UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS INSTITUTO DE QUÍMICA E BIOTECNOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA E BIOTECNOLOGIA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS

ANTONIO ALBUQUERQUE DE SOUZA

  Nada seria possível sem sua imensa capacidade de proporcionar uma segunda oportunidade de crescimento eretificação, incentivando o crescimento da pessoa humana que encontrou o caminho da ciência e, assim, a capacidade de reconhecer sua pequenez diante da inevitávelpossibilidade de errar. Antonio Aos amigos que me acompanharam desde a graduação: Alan John, amigo especial, também companheiro de estudos, e agora colega de trabalho, um grandeprivilégio; Wanessa, que mesmo longe do alcance dos olhos, não deixou de se fazer presente e prestar seu imenso apoio, oferecendo-me palavras de incentivo.

LISTA DE FIGURAS

  73 Figura 29 - Voltamogramas cíclicos da nor--lapachona e seus nitroderivados Figura 30 - a: Análise da corrente de pico (I pc1 ), para a primeira onda de redução1/2 de 1, em função de  , caracterizando o fenômeno de transporte de massa em solução. 105 Tabela 6 - Valores de potencial para os compostos 1 e 3, em eletrodo de Tabela 7 - Valores potenciais de pico catódico para a nor--lapachona e nitroquinonas em eletrodos de carbono vítreo (ECV) e mercúrio Tabela 8 - Potencias de pico para as nitroquinonas em meio aquoso/etanólico, eletrodo de carbono vítreo,  = 100 mV s .

4 VC voltametria cíclica

  VPD voltametria de pulso diferencial E diferença de potencial de pico p  velocidade de varredura de potencial. 79 3.4 Estudo da Interação da Nor--lapachona e Derivados com - ciclodextrina (-CD) ...........................................................................

1 INTRODUđấO

1.1 Considerações Gerais

  Nos seres humanos, a energia necessária à execução das funções biológicas advém de processos de oxidação/redução, em que pares redox são responsáveis Em que E é o potencial de redução da semi-célula para um dado par redox e i [espécies reduzidas] i é a concentração das espécies reduzidas em um par redox. Desta forma, vale ressaltar a importância da equação de Nernst, que permite determinar a voltagem de uma célula eletroquímica E), uma vez que a mesmaincorpora a energia de Gibbs (G) e a expressão de ação das massas (Q).

1.2 Relevância da Eletroquímica em Química Medicinal

  Modificações químicas no DNA alteram a especificidade das ligações de hidrogênio, causam a abertura de anéis de purina e osprodutos da fragmentação de pirimidinas impedem a replicação do DNA por meio de mudanças conformacionais que diminuem a eficiência das polimerases do DNA. Os parâmetros eletroquímicos normalmente obtidos epa pc redox pc + empregados são os potenciais de oxidação (E ) e redução (E ) ou E (E E )/2 (para sistemas reversíveis) ou E (para os processos ireversíveis), a pa pc – E pc/21/2  magnitude da função corrente (I p / x C) e a razão entre as correntes de picocatódico e anódico I /I .

S. O. D

  Considerando que o estresse oxidativo resulta da transferência de elétrons ao oxigênio a partir dos intermediários de redução de grupos eletroativos, comoquinona e nitro, informações valiosas sobre a cinética e a termodinâmica desses processos podem ser adquiridas pelos métodos eletroquímicos. A formação de complexos de inclusão entre ciclodextrina e compostos biologicamente ativos pode aumentar a solubilidade desses compostos,bem como a biodisponibilidade e a liberação in loco, de compostos detentores de atividade biológica (Wang et al., 2008).

1.3 Quinonas e Nitroaromáticos

  Como carreadores de elétrons nos processos de fosforilação oxidativa que ocorre na mitocôndria, a formação de ATP é termodinamicamente favorecida comoconseqüência da transferência de elétrons por quinonas e outras moléculas, a partir do NADH ou FADH 2 ao oxigênio molecular (Salas et al., 2003). A facilidade de redução observada para quinonas, Figura 11, deve-se ao fato de formarem sistemas aromáticos, onde a redução via um elétron resulta na  formação de semiquinonas (Q ) enquanto que a redução completa via dois elétrons e dois prótons gera a hidroquinona (QH 2 ).

4- OHTAM

  Estasmoléculas aceptoras podem ser outras espécies eletrogeradas ou oxigênio molecular, que é, então, reduzido ao ânion radical superóxido, gerando espéciesreativas de oxigênio e, dependendo da concentração, condições de estresse oxidativo no interior da célula. O conhecimento e estudo das propriedadeseletroquímicas das espécies que geram radicais em ciclos biológicos de oxidação e redução são essenciais para a compreensão da atividade biológica deste tipo decomposto (Souza et al., 2010).

2 N

N CH CHCH CH 2 2 O CH3

3 OH

  A ativação de nitroaromáticos pode acontecer por uma redução enzimática direta seguida de reação com oxigênio, gerando espécies reativas de oxigênio ou,alternativamente, em baixa concentração de oxigênio, por geração, após extensa redução, de espécies eletrofílicas (iminoquinometanos), Figura 18 (De Abreu et al.,2001). Fragmentação redutiva de compostos aromáticos amino ou hidroxilamino substituídos, gerando intermediário eletrofílico iminoquinometano.

2 H R R = OH ou H Fonte: De Abreu et al., 001, adaptado

  Já em meio aeróbio, o ânion radical nitro gerado no processo de redução enzimáticainterage com o oxigênio presente no meio, em uma etapa metabólica denominada 2 , que por sua vez, sofre ação de enzimas, como a superóxido dismutase, S. O conhecimento e o estudo das propriedades eletroquímicas das espécies que geram radicais em ciclosbiológicos de oxidação e redução são essenciais para a compreensão da atividade biológica destes compostos.

1.4 Biossensor Eletroquímico de DNA

  O emprego de biossensor eletroquímico de dsDNA permitiu confirmar o mecanismo de intercalação deadrimicina na dupla hélice do DNA através de seu potencial redox, cuja intensidade de corrente aumentou gradativamente com o tempo de contato do biossensor emsolução de adriamicina. Devido àgrande variedade de compostos que atuam por esse caminho, o sucesso na Neste contexto, o emprego de biossensores eletroquímicos de DNA constitui ferramenta valioso para elucidar os mecanismos biológicos de ação de fármacos oucandidatos a fármacos (Brett et al., 1997; Rauf et al., 2005; Chiorcea-Paquim et al.,2009).

1.5 Sobre Nitroquinonas

  Asatividades biológicas dos derivados substituídos com a nitroanilina (1, 2 e 3) também foram avaliadas frente a várias linhagens de células tumorais humanas,Tabela 1, bem como frente a formas tripomastigota do Trypanosoma cruzi, agente causador da Doença de Chagas, Tabela 2 (Da Silva Júnior et al., 2007; Da Silva 50 -1Tabela 1. Nesse sentido, considerando os mecanismos de ação já conhecidos para compostos quinonóides e nitroaromáticos, os quais dependem de biorredução, éesperado que compostos hidrídos (quinona e nitro) apresentem um perfil interessante no tocante ao mecanismo de ação.

2 OBJETIVOS

  Determinar através da técnica de voltametria cíclica, as constantes relacionadas a reações químicas acopladas aos processos de transferênciaheterogênea de elétrons para os compostos estudados Avaliar a possibilidade de correlação entre os potenciais de redução das substâncias com as atividades biológicas já descritas na literatura. Estudar a possibilidade interação de nitroquinonas com o DNA através da utilização de biossensor eletroquímico de DNA.

3 EXPERIMENTAL

3.1 Reagentes e Solventes

As nitroquinonas derivadas da nor--lapachona foram sintetizadas, purificadas e caracterizadas pelas técnicas espectroscópicas de Ressonância Magnética 1

13 Nuclear de H e

  C, infravermelho e espectrometria de massas. (Da Silva Júnior,2007; da Silva Júnior, 2008), Figura 27, e cordialmente cedidas pelo Prof.

3.2 Estudos Eletroquímicos

  3.2.1.1 Síntese e Purificação de TBAPPara a síntese de TBAP procedeu-se da seguinte forma: 103,69 g de brometo de tetrabutilamônio (TBABr) foram lentamente dissolvidos em 200 mL de águadestilada, sendo adicionada posteriormente à solução aquosa de TBABr, uma alíquota de 30 mL de ácido perclórico (Aldrich), resultando em suspensão branca. A contante de decaimento para uma segunda ordem é representado por k 2 , enquanto que  é a constante de tempo entre o potencial a meia altura da onda e o λ velocidade de varredura, E p,a e E p,c são os potenciais de pico catódico e anódico, respectivamente.

3.3 Estudos em Meio Prótico - Reatividade frente ao ssDNA

  Para o preparo do tampão, foram adicionados 0,471 g de fosfato de sódio monobásico (NaH 2 PO 4 ) e 0,785 g de fosfato de sódio dibásico (Na 2 HPO 4 ) em 100 mL de água. Considerando-se o ssDNA em relação ao dsDNA, este apresenta picos de oxidação com alta intensidade de corrente e o diagnóstico de possíveis interaçõesde substâncias com o ssDNA é feito pelo decréscimo dessas correntes.

2 O, dessecado e armazenado à 8ºC. Pesaram-se em

  Este condicionamento foirealizado por meio da técnica de Voltametria de Pulso Diferencial (VPD), varrendo- se uma faixa de potencial (E = 0 a +1,4 V) em velocidade de 5 mV s em um ap mínimo de três ciclos até completa estabilização da superfície eletródica(organização da dupla camada elétrica). Em seguida, foram adicionadas massas de -CD correspondentes às concentrações de 0,01, 0,1 e 1 mmol L , sendo a solução agitada e desaerada, a cada adição de -CD, por 5 minutos, para então ser realizada a medidaeletroquímica.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

  O mecanismo de ação de muitos fármacos, como quinonas e/ou nitroaromáticos é dependente de biorredução (Rauf et al., 2005). Nesse sentido, o estudo sobre o mecanismo de redução eletroquímica, a caracterização dos respectivos produtos eletrogerados e, a análise destes combiomoléculas, como o DNA, são ferramentas relevantes para o entendimento do mecanismo de ação farmacológica de moléculas detentoras de atividade biológica(Núñez-Vergara et al., 2005).

4.1 Estudos em Meio Aprótico

  O perfilvoltamétrico observado para a nor--lapachona, Figura 29a, é caracterizado por duas ondas de redução bem definidas, sendo a primeira onda catódica (Ic = -0,687V) com características de reversibilidade, conforme a presença da correspondente onda de oxidação (Ia = -0,590 V), de intensidade de corrente correspondente à ondade redução. Assim como realizado para 1 (Figura 39), foi construída a curva de trabalho entre a razão I pa /I pc e o log , que de acordo com o perfil observado, caracterizou o linear que permitiu a determinação da constante de decaimento (k 2 = 15.188 mol L s ), e de posse deste valor, determinou-se o tempo de meia vida do ânion radical (t = 0,06 s).

4.2 Estudos em Espectroeletroquímica

  Eletrodo de carbono vítreo,  = 100 mV s-1 .-2,8 -2,1 -1,4 -0,7 0,0 -50 -40 -30 -20 -101020 O O O N H NO2 IIaIIIa Ia I'cIIIcIIc Ic Nor-  -lapachona)/ 1 C o rr e n te E / V vs Ag|AgCl|Cl - 0,1 mol L -1a IIcNor--lapachona)/ 2 C o rr e n te  E / V vs Ag|AgCl|Cl - 0,1 mol L -1 Ic IIcIc Nor- -lapachona)3 C o rr e n te / E / V vs Ag|AgCl|Cl - 0,1 mol L -1 Fonte: Autor, 2011. (C-3’, C-4’, C-5’, e C-6’) e o sinal intenso de HFCC a partir da interação do el tron desemparelhado com o átomo de N da função nitroaromático, indicando que aestrutura secundária está associada à formação de um ânion radical a partir da funcão -NO 2 na posição C- 2’.

4.3 Racionalização dos Resultados em Meio Aprótico

  Em analogia ao comportamento eletroquímico observado para o precursor nor 2pIc pIIc pIIIc sendo a egunda onda com características de processo quasi-reversível, ao passo que para os derivados 1 (QPh-o-NO ) e 2 (QPh-m-NO ), o egundo pico de redução 2 2 dox (E ) se apresentou como um ombro catódico entre o primeiro e segundo pIIc processo, respectivamente. Porém, a nitroquinona 1 (QPh- o -NO ), em decorrência da posição do grupo nitro em C- 2 2’, apresenta a possibilidade de estabelecimento de ligação de hidrogênio intramolecular com o hidrogênio dogrupo amina vizinho tanto a quinona, quanto ao nitro.

4.4 Estudos em Meio Prótico

  Eletrodo de -1 carbono vítreo,  = 100 mV s .259 O ba Ia-14 O O N H NO2 IIa /   a115 E (+ 1,13 V)201  rr  e n te o te C C rr / -16 -11 / -6  C n e o -15 -3 o -993 Ic1 rr n e te105 -21 -1,3 -1,0 -0,7 -0,4 -0,1 0,2 0,5 E / V vs Ag|AgCl|Cl 0,1 mol LIIc -21 -1,3 -1,0 -0,7 -0,4 -0,1 0,2 0,5 - E / V vs Ag|AgCl|Cl 0,1 mol L - -1 -1 -5 0,0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 E / V vs Ag|AgCl|Cl 0,1 mol L -1 - Fonte: Autor, 2011. Eletrodo -1 de carbono vítreo,  = 100 mV s .7 O O320b a HO N NO2 Ia I'cIIa 0,062 V153 Ia (+ 1,06 V) 10 C o C o e te / rr n -14 -7 /   n e rr C te -14 -77 Ic e  / te n o rr5 -21 -1,6 -0,9 -0,2 0,5 0,0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 E / V Vs Ag|AgCl|Cl 0,1 mol LIIc - -1 -21 -1,6 -0,9 -0,2 0,5 E / V Vs Ag|AgCl|Cl 0,1 mol L -1 - -5 E / V Vs Ag|AgCl|Cl 0,1 mol L - -1 Fonte: Autor, 2011.

4.5 Estudos em Presença de Oxigênio

  Iaa15 -55  / e o C rr n te -25 -15 a a -45 -35 -1,6 -1,3 -1,0 -0,7 -0,4 -0,1 0,2 E / V vs Ag|AgCl|Cl 0,1 mol L Ic e -1 - Em presença de oxigênio, o potencial de redução da quinona (E pc1 = -0,685 V) sofre um deslocamento de 30 mV para valores mais negativos (E pc1 = -0,715 V). O processo de redução variou para valores maiscatódicos, havendo um deslocamento de 50 mV em concentração de oxigênio igual 0,070 mmol L e, a partir desta concentração também não mais foi observado aumento da intensidade de corrente de pico para o processo redox.

b: Curva de I pc1 / I pa1 em função da concentração de oxigênio

  A partir da curva de trabalho, Figura 65b, para as correntes de pico em várias concentrações de oxigênio, a constante de associação entre as espécieseletrogeradas após redução de 2 em presença de O foi obtida, sendo esta igual a 2 a corrente de pico em concentração de oxigênio igual a 0,234 mmol L . A partir da curva de corrente de pico em função da concentração de oxigênio, Figura 66b, De acordo com os resultados obtidos por método eletroquímico, fica evidenciado que os ânions radicais formados a partir da nor--lapachona e de seusderivados nitroquinonas, interagem com oxigênio em mecanismo eletroquímico- químico (EC) regenerando o grupo quinona, equação 29.

4.6 Estudos em Biossensor de dsDNA

  dsDNAa5,05 3,5 + 1,01 V CV - 1 (0,05 mmol L ) dsDNA dsDNA + 1 (0,05 mmol L ) -1 -1 + 1,06 V adenosina + 1,31 V b -14 + 0,05 V hidroxilamina + 1,07 V CV - 1 (0,05 mmol L ) dsDNA + 1 (0,05 mmol L ) -1 adenosina + 1,31 V   guanosina guanosina + 1 n o te e rr / C 2,0  / rr o e C n te32 + 0,35 V 8-oxo-guanina + 0,62 V Azoxi 0,5 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 E / V vs Ag|AgCl|Cl 0.1 mol L - -11 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 E / V vs Ag|AgCl|Cl 0.1 mol L -1 - + 1,07 V Fonte: Autor, 2011. Quando o mesmo tratamento foiaplicado ao biossensor de dsDNA em presença de 1 (Figura 67b, vermelho), foram observados os picos referentes aos derivados nitroso e azoxi, contudo, o pico deoxidação do grupo amino em +1,07 V, apresentou-se mais alargado e de maior intensidade de corrente, caracterizando a presença de um processo redox adicional.

3. Nos voltamogramas de pulso diferencial representados na Figura 68a (vermelho

  2,2b 2,2 dsDNA a1,8 1,4 dsDNA 2 (1 x 10 mol L ) 2 (2 x 10 mol L ) 2 (5 x 10 mol L ) -6 -1 1,8 -5 -1 -5 -1 guansosina + 2 + 1,28 V -1 adenosina 1,4 dsDNA + 2 (0,02 mmol L ) CV 2 (0,02 mmol L ) -1 Ia adenosina  guanosina rr n  o e te C / 0,6 1,0 + 1,04 V) o rr n te / e C 0,2 1,0 0,6 -0,2 0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 E / V vs Ag|AgCl|Cl 0,1 mol L -1 E / V vs Ag|AgCl|Cl 0.1 mol L - -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 - -1 Fonte: Autor, 2011. Eletrodo de carbono vítreo, -1 = 5 mV s .5 dsDNA + 3 (0,05 mmol L ) dsDNA -1 4,0bCV - 3 (0,05 mmol L ) -1a3,2 ECV + 3 (0,05 mmol L ) dsDNA + 3 (0,05 mmol L ) dsDNA -1 -14 + 0,17 V hidroxilamina 3 te e rr / o n C  2,4 1,6 + 0,97 V + 1,08 V / C te + 1,08 V o rr n e + 1,00 V12 0,0 0,8 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 E / V vs Ag|AgCl|Cl 0,1 mol L -1 E / V vs Ag|AgCl|Cl 0,1 mol L - 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 -1 - Fonte: Autor, 2011.

4.7 Estudos em ssDNA

  Eletrodo de carbono vítreo,  = 10 mV s .151,02b a)11 ssDNA s D N A 0,86 0,94 Adenina Guanina  e (+ C te + 0,92 V n rr o37/ I s I s sA 1 D N 0,70 0,78 -1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 E / V vs Ag|AgCl|Cl 0,1 mol L -1 -1 - 0,62 -0,01 0,01 0,01 0,03 0,04 0,05 0,06 [2] / mmol L Um decréscimo de 30% foi observado para a primeira onda de oxidação, enquanto que a segunda onda anódica decaiu 24%, Figura 74b. Devido à maior solubilidade de 2 em meio aquoso-etanólico, os processos redox se apresentam mais definidos,sendo, possível observar maior facilidade de redução para o segundo processo em presença de -CD, constatando-se um deslocamento anódico de potencial de 30mV, Figura 82a (preto e vermelho).

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