final (g) 199,24 ± 19,87 203,13 ± 25,33 130 ± 10,77*** 126,25 ± 11,3***

      Glicose (mmol/L) 5,36 ± 0,89 5,68 ± 0,94 23,52 ± 3,06*** 24,67 ± 2,57***

      Insulina plasmática

        65,20 ± 45,80 88,21 ± 42,99 14,71 ± 4,31* 12,54 ± 7,49** (pmol/L)

      Frutosamina (umol/L) 7,77 ± 1,38 8,35 ± 1 16,01 ± 2,81*** 16,27 ± 2,39***

      Peso do fígado (g) 4,83 ± 0,63 4,86 ± 0,75 4,94 ± 0,41 4,85 ± 0,41

        Todos os valores são expressos como média ± desvio padrão. (n=8).

      • p< 0,05 em relação ao controle
        • p< 0,01 em relação ao controle
        • p< 0,001 em relação ao controle

      5.5. Produção de ERO por Neutrófilos

        Para investigar propriedades antioxidantes da polpa de açaí in vivo, nós determinamos a produção de ERO em neutrófilos isolados de sangue periférico dos animais dos grupos experimentais. Ratos diabéticos apresentaram aumento de 3,7 vezes na produção de ERO em relação aos ratos controle, enquanto o grupo diabético suplementado com açaí não apresentou diferença significativa em relação ao grupo controle. A adição da polpa de açaí também reduziu significativamente (p<0,01) cerca de 2,6 vezes a produção de ERO em ratos controle (figura 10). Esses resultados sugerem que a polpa de açaí, além de apresentar grande capacidade antioxidante in vitro, apresenta propriedades antioxidantes in vivo e pode modular a produção de ERO por neutrófilos. No entanto este efeito foi evidenciado em ratos controle, mas não em ratos diabéticos.

        3000

      • .

        2000 in /m U L R 1000

      • C A D DA

        Figura 10. Efeito da suplementação com a polpa de açaí sobre a produção de espécies

        reativas de oxigênio por neutrófilos de ratos controle e diabéticos. Os dados estão expressos como média ± desvio padrão. (n=8). C, grupo controle; A, grupo controle + açaí; D, grupo diabético; DA, grupo diabético + açaí. ** p < 0,01 em relação ao grupo controle. RLU/min., Unidade relativa de luz por minuto.

      5.6. Defesas Antioxidantes e Biomarcadores do Estresse Oxidativo

      5.6.1. Defesas antioxidantes

        Para avaliar os efeitos da suplementação com a polpa de açaí sobre defesas antioxidantes hepáticas, foram determinados a atividade da enzima catalase e os níveis de glutationa total. Os resultados são mostrados na figura 11.

        A atividade da catalase não apresentou diferenças significativas entre os grupos experimentais. Em relação à glutationa, a suplementação com a polpa de açaí aumentou o conteúdo hepático de glutationa total em aproximadamente 1,6 e 1,7 vezes em ratos controle e diabéticos, respectivamente.

        

      Figura 11. Efeitos da suplementação com a polpa de açaí sobre a atividade da catalase (A) e

        conteúdo de glutationa total (B) em tecido hepático de ratos controle e diabéticos. Os dados estão expressos como média ± desvio padrão. (n=8). C, grupo controle; A, grupo controle + açaí; D, grupo diabético; DA, grupo diabético + açaí. ** p < 0,01 em relação ao grupo controle. GSH, glutationa.

        C A D DA

        50 100 150 C a ta la s e ( U /mg p ro te in a ) C A D DA

        20

        40

        60

        80

        G S H t o ta l (n m o l/ m L ) A B

      5.6.2. Biomarcadores do estresse oxidativo

        C A D DA

        T B A R S n m o l/ m g p ro te in a A B

        0.8

        0.6

        0.4

        0.2

        0.0

        15

        10

        5

        C A D DA

        carboniladas (A) e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) (B) em tecido hepático de ratos controle e diabéticos. Os dados estão expressos como média ± desvio padrão. (n=8). C, grupo controle; A, grupo controle + açaí; D, grupo diabético; DA, grupo diabético + açaí.

        

      Figura 12. Efeitos da suplementação com a polpa de açaí sobre os níveis de proteínas

        Possíveis alterações no balanço oxidante/antioxidante em tecido hepático foram avaliadas através da dosagem de biomarcadores do estresse oxidativo, TBARS e proteínas carboniladas. Os níveis de TBARS e conteúdo de proteínas carboniladas são amplamente usados como marcadores de dano a membranas celulares e modificação oxidativa em proteínas, respectivamente. Os resultados são apresentados na figura 12. Ratos diabéticos apresentaram aumento no estresse oxidativo hepático evidenciado pelo aumento de 1,6 vezes observado nos níveis de TBARS e 2,1 vezes nos níveis de proteínas carboniladas. A adição de 2% da polpa de açaí apresentou efeito protetor ao reduzir significativamente a peroxidação lipídica em ratos diabéticos a níveis semelhantes ao observado no grupo C. Adicionalmente, a suplementação com açaí em ratos controle também reduziu 1,7 vezes os níveis de proteína carbonilada em relação ao grupo C.

      • #
        • P ro te in a C a rb o n il a d a n m o l/ m g p ro te in a

      • p < 0,05 em relação ao grupo controle; ** p < 0,01 em relação ao grupo controle; # p < 0,05 em relação ao grupo diabético.

        Os resultados obtidos em relação às defesas antioxidantes e biomarcadores do estresse oxidativo sugerem uma alteração do balanço redox em tecido hepático de ratos diabéticos, o qual leva a um aumento no dano oxidativo a lipídeos e proteínas. A suplementação com açaí apresentou efeitos benéficos, em ratos diabéticos, tanto em relação às defesas antioxidantes, ao aumentar os níveis de glutationa, quanto aos biomarcadores do estresse oxidativo ao reduzir a peroxidação lipídica. Também foi observada melhora do balanço oxidante/antioxidante hepático em ratos controle suplementados com a polpa de açaí, estes apresentaram aumento de glutationa e redução na oxidação de proteínas.

      5.7. RT-PCR quantitativa em Tempo Real

        Para investigar os mecanismos moleculares da capacidade antioxidante da polpa de açaí no fígado, foi feita a análise quantitativa da expressão gênica das enzimas antioxidantes Zn-SOD e Mn-SOD,

        γ-GCS, GPx e Catalase, por RT-qPCR. Os resultados representados na figuras 13 e 14 mostram que ratos diabéticos apresentaram redução na expressão de Zn-SOD, γ-GCS e GPx quando comparado ao grupo controle, no entanto para os animais do grupo DA os níveis de mRNA para γ-GCS não diferiram do controle.

        Por outro lado, a adição da polpa de açaí na dieta aumentou a expressão de γ-GCS e

        GPx cerca de 1,8 e 2 vezes respectivamente em ratos controle ( grupo CA), porém este efeito não foi observado em ratos diabéticos.

        Os níveis de mRNA para a Mn-SOD não apresentaram diferenças entre os grupos estudados.

        5 Ra o d e e x p re s s ã o d e M n -S O D (v s . c o n tr o le ) A B

        2.0

        4

        3

        2

        1

        R a o d e e x p re s s ã o d e Z n -S O D (v s . c o n tr o le ) C A D DA

        2.5

        1.5

        1.0

        0.5

        0.0

        C A D DA

        enzimas antioxidantes Zn-SOD (A), Mn-SOD (B) em tecido hepático de ratos controle e diabéticos. Os dados estão expressos como média ± desvio padrão. (n=6). C, grupo controle; A, grupo controle + açaí; D, grupo diabético; DA, grupo diabético + açaí. O grupo C foi utilizado como amostra calibradora e os dados estão expressos como razão de expressão (número de vezes em relação ao grupo C)

        

      Figura 13. Efeitos da suplementação com a polpa de açaí sobre a expressão gênica das

      • p < 0,05 em relação ao grupo controle; Zn-SOD, zinco-superóxido dismutase; Mn-SOD, manganês-superóxido dismutase; vs., versus

        

      Figura 14. Efeitos da suplementação com a polpa de açaí sobre a expressão gênica das

      enzimas antioxidantes γ-GCS (A) e GPx (B) em tecido hepático de ratos controle e diabéticos.

        Os dados estão expressos como média ± desvio padrão. (n=6). C, grupo controle; A, grupo controle + açaí; D, grupo diabético; DA, grupo diabético + açaí. O grupo C foi utilizado como amostra calibradora e os dados estão expressos como razão de expressão (número de vezes em relação ao grupo C)

        C A D DA

        0.0

        0.5

        1.0

        1.5

        2.0

        2.5

        R a o d e e x p re s s ã o d e y -GCS (v s . c o n tr o le ) C A D DA

        1

        2

        3

        R a o d e e x p re s s ã o d e GPx (v s . c o n tr o le ) A B

      • p < 0,05 em relação ao grupo controle; ** p < 0,01 em relação ao grupo controle; *** p < 0,001 em relação ao grupo controle. γ-GCS, gama-glutamilcisteína sintetase; GPx, glutationa peroxidase; vs., versus

        Como mostrado na figura 15, a expressão da catalase foi significativamente menor em ratos diabéticos suplementados com açaí em relação ao grupo controle, porém não apresentou diferença em relação ao grupo diabético não tratado com açaí.

        T

        2.5 A C e

        2.0 d ) o le ã o s

        1.5 s tr n re o p

      • c x

        1.0 . e s e (v d

        0.5 o a

        0.0 R C A D DA

      Figura 15. Efeitos da suplementação com a polpa de açaí sobre a expressão gênica da enzima

        antioxidante catalase em tecido hepático de ratos controle e diabéticos. Os dados estão expressos como média ± desvio padrão. (n=6). C, grupo controle; A, grupo controle + açaí; D, grupo diabético; DA, grupo diabético + açaí. O grupo C foi utilizado como amostra calibradora e os dados estão expressos como razão de expressão (número de vezes em relação ao grupo C)

      • p < 0,05 em relação ao grupo controle; CAT, catalase; vs., versus

        A redução nos níveis de mRNA que codificam para as enzimas antioxidantes γ-GCS, GPx e Zn-SOD em ratos diabéticos corrobora com os dados anteriores que sugerem um aumento no estresse oxidativo hepático nestes animais.

        A indução da expressão gênica das enzimas antioxidantes γ-GCS e GPx pela polpa de açaí pode ser responsável, pelo menos em parte, pela melhora do status antioxidante hepático observada em ratos controle após a suplementação com açaí.

      6. DISCUSSÃO

        O estresse oxidativo, resultado de um desequilíbrio entre a produção de espécies reativas e a capacidade dos sistemas de defesa antioxidante endógenos em neutralizá-las, tem sido associado ao desenvolvimento e progressão das complicações observadas no diabetes (Baynes 1991). Neste contexto, antioxidantes dietéticos como os polifenóis, embora não possam reverter completamente as complicações do diabetes podem apresentar uma alternativa terapêutica para prevenir ou atenuar tais complicações (King & Loeken 2004).

        Diante disso, o objetivo do pressente trabalho foi investigar o papel da suplementação com a polpa de açaí sobre a produção de ERO em neutrófilos, balanço oxidante/antioxidante e expressão gênica de enzimas do sistema de defesa antioxidante hepático, em ratos controle e diabéticos.

        Inicialmente, foram determinados o teor de compostos fenólicos e antocianinas totais da polpa de açaí. Esta apresentou valores de polifenóis totais (118,3 ± 0,96) expressos em mg de equivalentes de ácido gálico (mg/GAE) e antocianinas totais (28,36 ± 0,69mg/100g) semelhantes aos encontrados por Kuskoski et al. (2006) em polpas congeladas de açaí comercializadas no sul do Brasil. No entanto, estes valores são muito inferiores aos encontrados por Ribeiro et al. (2010) para polifenóis (424,9 ± 8,8 mg GAE) e antocianinas (252,9 ± 10,1 mg/100g).

        Uma grande variação no conteúdo de antocianinas encontradas em polpas de açaí, de diferentes origens, foi demonstrada por Lichtenthaler et al. (2005) onde a concentração destes compostos variou de 1,3 a 46,3 mg/100g em 10 polpas comerciais e não comerciais avaliadas.

        As variações observadas nas concentrações destes compostos podem ser explicadas por diferenças em relação aos métodos de extração e quantificação. O teor de antocianinas pode ser influenciado por fatores climáticos, como temperatura e iluminação, que, dessa forma, dificultam a comparação entre diferentes cultivos, e épocas climáticas diferentes.

        No caso de amostras comerciais de açaí a concentração destes compostos pode variar significativamente conforme o teor de massa seca. As polpas de açaí, extraídas com adição de água, destinadas ao consumo podem ser classificadas em três diferentes tipos (açaí fino, médio ou grosso) de acordo com o teor de sólidos totais, sendo que o açaí fino apresenta de 8 a 11%, o médio, de 11 a 14% e o grosso, acima de 14% de sólidos totais (Ministério da Agricultura 2000).

        Os compostos fenólicos são associados à capacidade antioxidante de frutas e vegetais. Neste trabalho a capacidade antioxidante da polpa de açaí in vitro foi determinada através da capacidade de “seqüestrar” o radical DPPH•. Nossos resultados mostram que a polpa de açaí apresenta alta capacidade antioxidante de maneira dose-dependente. Esta capacidade foi observada mesmo em concentrações muito baixas (0,01g/mL).

        Estes dados corroboram com diversos trabalhos na literatura que mostram a grande capacidade antioxidante da polpa de açaí sobre diversas fontes de radicais. Dentre eles Seeram et al. (2008) demonstraram que o suco de açaí pronto para consumo foi capaz de neutralizar 18.3% ±1.2 do radical DPPH

      • e Del Pozo-Insfran et al. (2004) concluíram que a polpa de açaí apresenta alta capacidade antioxidante (48,6

        μM TEAC/mL) em relação a outros frutos como morango, amora e framboesa avaliada pelo método ORAC. No entanto em outro estudo a polpa de açaí apresentou capacidade antioxidante pelo método DPPH menor que outros frutos, sendo a ordem decrescente: acerola, manga, morango, uva e açaí em 30 minutos expressos em atividade antioxidante equivalente ao Trolox (TEAC) (Kuskoski et al. 2006).

        A avaliação da atividade antioxidante baseada em metodologias in vitro deve ser feita com cautela uma vez que as mesmas não consideram fatores como biodisponibilidade e estabilidade do composto in vivo, retenção dos antioxidantes pelos tecidos e atividade celular (Huang et al. 2005). Por isso, neste trabalho avaliamos também as propriedades antioxidantes in vivo da polpa de açaí sobre a produção de ERO por neutrófilos e status antioxidante hepático.

        O fígado é o principal órgão envolvido em processos oxidativos e de detoxificação, em muitas doenças biomarcadores do estresse oxidativo estão elevados no fígado em estágios iniciais (Stadler et al. 2003). Dados experimentais evidenciam o aumento da formação do radical hidroxil no fígado de ratos diabéticos (Ohkuwa et al. 1995) e também que este órgão está sujeito ao dano mediado por ERO no diabetes (Manna et al. 2010; Shanmugam et al. 2011; Saravanan & Ponmurugan 2011). Nossos resultados mostram uma redução na expressão do mRNA das enzimas antioxidantes Zn-SOD, GPx, e

        γ-GCS em tecido hepático de ratos diabéticos. Alterações no balanço oxidante/antioxidante hepático podem afetar a translocação de fatores de transcrição sensíveis ao estado redox para o núcleo. Portanto a redução nos níveis de mRNA de enzimas antioxidantes no diabetes pode ser devida à oxidação de fatores de transcrição responsáveis pelo início da maquinaria do processo de transcrição das enzimas antioxidantes (Sadi et al. 2008). Em estudo recente (Hur et al. 2010) foi feita uma triagem em toda a literatura biomédica envolvendo a busca dos termos “diabetes” e “espécies reativas de oxigênio” para listar os genes e proteínas alvo de ERO relacionados ao diabetes. Esta busca resultou em 1021 alvos a partir de 1154 artigos científicos indexados no Pubmed e a compilação dos resultados e confirmação por revisão manual demonstrou que dentre os 10 alvos mais freqüentes encontram-se Zn-SOD, catalase, proteína quinase C e NADPH oxidase. Para confirmar a relevância biológica dos achados, nove dos genes ranqueados foram selecionados para análise da expressão gênica por RT-qPCR em camundongos, controle e com diabetes induzido por estreptozotocina, destes oito genes foram diferencialmente expressos em camundongos diabéticos após 20 semanas em gânglios da raiz dorsal, dentre eles Zn-SOD, Mn-SOD e catalase, apresentaram redução nos níveis de mRNA.

        A superóxido dismutase converte o ânion superóxido em peróxido de hidrogênio, o qual é neutralizado em água e oxigênio molecular pela atividade da catalase e GPx. As isoformas da superóxido dismutase estão localizadas em diferentes compartimentos celulares. Zn-SOD é encontrada no citosol e no núcleo. Mn-SOD é a isoforma mitocondrial. Nossos dados corroboram com estudos recentes que demonstraram redução na expressão de mRNA e proteína para a Zn-SOD no fígado de ratos diabéticos (Sadi et al. 2008), no entanto a expressão do mRNA para Mn-SOD não apresentou alteração nas mesmas condições (Sadi & Guray 2009). Esses resultados sugerem que a Zn-SOD é mais sensível ao estresse oxidativo causado pelo diabetes.

        As enzimas glutationa peroxidases, constituem uma importante família de selenoproteínas que catalizam a inativação do peróxido de hidrogênio e hidroperóxidos de lipídios, através da formação de uma ponte dissulfeto entre duas moléculas de glutationa reduzida, formando a glutationa oxidada. As isoenzimas GPx são tecido-específicas, codificadas por diferentes genes e apresentam especificidade para substratos distintos e incluem a GPx-1 ou clássica, que tem expressão ubíqua, GPx-2 específica do trato gastrointestinal, GPx-3 plasmática e GPx-4 também chamada de fosfolipídio hidroperóxido glutationa peroxidase (Haddad & Harb 2005).

        A GPx clássica é uma das selenoproteínas mais abundantes e têm sido demonstrado que o estresse oxidativo está relacionado a redução em sua expressão (Cheng et al. 1999). Neste trabalho foi observada redução nos níveis de mRNA que codificam para esta isoenzima em tecido hepático de ratos diabéticos. Diversos estudos demonstram redução na atividade da GPx em tecidos de animais diabéticos (Shukri et al. 2010; Manna et al. 2010; Shanmugam et al. 2011). No entanto o efeito do estresse oxidativo causado pelo diabetes sobre a expressão gênica de GPx varia significativamente na literaura. Matsunami et al. (2009) encontraram aumento da expressão do mRNA para GPx no fígado de ratos Wistar que permaneceram diabéticos por 7 dias. Em outro estudo, não foi observada diferença nos níveis hepáticos de mRNA para GPx em ratos diabéticos quando comparado ao controle ao final de 30 dias (Sadi & Guray 2009). Essas variações podem ser explicadas pelas diferenças nas condições experimentais, como a duração do diabetes e idade dos animais.

        A Gama-glutamil-cisteina sintase é a enzima que catalisa a etapa limitante na síntese da glutationa, o mais importante antioxidante celular endógeno (Rahman 1999; Haddad & Harb 2005), por isso desempenha um papel fundamental nos mecanismos de defesa antioxidante. No presente estudo ratos diabéticos apresentaram redução na expressão do mRNA da γ-GCS, e este dado corrobora com evidências da literatura. Urata et al. (1996) mimetizando as condições de hiperglicemia observadas no diabetes demonstraram que ao alterar a concentração de glicose no meio, em linhagem de células endoteliais, de baixa (5,5 mM) a alta (28 mm), por 7 dias é observada uma redução na expressão nos níveis de mRNA para

        γ-GCS e propuseram que a exposição crônica a altas doses de glicose, reduz a expressão gênica de γ-GCS que por sua vez pode estar relacionada com as complicações vasculares no diabetes.

        A catalase é uma hemoproteína que se localiza nos peroxissomos e catalisa a detoxificação do peróxido de hidrogênio em oxigênio e água (Winterbourn 1993). Foi observado neste trabalho uma menor expressão do mRNA da catalase em ratos diabéticos suplementados com a polpa de açaí, no entanto essa redução não se refletiu sobre a atividade da enzima. Dados da literatura evidenciam a regulação pós-transcricional da expressão da catalase. Limaye et al. (2003) observaram um aumento na expressão gênica do mRNA para catalase no córtex renal de ratos diabéticos (induzido por STZ) em contraste com uma redução na atividade da enzima.

        Estas alterações observadas nos níveis de mRNA das enzimas antioxidantes Zn-SOD, GPx e

        γ-GCS em tecido hepático de animais diabéticos, não foram revertidas pela suplementação com a polpa de açaí. De forma semelhante Sadi et al. (2008) e Sadi & Guray (2009) avaliaram os efeitos da suplementação com os antioxidantes vitamina C e ácido alfa- lipóico sobre a expressão gênica de enzimas antioxidantes em fígado de ratos diabéticos e também não encontraram diferenças na expressão dos genes Zn-SOD e GPx em relação ao grupo diabético não suplementado.

        O aumento na produção de espécies reativas observado no diabetes pode afetar vias de sinalização celulares e a expressão gênica. Desta forma, mesmo que antioxidantes exógenos possam apresentar benefícios em atenuar estresse oxidativo, torna-se difícil fornecer antioxidantes em concentrações suficientes para restaurar completamente o estado redox, visto que estes não podem ser regenerados enzimaticamente como a glutationa.

        Assim, uma vez que os padrões de expressão gênica foram alterados pelo estresse oxidativo no diabetes, pode não ser possível reverter esse processo e restabelecer os padrões normais de expressão gênica (Chin et al. 2008). Esta pode ser a causa pela qual a suplementação com açaí não foi capaz de reverter as alterações na expressão gênica em ratos diabéticos, e no entanto, promoveu alterações nos níveis de mRNA de enzimas antioxidantes em ratos controle.

        Os polifenóis são os principais componentes fitoquímicos encontrados na polpa do açaí. Muitos polifenóis dietéticos apresentam atividade antioxidante, que é atribuída a sua capacidade de neutralizar diretamente espécies reativas pró-oxidantes. Além disso, dados experimentais indicam que polifenóis podem oferecer proteção indireta contra o estresse oxidativo através da ativação da transcrição gênica de enzimas do sistema de defesa antioxidante endógeno (Masella et al. 2005). Nossos resultados estão de acordo com estes estudos, pois mostram uma indução da expressão gênica das enzimas antioxidantes hepáticas γ-GCS e GPx pela suplementação dietética com a polpa de açaí em ratos controle e indicam um possível efeito da polpa de açaí sobre a sinalização redox celular in vivo.

        A indução da expressão de enzimas do sistema de defesa antioxidante por polifenóis, obtidos a partir da dieta, resulta principalmente da ativação mediada pelo fator de transcrição Nrf2 através da interação com o elemento de resposta antioxidante (ARE), encontrado na região promotora de muitos genes induzidos por alterações no estado redox (Masella et al. 2005).

        O papel da ativação de ARE por polifenóis, em estimular a transcrição do gene γ-GCS foi demonstrado em cultura de células COS-1 e HepG2 (Myhrstad et al. 2002). Experimentos

        

      in vivo também demonstraram a indução da expressão do mRNA das enzimas Zn-SOD, GPx

        e CAT, acompanhada por um aumento nos níveis da proteína Nrf2, em tecido cardíaco de ratos controle, após administração oral dos ácidos fenólicos, ácido gálico, ferrúlico e cumárico por 14 dias (Yeh et al. 2009).

        A suplementação com açaí em ratos controle promoveu uma expressão diferencial dos genes que codificam para as enzimas antioxidantes γ-GCS e GPx, relacionadas a síntese e ao ciclo catalítico da glutationa, ambos alvos de regulação da transcrição por ARE/Nrf-2, portanto este pode ser o mecanismo envolvido na indução da expressão de enzimas antioxidantes pelo açaí.

        A glutationa (GSH) é um tripeptídeo (L- γ-glutamil-L-cisteinilglicina) que exerce papel central na defesa antioxidante, destacando-se sua função como cofator da família de enzimas glutationa peroxidases (GPx), em que desempenha papel protetor contra o estresse oxidativo, com sua oxidação a glutationa dissulfeto (GSSG).

        A síntese “de novo” da glutationa ocorre principalmente no fígado (Jefferies et al. 2003) e a indução da GSH hepática por agentes fitoquímicos dietéticos in vivo tem sido demonstrada em diversos estudos (Ravi et al. 2004; Codoner-Franch et al. 2008). Nossos resultados mostram que a suplementação com açaí aumenta os níveis hepáticos de glutationa total em ratos controle e diabéticos. O alto conteúdo de glutationa encontrado no fígado após a suplementação com açaí pode refletir um aumento do status antioxidante e indica um papel do açaí em aumentar a biossíntese da glutationa, ou em reduzir o estresse oxidativo levando a uma menor degradação da glutationa, ou ambos.

        Roig et al. (2002) demonstraram que a principal via de detoxificação para produtos da peroxidação lipídica envolve a conjugação com a glutationa. Por isso, o aumento nos níveis hepáticos de glutationa pode ter contribuído para a redução nos níveis de TBARS em ratos diabéticos suplementados com açaí quando comparados aos animais do grupo diabético não suplementado. Por outro lado, experimentos conduzidos in vitro evidenciam a capacidade de inibição da peroxidação lipídica de extratos e polpa de açaí em homogenato de fígado (Arruda

        2004) e em cortex cerebral, cerebelo e hipocampo de ratos (Spada et al. 2009). Estes et al. dados sugerem que a redução da peroxidação lipídica pela polpa de açaí também pode ser devida a uma ação direta de componentes antioxidantes presentes na polpa.

        A dosagem de TBARS é um dos biomarcadores mais utilizados para detectar a peroxidação lipídica (le-Donne et al. 2006). As membranas celulares e intracelulares, possuem grandes quantidades de ácidos graxos polinsaturados, e por isso são susceptíveis a peroxidação lipídica por espécies reativas. Modificações oxidativas causam mudanças nas propriedades físicas e químicas das membranas, alterando sua fluidez e permeabilidade.

        O aumento da peroxidação lipídica é caracteristica do diabetes e têm sido demonstrado em plasma de pacientes diabéticos do tipo 1 (Goodarzi et al. 2010) e diversos tecidos tais como fígado, pâncreas e rim de modelos esperimentais (Kakkar et al. 1998; Chis et al. 2009; Saravanan & Ponmurugan 2011). O acúmulo de TBARS observado neste estudo, no fígado de ratos diabéticos, corrobora com dados da literatura e pode estar relacionado a redução na expressão de enzimas antioxidantes nestes animais, e desempenhar um papel no dano hepático associado ao diabetes. Dessa forma, o efeito protetor da suplementação com açaí sobre a peroxidação lipídica, no diabetes pode contribuir para atenuar os danos neste orgão.

        As alterações no balanço oxidante/antioxidante hepático em modelos experimentais de diabetes são evidenciadas também pelo aumento de proteínas carboniladas (Cumaoglu et al. 2007; Manna et al. 2010). A carbonilação de proteínas é característica do dano oxidativo. A exposição destas biomoléculas a ERO pode causar grandes alterações em sua estrutura com consequente perda de função. As proteínas são os maiores alvos de ERO por causa da sua alta abundância em sistemas biológicos e muitas vezes o dano oxidativo é irreversível e possui um grande impacto fisiológico, uma vez que estas participam da maioria dos processos funcionais celulares (Davies et al. 1999). Em concordância com a literatura, neste estudo foi encontrado aumento nos níveis de proteína carbonilada em tecido hepático de ratos diabéticos. No entanto este aumento não foi revertido pela suplementação com açaí.

        Por outro lado, a suplementação com açaí reduziu os níveis hepáticos de proteína carbonilada em ratos controle. Esta redução pode estar associada com o aumento do status antioxidante hepático nesses animais, evidenciado pela indução da expressão de enzimas antioxidantes neste órgão e aumento nos níveis de glutationa. Tais resultados estão de acordo com De Souza et al. (2010) que encontraram redução nos níveis plasmáticos de proteínas carboniladas, associados ao aumento de grupos sulfidrilas livres e ligados a proteína em ratos controle e hipercolesterolêmicos após 6 semanas de suplementação com a polpa de açaí.

        Embora muitas fontes de ERO estejam relacionadas a patogênese do diabetes, uma fonte importante é a NADPH oxidase de neutrófilos (Shurtz-Swirski et al. 2001). A ativação de neutrófilos leva a geração de ERO através da ativação do complexo enzimático NADPH oxidase, o qual catalisa a redução do oxigênio em ânion superóxido, este processo é denominado “explosão respiratória”. Tem sido demonstrado que a hiperglicemia associada ao

        

      diabetes mellitus resulta em ativação dos neutrófilos (Karima et al. 2005), que por sua vez

        contribui para o aumento do estresse oxidativo, em parte responsável pelas complicações do diabetes.

        Ayilavarapu et al. (2010) demonstraram que neutrófilos isolados de indivíduos

        diabéticos apresentam produção do O significativamente maior em relação a indivíduos

        2 saudáveis. Nossos resultados corroboram com este estudo, uma vez que ratos diabéticos apresentaram um aumento significativo na produção de ERO por neutrófilos, porém ratos diabéticos que receberam açaí não apresentaram diferença em relação ao grupo controle.

        A suplementação com açaí também reduziu a produção de ERO em neutrófilos de ratos controle. Estudos in vitro demonstraram o efeito inibidor do açaí, mesmo em doses extremamente baixas, sobre a produção de ERO induzida por H O em neutrófilos isolados de

        2

        2

        humanos saudáveis e concluíram que antioxidantes presentes no açaí são capazes de penetrar em células viáveis e protegê-las contra o dano oxidativo (Schauss et al. 2006a; Honzel et al. 2008). Porém neste trabalho foi demonstrado pela primeira vez que a suplementação com açaí reduziu significativamente a produção de ERO em neutrófilos in vivo, esses dados apontam para um possível efeito modulador do açaí sobre a produção de ERO em neutrófilos.

        No presente estudo a administração intraperitoneal de STZ efetivamente induziu o

        

      diabetes mellitus em ratos. A ação tóxica da STZ requer a sua absorção pelas células. A

        estreptozotocina é seletivamente acumulada em células beta pancreáticas através de transportadores de glicose GLUT2 de baixa afinidade na membrana plasmática (Karunanayake et al. 1976) e o mecanismo proposto para sua toxicidade é dependente de sua ação alquilante sobre o DNA, que leva a ativação da poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) e

      • consequentemente redução na concentração celular de NAD e dos estoques de ATP. A depleção dos estoques de energia celular resulta em necrose das células beta (Yamamoto et al. 1981; Lenzen 2008). Outro mecanismo proposto para a toxicidade da STZ, em células beta, se relaciona com a sua capacidade de atuar como doador de óxido nítrico intracelular (Turk et al. 1993).

        O modelo experimental de diabetes induzido por STZ pode exibir a maioria das complicações do diabetes mediadas pelo aumento no estresse oxidativo. Como esperado os ratos diabéticos apresentaram aumento significativo da glicose plasmática, redução nos níveis de insulina e níveis elevados de frutosamina, um biomarcador utilizado para determinar o grau de glicação de proteínas plasmáticas no diabetes, principalmente a albumina. Como a albumina, principal componente da frutosamina, tem meia-vida curta, cerca de vinte e um dias, o teste da frutosamina reflete o controle glicêmico neste período, e por esta razão foi o parâmetro escolhido neste trabalho já que os animais permaneceram diabéticos por 30 dias.

        O diabetes induzido por STZ também levou a uma acentuada redução do peso corporal. A perda de peso característica associada ao diabetes é devida ao aumento do catabolismo muscular (Ravi et al. 2004). Neste estudo a suplementação com a polpa de açaí não promoveu alterações no perfil glicêmico e níveis de insulina. Por outro lado, de Oliveira et al. (2010) avaliaram o efeito da administração por 12 semanas, de um extrato de sementes de açaí (300mg/Kg de peso corporal) sobre a síndrome metabólica induzida por dieta hiperlipídica em camundongos, C57BL/6J e demonstraram que este extrato foi capaz de reduzir os níveis de glicose e melhorar a resistência a insulina e a tolerância a glicose avaliada pelo teste TTOG nestes animais. Além disso, o extrato foi capaz de reduzir o peso corporal e os níveis de malondialdeído, triacilgliceróis e colesterol plasmáticos. Diante destes resultados, os autores propõem que o extrato de sementes de açaí exerce efeito protetor contra as características da síndrome metabólica e pode ser usado como uma fonte nutricional alternativa na prevenção desta patologia.

        A administração de compostos fenólicos é relatada na literatura como promissora em relação ao perfil glicêmico em modelos experimentais de diabetes, porém os resultados são divergentes, de acordo com a via de administração, modelo experimental, duração do diabetes e demais condições experimentais. Um extrato de sementes de uvas, rico em polifenóis foi capaz de reduzir os níveis de glicose plasmática em ratos com diabetes induzido por STZ após 20 dias consecutivos de tratamento por via oral. (Chis et al. 2009). No entanto a administração intraperitoneal do flavonóide quercetina por oito semanas não foi capaz de alterar a glicemia de ratos diabéticos (Dias et al. 2005).

        Embora a suplementação com açaí não tenha promovido alterações significativas no perfil glicêmico e expressão gênica em ratos diabéticos, os resultados obtidos em relação ao balanço oxidante/antioxidante indicam que o consumo de açaí pode exercer papel protetor contra as complicações do diabetes relacionadas ao estresse oxidativo.

      7. CONCLUSÃO

        Em conclusão nós demonstramos que a polpa de açaí pasteurizada e congelada apresenta alta capacidade antioxidante in vitro. Nossos resultados sugerem também uma importante capacidade antioxidante in vivo, já que a suplementação com a polpa de açaí, em ratos controle, foi capaz de modular a produção de ERO em neutrófilos, reduzir a oxidação de proteínas e aumentar o conteúdo de glutationa total no fígado destes animais.

        Em modelo experimental de diabetes induzido por estreptozotocina, a suplementação com a polpa de açaí por 30 dias não alterou o perfil glicêmico, níveis plasmáticos de insulina e tolerância a glicose, no entanto exerceu efeito protetor contra o estresse oxidativo hepático ao reduzir a peroxidação lipídica e aumentar os níveis de glutationa total.

        A melhora do balanço oxidante/antioxidante hepático, após a suplementação com açaí, em ratos controle, evidenciada pela redução de biomarcadores do estresse oxidativo e aumento do conteúdo de glutationa total pode ser devida, pelo menos em parte, a indução da expressão gênica de enzimas do sistema de defesa antioxidante sugerindo um papel na sinalização redox celular. Entretanto este efeito de indução da expressão gênica não foi observado após o consumo da polpa de açaí em ratos diabéticos.

        As propriedades antioxidantes da polpa de açaí in vivo parecem envolver mecanismos distintos, pois os efeitos observados diferiram em condição fisiológica e patológica de estresse oxidativo. Tais diferenças podem ser devidas as alterações em vias de sinalização celulares e padrões de expressão gênica relacionados ao diabetes. Desta forma, mesmo que antioxidantes exógenos, como os compostos presentes no açaí, possam apresentar benefícios em atenuar o estresse oxidativo, torna-se difícil fornecer antioxidantes em concentrações suficientes para restaurar completamente o estado redox.

        Neste trabalho foi demonstrado pela primeira vez que o consumo da polpa de açaí modula a produção de ERO por neutrófilos e a expressão gênica de enzimas antioxidantes hepáticas in vivo. Estes dados reforçam o papel do açaí como alimento funcional e os efeitos benéficos relacionados ao seu consumo.

      8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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        Anexo I. Protocolo Aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animais da UFOP.

        Anexo II. Protocolo da Dosagem de Insulina

        Kit Ultra sensitive Rat insulin Elisa Kit (Crystal Chem, Downers Grove, IL., USA) (Catálogo # 90060)

        Princípio da técnica 1° reação

        A insulina de rato na amostra é ligada ao anticorpo anti-insulina imobilizado na microplaca.

        Lavagem O material não ligado é removido através da lavagem. 2° reação

        O Anticorpo secundário conjugado a peroxidase (anti-anticorpo insulina) é ligado ao complexo insulina/anticorpo primário imobilizado na microplaca.

        Lavagem O Excesso do anticorpo conjugado é removido através da lavagem. Reação Enzimática

        O anticorpo conjugado ligado ao anticorpo primário na microplaca é detectado pela adição da solução substrato TMB

      • – 3,3',5,5' Tetrametil-benzidina.

        Preparo dos reagentes Solução estoque de insulina de rato

        Reconstitua o padrão de insulina de rato liofilizado pela adição cuidadosa de 100 µL de água destilada ou deionizada. Gentilmente agite por inversão o frasco até o conteúdo estar completamente dissolvido. Esta solução estoque contém 25,6 ng/mL de insulina de rato.

        Conjugado enzima anticorpo anti-insulina.

        Prepare o volume necessário da solução enzima anticorpo conjugado misturando 3,6 mL da solução estoqu e “enzima anticorpo conjugado” com 1,8 mL do “diluente enzima conjugado” e misture até obter uma solução homogênea e clara.

        Tampão de Lavagem

        A solução estoque tampão de lavagem deve ser adicionada a 1L de água destilada ou deionizada em um balão volumétrico. Misture bem antes do uso.

        As demais soluções são fornecidas prontas para uso:

        Solução substrato enzimático, solução de parada da reação enzimática (1N ácido sulfúrico) e diluente da amostra.

        Preparo dos padrões de trabalho de insulina de rato

        Primeiramente, pipete 150 µL do diluente da amostra e 50 µL da solução estoque de insulina (25,6ng/mL) em um microtubo de polipropileno marcado (6,4 ng/mL) e misture; Distribua 50 µL do diluente da amostra em seis tubos marcados 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,6;

        3,2 respectivamente; Pipete 50 µL do padrão 6,4 ng/mL dentro do tubo 3,2 ng/mL e misture; Pipete 50 µL do padrão 3,2 ng/mL dentro do tubo 1,6 ng/mL e misture; Repita este esquema de diluição com os tubos remanescentes; Pipete 50 µL do diluente da amostra em um tubo marcado com 0ng/mL.

        Procedimento do teste Primeira Reação

        1. Em cada poço da microplaca pipete 95 µL do diluente da amostra;

        2. Em cada poço da microplaca adicione 5µL da amostra (ou os padrões de trabalho 0; 0,1; 0,2; 0,4; 0,8; 1,6; 3,2 e 6,4 ng/ml de insulina;

        3. Cubra a microplaca com a tampa de plástico e incube por 2hs a 4°C;

        Segunda Reação

        4. Aspire o conteúdo dos poços e lave 5 vezes usando 300 µL do tampão de lavagem. Após cada lavagem remova qualquer solução remanescente por inversão e cubra a placa firmemente com um papel toalha;

        5. Adicione 100 µL do conjugado enzima anticorpo anti-insulina;

        6. Cubra a microplaca com a tampa de plástico e incube por 30 minutos a temperatura ambiente;

        Terceira Reação

        7. Aspire o conteúdo dos poços e lave 7 vezes usando 300 µL do tampão de lavagem por poço. Após cada lavagem remova qualquer solução remanescente por inversão e cubra a placa firmemente com um papel toalha;

        8. Imediatamente coloque 100 µL da solução substrato enzimático e deixe reagir por 40 minutos a temperatura ambiente. Durante a reação evite exposição da microplaca à luz;

        9. Pare a reação enzimática através da adição de 100 µL da solução de parada da reação enzimática;

        10. Determine a absorbância dentro de 30 minutos (Determine os valores A

        450

        e substraia os valores A

        630 ).

        Avaliação dos resultados

        A concentração de insulina é determinada pela interpolação usando a curva padrão gerada pela plotagem da absorbância versus a concentração correspondente do padrão de insulina de rato.

        Anexo III. Trabalho Aceito para Publicação Manuscrito entitulado:

        “Dietary açai modulates ROS production by neutrophils and gene expression of liver antioxidant enzymes in rats ”

        Periódico: Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition Submetido em: 17/12/2010 Aceite em: 22/02/2011 Autores:

        Joyce Ferreira da Costa Guerra, Cíntia Lopes de Brito Magalhães, Daniela Caldeira Costa, Marcelo Eustáquio Silva, Maria Lúcia Pedrosa.

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