Produção de lipases e biossurfactantes por bactérias isoladas de um solo contaminado com óleo vegetal.

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LAÍS CAMPOS TEIXEIRA DE CARVALHO PRODUÇÃO DE LIPASES E BIOSSURFACTANTES POR BACTÉRIAS ISOLADAS DE UM SOLO CONTAMINADO COM ÓLEO VEGETAL RESIDUAL UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA NATUREZA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR JOÃO PESSOA - PB 2012 LAÍS CAMPOS TEIXEIRA DE CARVALHO PRODUÇÃO DE LIPASES E BIOSSURFACTANTES POR BACTÉRIAS ISOLADAS DE UM SOLO CONTAMINADO COM ÓLEO VEGETAL RESIDUAL Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular do Centro de Ciências Exatas e da Natureza, da Universidade Federal da Paraíba, como parte dos requisitos para a obtenção do título de MESTRE EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR. Orientadora: Prof. Dra. Krystyna Gorlach Lira JOÃO PESSOA - PB 2012 C331p Carvalho, Laís Campos Teixeira de. Produção de lipases e biossurfactantes por bactérias isoladas de um solo contaminado com óleo vegetal / Laís Campos Teixeira de Carvalho.-- João Pessoa, 2012. 137f. : il. Orientadora: Krystyna Gorlach Lira Dissertação (Mestrado) – UFPB/CCEN 1. Biologia Celular e Molecular. 2. Bactérias. 3. Lipases. Biossurfactantes. 5. Solo. 4. LAÍS CAMPOS TEIXEIRA DE CARVALHO Dissertação de mestrado avaliada em: ______/______/______ BANCA EXAMINADORA ___________________________________ Prof. Dra. Krystyna Gorlach Lira (Orientadora) Depto. Biologia Molecular / CCEN / UFPB – Campus I _________________________________________ Prof. Dra. Márcia Rosa de Oliveira (Membro interno) Depto. Biologia Molecular / CCEN / UFPB – Campus I ________________________________________ Profa. Dra. Beatriz Susana Ovruski de Ceballos (Membro externo) Depto. Biologia / CCBBS / UEPB ________________________________________ Profa. Dra. Zelia Braz Vieira da Silva Pontes (Suplente) Depto. De Ciências Farmacêuticas / CCS / UFPB Dedico este trabalho ao meus pais e ao meu irmão que sempre me apoiaram e encorajaram para que esta vitória fosse conquistada. “Não é o que você faz, mas quanto amor você dedica no que faz que realmente importa.” Madre Tereza de Calcutá AGRADECIMENTOS À Deus pela vida, saúde e oportunidade de mais uma conquista. Aos meus pais pelo amor incondicional, carinho, dedicação, ensinamentos, apoio, confiança e encorajamento durante todos os momentos da minha vida. Amo vocês. Ao meu irmão Bruno pelo amor, amizade, sintonia, momentos de diversão e boas gargalhadas a mim proporcionadas. À minha maravilhosa e excelente orientadora, além de amiga, Krystyna Gorlach Lira, que tornou possível a concretização desse projeto. Muito obrigada pela amizade, paciência, confiança e orientação durante toda a graduação e todo o mestrado. “Sto Lat, sto lat” À família Biomicro como um todo: Gilmara, Daianne, Tcris, Itácio, Mayanna, Luana, Rosiene, Lídia, Giuseppe, Dona Alda e Thiago. Em especial a Gilmara (nunca me esquecerei dos nossos maravilhosos momentos juntas), a Dainanne, amiga que tanto me ajudou nas titulações; e a TCris e Itácio que sempre se mostraram disponíveis a me ajudar nos momentos de “desespero molecular”. Aos amigos da turma “Eternos Feras”, em especial Yara, Max, Bruno, Thalita, Anderson e Francianne que sempre me proporcionaram muitos momentos de alegria durante todos os nossos anos de amizade. Nunca esquecerei cada um de vocês. Aos colegas guerreiros da primeira turma da Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular da UFPB. A todos os professores da Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular que contribuíram para minha formação. Aos colegas e funcionários do Departamento de Biologia Molecular e do Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. À CAPES pelo apoio financeiro. A todos aqueles que, mesmo não tendo sido mencionados, contribuíram para a concretização de mais uma importante etapa da minha vida. Muito obrigada, Laís Campos. RESUMO As lipases e os biossurfactantes produzidos por microrganismos estão envolvidos no metabolismo de substratos oleosos e despertam grande interesse biotecnológico. Neste trabalho foi analisada a produção de lipases e biossurfactantes por bactérias isoladas de um solo utilizado para descarte do óleo vegetal residual. As 66 linhagens isoladas demonstraram atividade lipolítica quando incubadas no meio ágar tributirina. No meio contendo ágar rodamina B, com azeite de oliva ou óleo de soja, o número de linhagens lipolíticas variou de 31,8% a 37,8%, dependendo do substrato e do pH do meio. Atividade lipolítica das 25 linhagens positivas no ágar rodamina B com azeite de oliva, avaliada pelo método titulométrico, variou de 0,62 U/mL/min a 12,4 U/mL/min. A linhagem mais ativa na produção de lipases foi identificada, com o seqüenciamento do gene 16S rRNA, como espécie do complexo Burkholderia cepacia, e submetida à análise da Metodologia de Superfície de Resposta, para determinar as condições ótimas de pH e temperatura. A linhagem Burkholderia sp. O19 apresentou alta atividade lipolítica em ampla faixa de pH e temperatura, sendo que a maior atividade foi prevista para pH e temperatura superiores a 8,5 e 65oC. Todas as linhagens demonstraram produzir biossurfactantes com pelo menos um dos três métodos avaliados. O teste de dispersão do óleo diesel permitiu a detecção de biossurfactantes em todas as linhagens, enquanto a emulsificação e atividade hemolítica foram observadas em 73% e 59% das linhagens, respectivamente. O solo usado para o descarte de óleo vegetal mostrou-se propício à prospecção de microrganismos lipolíticos e produtores de biossurfactantes. Palavras-chave: Bactéria. Lipases. Biossurfactantes. Solo. PRODUCTION OF LIPASES AND BIOSURFACTANTS BY BACTERIA ISOLATED FROM SOIL CONTAMINATED WITH RESIDUAL VEGETAL OIL ABSTRACT The lipases and biosurfactants produced by microorganisms are involved in the metabolism of oil substrates and they receive great biotechnological interest. In this work the production of lipases and biosurfactants by bacteria isolated from soil used for discard of the residual vegetable oil was analyzed. The 66 strains tested demonstrated lipolytic activity on the tributirine agar. In the rhodamine B agar medium with olive oil or soy oil, the number of lipolytic strains varied from 31,8% to 37,8%, depending on the substrate and medium pH. Lipolytic activity of the 25 positive strains in the rhodamine B agar with olive oil, analyzed by titrimetric method varied from 0.62 U/mL/min to 12.4 U/mL/min. The most active strain in the lipases production, identified as the species belonging to the Burkholderia cepacia complex by 16S rRNA gene sequencing analysis, was submitted to the Surface Respond Methodology analysis to determine the optimal conditions of pH and temperature. The Burkholderia sp. O19 strain showed high lipolytic activity in wide range of pH and temperature, and the highest activity was predicted for pH and temperature above 8.5 and 65oC. All of the bacterial strains showed to produce biosurfactants in at least one of the three analyzed methods. The test of dispersion of the diesel oil allowed the biosurfactants detection in all of the strains, while the oil emulsification and hemolytic activity were observed in 73% and 59% of the strains, respectively. The soil used for the disposal of vegetable oil proved conducive to prospecting of lipolytic microorganisms and producers biosurfactants. Keywords: Soil. Bacteria. Lipases. Biosurfactants. LISTA DE ABREVIATURAS AL: Meio para Actinomicetos Lipolíticos ARDRA: Análise de restrição do rDNA amplificado BL: Meio para Bactérias Lipolíticas BLAST: Basic Local Alignment Search Tool CTAB: Brometo de Cetil-trimetil-amônio DNA: Ácido desoxirribonucléico E5: Índice de Emulsificação após 5 minutos E24: Índice de Emulsificação após 24 horas NCBI: National Center for Biotechnology Information NB: Caldo Nutriente PCR: Reação em cadeia da polimerase q.s.p = Quantidade suficiente para RNA: Ácido ribonucléico 16S rRNA: Ácido ribonucléico ribossômico da subunidade 16S SDS: Dodecil sulfato de sódio TAE: Tris-acetato-EDTA Taq polimerase: DNA polimerase isolada de Thermus aquaticus TSA: Caldo Triptico de Soja UFC: Unidades formadoras de colônia LISTA DE FIGURAS Figura 01 – Reação geral de hidrólise de um triacilglicerol......................................................... 21 Figura 02 – Reações catalisadas por lipases...................................................................................... 22 Figura 03 – Modelo estrutural das α/β hidrolases........................................................................ 23 Figura 04 – Monorramnolipídeo ............................................................................................... 33 Figura 05 – Dirramnolipídeo .....................................................................................................34 Figura 06 – Diagrama de blocos interligando os fatores às respostas.............................................41 Figura 07 – Coleta da amostra de solo utilizado para descarte do óleo vegetal residual...................47 Figura 08 – Fotomicrografia das células da linhagem O1 (Biotipo A)...........................................63 Figura 09 – Fotomicrografia das células da linhagem O23 (Biotipo F) .............................................63 Figura 10 – Fotomicrografia das células da linhagem O28 (Biotipo E)............................................. 63 Figura 11 – Fotomicrografia das células da linhagem O16 (Biotipo A)........................................ 63 Figura 12 – Cultura das linhagens O2, O4 e O5 no meio ágar tributirina ........................................64 Figura 13 – Cultura das linhagens bacterianas no meio contendo azeite de oliva e rodamina B em pH 7,0..............................................................................................................................................67 Figura 14 – Percentual de linhagens bacterianas que apresentaram atividade lipolítica em meios com rodamina B e azeite de oliva ou óleo de soja, em diferentes pHs.................................................... 67 Figura 15 – Atividade lipolítica total das bactérias no meio caldo nutriente (NB) e meio mineral (MM) com diferentes substratos......................................................................................................... 73 Figura 16 - Atividade lipolítica específica das bactérias no meio caldo nutriente (NB) e meio mineral (MM) com diferentes substratos..........................................................................................................73 Figura 17 - Gráfico de Pareto para vários efeitos da variável atividade lipolítica total da linhagem O19............................................................................................................................76 Figura 18 – Superfície de resposta para atividade lipolítica total da linhagem O19...........................77 Figura 19 – Curvas de nível para a atividade lipolítica total da linhagem O19...................................77 Figura 20 - Amplificação do gene rDNA 16S das linhagens bacterianas selecionadas.......................78 Figura 21 - Padrões de restrição de rDNA 16S (ARDRA) das bactérias............................................. 79 Figura 22 - Emulsificação do óleo diesel pelas cultura bacteriana ................................................81 Figura 23 – Teste da atividade hemolítica das bactérias......................................................................87 Figura 24 – Análise da produção de ramnolipídeos.............................................................................90 LISTA DE TABELAS Tabela 01 – Microrganismos produtores de lipases............................................................................26 Tabela 02 – Níveis das variáveis utilizadas no experimento quanto ao efeito da temperatura e do pH sobre a atividade lipolítica......................................................................................................................53 Tabela 03 – Valores reais e respectivos valores codificados para as variáveis (temperatura e pH) ...54 Tabela 04 - Parâmetros físico-químicos do solo tratado com óleo vegetal residual e do solo não tratado, da área experimental (Jacarapé, PB)..........................................................................................61 Tabela 05 – Contagem de bactérias nos meios para bactérias totais (TSA), bactérias lipolíticas (BL) e actinomicetos lipolíticos (AL) do solo contaminado com óleo vegetal residual....................................61 Tabela 06 – Biotipos das linhagens bacterianas isoladas do solo contaminado com óleo vegetal residual ...................................................................................................................................................62 Tabela 07 – Atividade lipolítica das linhagens bacterianas no meio ágar tributirina após 48 e 96 horas de crescimento........................................................................................................................................65 Tabela 08 – Atividade lipolítica das linhagens bacterianas analisadas no meio de cultura contendo rodamina B e azeite de oliva ou óleo de soja em diferentes pHs............................................................68 Tabela 09 – Atividade lipolítica total e específica, biomassa e proteínas totais de linhagens bacterianas cultivadas no meio NB com azeite de oliva.........................................................................71 Tabela 10 – Atividade lipolítica total e específica, biomassa e proteínas totais de linhagens bacterianas cultivadas no meio NB com óleo de soja.............................................................................72 Tabela 11 – Atividade lipolítica total e específica, biomassa e proteínas totais de linhagens bacterianas cultivadas no meio mineral com azeite de oliva e glicerol..................................................72 Tabela 12 – Atividade lipolítica total e específica, biomassa e proteínas totais de linhagens bacterianas cultivadas no meio mineral com azeite de oliva e glicose...................................................72 Tabela 13 – Resultados obtidos pela análise da atividade lipolítica total, da linhagem O19, através do planejamento experimental.....................................................................................................................74 Tabela 14 – Coeficiente de determinação do modelo polinomial e valor p dos efeitos lineares e quadráticos e a interação da temperatura e do pH para a variável atividade lipolítica total...................76 Tabela 15 - Resultados das comparações das sequências parciais do gene rRNA 16S com as sequências depositadas no GenBank, utilizando o programa Blastn (refseq_rna).................................80 Tabela 16 - Emulsificação do óleo diesel pela cultura e pelo sobrenadante livre de células das 66 linhagens bacterianas..............................................................................................................................83 Tabela 17 – Dispersão do óleo diesel pela cultura e pelo sobrenadante livre de células das 66 linhagens bacterianas..............................................................................................................................85 Tabela 18 – Atividade hemolítica das linhagens bacterianas analisadas no meio ágar sangue após 48 e 96 horas de crescimento.......................................................................................................................88 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO...................................................................................................................18 1.1 Os microrganismos do solo e a biotecnologia.................................................................18 1.2 Lipases ..............................................................................................................................20 1.2.1 Aspectos gerais das lipases.............................................................................................20 1.2.2 Características estruturais das lipases..............................................................................22 1.2.3 Produção de lipases por microrganismos.........................................................................24 1.2.4 Fatores que influenciam a produção de lipases...............................................................27 1.2.5 Aplicações das lipases .....................................................................................................29 1.3 Biossurfactantes ...............................................................................................................30 1.3.1 Aspectos gerais dos biossurfactantes .............................................................................30 1.3.2 Biossurfactantes: classificação e organismos produtores................................................31 1.3.3 Ramnolipídeos ................................................................................................................33 1.3.4 Fatores que influenciam a produção de biossurfactantes ...............................................35 1.3.5 Aplicação dos biossurfactantes ...................................................................................... 37 1.4 Métodos de caracterização de microrganismos ............................................................39 1.5 Planejamento experimental e otimização dos experimentos ........................................41 1.5.1 Planejamento fatorial em dois níveis ..............................................................................42 1.5.2 Metodologia de Superfície de Resposta .........................................................................42 2 OBJETIVOS ..................................................................................................................... 45 2.1 Objetivo Geral................................................................................................................ 45 2.2 Objetivos Específicos .................................................................................................... 45 3 MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................................47 3.1 Área de estudo e coleta da amostra................................................................................47 3.2 Caracterização físico-química do solo ..........................................................................47 3.3 Processamento do solo e contagem dos microrganismos ...........................................48 3.4 Isolamento e purificação dos microrganismos ............................................................48 3.5 Caracterização Morfofisiológica das Bactérias ...........................................................49 3.5.1 Coloração de Gram .......................................................................................................49 3.5.3 Presença de endosporos ................................................................................................49 3.5.3 Prova de catalase ..........................................................................................................50 3.6 Análise da atividade lipolítica de bactérias ....................................................................50 3.6.1 Produção de lipases no meio sólido (análise quantitativa) ........................................50 3.6.1.1 Teste no meio sólido com tributirina ...........................................................................50 3.6.1.2 Teste no meio sólido com rodamina B ........................................................................50 3.6.2 Produção de lipases no meio líquido (análise quantitativa) ............................................50 3.6.2.1 Cultivo das bactérias ....................................................................................................51 3.6.2.2 Dosagem de proteínas ................................................................................................. 51 3.6.2.3 Determinação da biomassa (massa celular seca) ........................................................ 51 3.6.2.4 Quantificação da atividade lipolítica pelo método titulométrico ................................ 51 3.6.3 Efeito do pH e da temperatura na atividade lipolítica analisado pela Metodologia de Superfície de Resposta .............................................................................................................52 3.7 Análise de produção de biossurfactantes por bactérias ...............................................54 3.7.1 Teste de emulsificação.................................................................................................... 54 3.7.2 Método de dispersão do óleo diesel.................................................................................55 3.7.3 Atividade hemolítica....................................................................................................... 55 3.7.4 Seleção de linhagens produtoras de ramnolipídeos.........................................................55 3.8 Caracterização molecular das linhagens bacterianas....................................................56 3.8.1 Extração do DNA bacteriano ..........................................................................................56 3.8.2 Quantificação do DNA ....................................................................................................56 3.8.3 Amplificação do rDNA 16S.............................................................................................56 3.8.4 Análise de restrição do rDNA 16S amplificado ..............................................................57 3.8.5 Purificação e sequenciamento rDNA 16S........................................................................57 3.9 Processamento e análise de dados ...................................................................................58 4 RESULTADOS ...................................................................................................................61 4.1 Características físico-químicas e microbiológicas do solo ............................................61 4.2 Caracterização Morfofisiológica das Bactérias .............................................................62 4.3 Atividade lipolítica de bactérias .....................................................................................63 4.3.1 Análise qualitativa da produção de lipases .....................................................................63 4.3.2 Análise quantitativa da produção de lipases ...................................................................70 4.3.3 Efeito do pH e da temperatura na atividade lipolítica total através da Metodologia de Superfície de Resposta ............................................................................................................74 4.4 Caracterização molecular das linhagens bacterianas mais ativas na produção de lipases ......................................................................................................................................78 4.4.1 Amplificação do rDNA 16S pela técnica de PCR .........................................................78 4.4.2 Padrões de restrição do rDNA 16S ................................................................................78 4.4.3 Análise das sequências de rDNA 16S das linhagens bacterianas O19 e O23 ............... 80 4.5 Análise da produção de biossurfactantes ...................................................................... 81 4.5.1 Atividade emulsificante das bactérias ............................................................................ 81 4.5.2 Análise de dispersão do óleo diesel ............................................................................... 82 4.5.3 Atividade hemolítica das bactérias .................................................................................87 4.5.4 Produção de ramnolipídeos .............................................................................................90 5 DISCUSSÃO .......................................................................................................................92 6 CONCLUSÕES .................................................................................................................102 REFERÊNCIAS ...................................................................................................................104 ANEXOS ...............................................................................................................................135 INTRODUÇÃO 1 INTRODUÇÃO 1.1 Os microrganismos do solo e a biotecnologia O solo é um recurso natural renovável, constituído de partículas minerais e orgânicas, distribuídas em horizontes de profundidade variável, resultante da ação conjunta de agentes intempéricos sobre as rochas. Por se apresentar como fonte de nutrientes e minerais para numerosos seres vivos, ele tem servido de depósito para diversos microrganismos e tem sido utilizado para isolar e explorar os mesmos, para fins biotecnológicos (DUBEY et al., 2006). A diversidade de microrganismos no solo é tão vasta quanto desconhecida. Um grama de solo pode conter 10 bilhões de microrganismos, com milhares de espécies (ROSSELÓMORA; AMANN, 2001). O número de espécies microbianas identificadas cresce a cada ano, tendo sido descritos mais de 47.000 fungos, 30.000 protozoários, 26.000 algas, 5.000 bactérias e 1.000 vírus (ROSSELÓ-MORA; AMANN, 2001; WILSON, 1988). Segundo Lewisohn et al. (2002), estima-se que no Brasil existam entre 300 a 450 diferentes espécies de bactérias do solo descritas e conhecidas, enquanto no restante do mundo esse número passa para cerca de 4200. Devido à vasta diversidade, às grandes populações e à longa história evolutiva, os microrganismos vêm contribuindo fortemente com a riqueza e complexidade das interações entre os organismos do solo, incluindo desde simbioses altamente específicas a mutualismos difusos (BEARE et al., 1995). Tais microrganismos são componentes essenciais no processo de decomposição do solo, no qual resíduos orgânicos de plantas e animais são degradados, liberando nutrientes nas cadeias alimentares. Graças à presença de populações microbianas capazes de degradar compostos orgânicos presentes em seu meio, o solo não é apenas capaz de transformar ou degradar produtos naturais, mas produtos xenobióticos recalcitrantes também. Desta forma, ele tem sido visto como uma rica fonte de microrganismos e genes envolvidos na transformação de numerosos produtos orgânicos. Além do mais, os microrganismos passam a ser visados como fontes de enzimas específicas para realização de biotransformações tanto para processos de biorremediação quanto para biotecnologia industrial em geral (HOSTER et al., 2004). O termo biotecnologia refere-se, de um modo geral, à utilização de organismos vivos (ou partes de organismos), com a finalidade de produzir ou modificar produtos (ALBAGLI, 1998). Baseada na busca e descoberta de recursos biológicos industrialmente exploráveis, a biotecnologia é considerada uma tecnologia robusta, confiável e de baixo risco, capaz de ser implementada em grande escala por uma ampla gama de setores industriais. Também é considerada uma das tecnologias-chave para o desenvolvimento no século XXI, pois apresenta um forte impacto nos principais problemas globais (doenças, desnutrição, poluição ambiental) e apresenta uma forma de atingir processos industriais sustentáveis (uso de recursos renováveis, processos e produtos limpos e melhora de problemas como o aquecimento global) (BULL, et al., 2000). A exploração e a manipulação da natureza e de seus recursos vêm servindo como fonte para experimentação da ciência e da tecnologia avançada, dando origem à fabricação de produtos de alta sofisticação e de elevado valor agregado no mercado mundial (ALBAGLI, 1998). Na nova era da industrialização global, muitas indústrias tradicionais estão enfatizando um redirecionamento para o surgimento de novas tecnologias. Preocupações ambientais têm orientado a seleção de produtos pouco tóxicos ao ambiente e que apresentem alta biodegradabilidade (MULLER et al., 1997). Grande parte da produção mundial de óleos e gorduras, derivada de plantas, é utilizada na fabricação de diversos produtos. Em muitos países, grandes quantidades de óleos usados são geradas pelas indústrias como sebos, óleos de origem marinha e óleos de fritura, e sua eliminação tem se tornado um problema crescente, o que aumenta o interesse da sua utilização em transformações microbianas e o seu envolvimento como substrato econômico (CAMEOTRA; MAKKAR, 1998). A reutilização de óleos vegetais residuais, de processos de frituras de alimentos, tem se mostrado atraente por favorecer transformações microbianas (MITTELBACH, 1992). Levando em consideração que as questões de economia são muitas vezes o gargalo de processos biotecnológicos, fica cada vez mais evidente que o uso de resíduos oleosos domésticos ou industriais deve ser visualizado como um meio para selecionar microrganismos capazes de produzir moléculas biotecnologicamente ativas ou para aumentar a produção destas (CAMEOTRA; MAKKAR, 1998). Os benefícios econômicos e estratégicos que os microrganismos, potencialmente exploráveis, têm dado para o desenvolvimento de biotecnologias abrangem diversas aplicações como: produção de compostos químicos (etanol, ácido acético, biogás, plásticos biodegradáveis, bioconversões na indústria de alimentos e farmacêutica), produtos para agricultura (bioinseticidas, inoculantes agrícolas), enzimas para diversos setores industriais, com destaque para a indústria de detergentes e alimentícia (lipases, proteases, amilases) e compostos de interesse médico e veterinário (antibióticos, antitumorais, hipocolesterolêmicos, imunossupressores, inibidores enzimáticos, antiparasitários) (BARNUM, 1998; CANHOS; MANFIO, 2002). O estudo e caracterização da biodiversidade existente podem garantir uma ampla base de subsídios para o desenvolvimento de novas tecnologias. O Brasil, sendo considerado um dos doze países com mega diversidade, concentrando cerca de 70% da diversidade biológica do planeta (COMCIÊNCIA, 2001), poderá garantir uma posição de vanguarda no desenvolvimento dessas tecnologias dependendo, portanto, de investimentos nessa área. 1.2 Lipases 1.2.1 Aspectos gerais das lipases De acordo com a reação catalisada, as enzimas são classificadas e codificadas pela NC-IUBMB (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology). A nomenclatura utiliza a abreviação E.C. (Enzyme Comission) seguida de até quatro dígitos referentes à classe e subclasses a que pertence à enzima (MARTINELLE et al., 1995). Lipase é um nome genérico dado as enzimas que pertencem à classe das hidrolases (E.C.3.1) e que atuam sobre as ligações éster (E.C.3.1.1). Elas agem na interface óleo-água catalisando a hidrólise de ligações éster-carboxílicas de acilgliceróis para liberar ácidos graxos e glicerol, sendo conhecidas como triacilglicerol acil hidrolases (E.C.3.1.1.3) (Figura 01) (JAEGER; REETZ, 1998; SHARMA et al., 2001). Figura 01 - Reação geral de hidrólise de um triacilglicerol. Triglicerol Glicerol Ácido graxo Fonte: Jaeger e Reetz, 1998 Além de promover a hidrólise dos triglicerídeos, as lipases também catalisam reações de esterificação, interesterificação, acidólise, alcóolise, aminólise e lactonização. Isso ocorre quando a quantidade de água do sistema em que tais enzimas estão presentes é suficientemente baixa, a ponto de deslocar o equilíbrio termodinâmico no sentido da síntese (Figura 02) (CASTRO et al., 2006; JOSEPH et al., 2008; PAQUES; MACEDO, 2006). As lipases podem ser diferenciadas das esterases (E.C.3.1.1.1) por atuarem na presença de substratos insolúveis em água e emulsionados, ou seja, na presença de uma interface lipídeo/água, agindo sobre triglicerídeos com longas cadeias de ácidos graxos (com mais de dez átomos de carbono). As esterases, ao contrário, exercem sua função hidrolítica sobre substratos solúveis em água, hidrolisando, preferencialmente, ésteres “simples” e triglicerídeos de cadeia curta (com até seis átomos de carbono). Além do mais, para uma enzima lipolítica ser considerada uma “verdadeira” lipase, ela deve apresentar uma proteína que cubra o sítio ativo da enzima, a qual é chamada de “lid” e que está diretamente relacionada à atividade da mesma (BORNSCHEUER, 2002). Figura 02 - Reações catalisadas por lipases. Fonte: Paques e Macedo, 2006. 1.2.2 Características estruturais das lipases As lipases têm sido relatadas como proteínas monoméricas com peso molecular entre ~19 kDa (lipase de Bacillus subtillis) e ~97 kDa (lipase de Aeromonas sobria), embora tenhase observado uma lipase de alto peso molecular produzida por Candida deformans (207 kDa) (CYGLER e SCHRAG, 1997). O agrupamento de proteínas em diferentes níveis hierárquicos como classe, dobra, superfamília e família, compondo uma base de dados, foi desenvolvida por Murzin et al. (1995), SCOP – Structure Classification of Protein (Classificação Estrutural de Proteínas). No nível de classe, as diferentes proteínas podem ser agrupadas, conforme a estrutura secundária, em cinco tipos distintos: (1) totalmente alfa – proteínas cuja estrutura é formada essencialmente por α - hélices; (2) totalmente beta – proteínas cuja estrutura é formada essencialmente por folhas-β; (3) alfa e beta – para proteínas com α-hélices e folhas-β amplamente intercaladas; (4) alfa mais beta – para aquelas em que as α-hélices e as folhas β são amplamente segregadas (ausência de β – α – β); (5) multidomínio – para aquelas com domínios de diferentes dobras e para as quais não haja ocorrência de homólogos conhecidos). A estrutural tridimensional de todas as lipases descritas, seja de eucarioto como de procarioto, é do tipo α/β hidrolase (OLLIS, 1992) (Figura 03). Este tipo de estrutura apresenta um núcleo central composto por folhas-β paralelas rodeadas por porções em α-hélice. As folhas-β têm orientação para a esquerda e a primeira e a última folha possuem um ângulo de aproximadamente 90º entre si (POUDEROYEN et al., 2001). Figura 03 – Modelo estrutural das α/β hidrolases. Folhas-β (1-8) estão representadas como setas azuis; α-hélices (A-F) como bastões vermelhos. Os círculos vermelhos indicam a posição relativa dos aminoácidos da tríade catalítica. Fonte: Bornscheuer, 2002. Embora as lipases se diferenciem amplamente no número de aminoácidos da sequência primária, todas elas apresentam uma tríade catalítica composta por Ser-Asp-His (Glu em vez de Asp, em alguns casos) (BORNSCHEUER, 2002). A maioria das lipases apresenta um domínio hidrofóbico (lid), ou seja, uma hélice que cobre o sítio ativo das lipases, a qual é formada pela tríade catalítica Ser-Aps-His. Na presença de uma concentração mínima de substrato (na forma de micela, filme adsorvido monomolecular ou emulsão), o lid se desloca, alterando a forma fechada da enzima para a forma aberta (na maioria das lipases), expondo-se ao solvente, tornando o sítio ativo acessível para ligação do substrato e facilitando a ligação da lipase à interface (ANGKAWIDJAJA; KANAYA, 2006; NARDINI; DIJKSTRA, 1999). Neste momento, ocorre ativação interfacial modificando as propriedades funcionais da lipase. Esta interação da área que rodeia o sítio ativo com superfícies hidrofóbicas, modificando propriedades funcionais da lipase, chama-se ativação interfacial (JAEGER e REETZ, 1998; PLEISS et al., 1998). 1.2.3 Produção de lipases por microrganismos Na natureza, as lipases são produzidas por animais, vegetais e microrganismos. Dentre estes, grandes variedades de bactérias, fungos e leveduras têm sido relatadas como potenciais produtores de lipases, sendo principalmente isolados de solos contaminados com óleo, resíduos industriais ou alimentos em deterioração (Tabela 01) (ABADA, 2008; KULKARNI;GADRE, 2002; RAPP;BACKHAUS, 1992; SZTAJER et al., 1988). As lipases microbianas são mais visadas que aquelas de origem vegetal e animal. Isto se justifica pelo fato das mesmas apresentarem boa estabilidade, alta conversão de substrato em produto, ampla faixa de atuação em diferentes temperaturas e pHs, e por serem produzidas, em sua grande maioria, extracelularmente, facilitando sua obtenção. Além do mais, muitos microrganismos podem ser manipulados geneticamente com maior facilidade e ser cultivados em meios de cultivo mais baratos (HASAN et al., 2006; HORSHANI et al., 2009; KUMAR et al., 2005; SHARMA et al., 2001). Devido as suas propriedades enzimáticas, como especificidade, estabilidade, temperatura e pH de atuação, ou habilidade para catalisar reações de síntese na presença de solventes orgânicos, as enzimas microbianas têm se destacado como as mais interessantes, apresentando ampla aplicação industrial, o que tem levado à crescente procura de novas fontes produtoras de tais moléculas (JAEGER; EGGERT, 2002). Sendo o solo um grande reservatório de populações microbianas diversificadas, muitas pesquisas têm sido voltadas para o isolamento, a partir dele, de microrganismos com potencial biotecnológico. Ko et al. (2005), com o objetivo de detectar microrganismos lipolíticos a partir do solo de uma fazenda em Taiwan, observaram que a maior parte dos microrganismos produtores de enzimas lipolíticas foram bactérias e fungos, manifestando alta atividade enzimática. Segundo Hasan et al. (2006), apenas 2% dos microrganismos do mundo são objeto de pesquisa. Entre as fontes de enzimas lipolíticas, as bactérias são amplamente utilizadas nas aplicações biotecnológicas, apesar dos fungos serem preferencialmente utilizados em alguns casos, por não serem, em sua grande maioria, nocivos à saúde humana, sendo reconhecidos como “GRAS status” (Generally Regarded as Safe – Geralmente Considerados como Seguros), o que permite que os produtos obtidos por estes microrganismos sejam mais aceitos nos setores alimentícios e farmacêuticos (OLEMSKA-BEER et al., 2006). Todavia, as bactérias lipolíticas apresentam rápido crescimento celular, ao contrário dos fungos, se tornando uma vantagem para os processos fermentativos (JAEGER et al., 1999). Atualmente, sabe-se que diversas espécies bacterianas são produtoras de lipases, sendo as mais importantes do ponto de vista industrial, aquelas pertencentes aos gêneros Achromobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Burkholderia e Pseudomonas, sobressaindo-se esta última (GUPTA et al., 2004a; JAEGER et al., 1994; RATHI et al., 2002; VARGAS et al., 2004; WATANABE et al., 1977). Em detergentes, vários produtos comerciais têm na sua composição lipases bacterianas. Os produtos comerciais Lumafast, com lipase de Pseudomonas putida, e Lipomax, com lipase de P. pseudoalcaligenes, são exemplos (GUPTA et al., 2004a). No processamento de gorduras e óleos têm sido empregadas lipases de Pseudomonas em reações de hidrólise. Na produção de monoglicerídeos, usados como emulsificantes em diversos alimentos, cosméticos e produtos farmacêuticos, altos rendimentos foram obtidos com lipases de Pseudomonas (KOSUGI et al., 1988; YAMAMOTO; FUJIWARA, 1998). Em síntese orgânica, as lipases bacterianas têm sido empregadas para obtenção de compostos óticamente ativos, principalmente na resolução de misturas racêmicas de ácidos carboxílicos ou álcoois como, por exemplo, lipases de Arthrobacter (MITSUDA et al., 1988), de Pseudomonas cepacia (MARGOLIN, 1987) e de Choromobacterium (MARGOLIN et al., 1987). Tabela 01 – Microrganismos produtores de lipases. BACTÉRIAS Microrganismo Referência Acinetobacter pseudoalcaligenes Sztajer et al., 1988 Acinetobacter radioresistens Chen et al., 1999 Aeromonas hydrophila Anguita et al., 1993 Aeromonas sorbia LP004 Lotrakul; Dharmsthiti, 1997 Bacillus megaterium Godtfredsen, 1990 Bacillus cereus El-Shafei; Rezkallah, 1997 Bacillus stearothermophilus Kim et al., 1998 Bacillus subtilis Kennedy; Rennarz, 1979 Chromobacterium viscosum Jaeger; Reetz, 1998 Micrococcus freudenreichii Hou, 1994 Pichia burtonii Sugihara et al., 1995 Pseudomonas aeruginosa Hou, 1994 Pseudomonas cepacia Lang et al., 1998 Pseudomonas fragi Mencher; Alford,1967 Pseudomonas fluorescens Maragoni, 1994 Pseudomonas mendocina Jaeger;Reetz, 1998 Staphylococcus aureus Lee; Yandolo, 1986 Staphylococcus canosus Tahoun et al., 1985 Staphylococcus epidermidis Farrell et al., 1993 Streptococcus lactis Sztajer et al., 1988 Streptomyces cinnamomeus Sommer et al., 1997 Streptomyces coelicolor Hou, 1994 FUNGOS Aspergillus awamori Satyanarayan; Johri, 1981 Aspergillus carneus Helisto; Korpela, 1998 Aspergillus flavus Long et al., 1996, 1998 Aspergillus fumigatus Satyanarayan; Johri, 1981 Aspergillus japonicus Satyanarayan; Johri, 1981 Aspergillus niger Chen et al., 1995 Beauveria bassiana Hegedus; Khachatourians, 1988 Fusarium oxysporum Rapp, 1992 Geotrichum candidum Ghosh et al., 1996 Mucor miehei Rantakyla et al., 1996 Mucor racemosus Ghosh et al., 1996 Rhizopus japonicus Nakashima et al., 1988 Ghosh et al., 1996 Rhizop. microsporous LEVEDURAS Candida rugosa Wang et al., 1995 Candida parapsilosis Lacointe et al., 1996 Candida utilis Grbavcic et al., 2007 Ophiostoma piliferum Brush et al., 1999 Saccharomyces cerevisiae Ciafardini et al., 2006 Saccharomyces lipolytica Tahoun et al., 1985 Yarrowia lipolytica Kar et al., 2008 Fonte: SHARMA et al., 2001; TREICHEL et al., 2010. 1.2.4 Fatores que influenciam a produção de lipases O processo de obtenção das lipases envolve numerosas variáveis que vão desde a composição do meio (incluindo tipo e concentração de fontes de carbono e de nitrogênio) até as condições operacionais como pH, temperatura, agitação e aeração (BURKERT et al., 2003; KUMAR et al., 2005; GUPTA et al., 2004a; JAEGER e EGGERT, 2002; SHARMA et al., 2001). O pH do meio de crescimento é importante tanto por induzir mudanças morfológicas no organismo quanto por favorecer a secreção enzimática (GUPTA et al., 2004). De acordo com Pinheiro (2006), cada microrganismo apresenta um valor de pH ótimo para o crescimento que, muitas vezes, não é o mesmo para a produção de lipases. Entretanto, é possível que ocorram variações nos valores de pH durante o cultivo, os quais podem ser influenciados tanto pelo microrganismo e pela composição do meio, quanto pelos demais parâmetros existentes durante seu processo de produção. Tanto o crescimento microbiano quanto às reações enzimáticas em si são fenômenos dependentes da temperatura. Lipases bacterianas geralmente têm atividade em temperatura ótima que varia de 30 – 60 oC, apesar de existirem relatos de lipases com temperatura ótima abaixo de 30oC ou acima de 60oC (SHARMA et al., 2011). Parece haver relação direta entre a temperatura e o pH ótimo para o crescimento microbiano e a formação de produtos. Corzo e Revah (1999) obtiveram resultados que evidenciam este fato, pois uma análise estatística de seus dados mostrou que a interação entre os fatores pH e temperatura foram mais importantes na produção de lipases do que o fator pH ou temperatura isolado. Numerosas fontes de carbono podem ser citadas para o cultivo de microrganismos, com a finalidade de produção enzimática, dentre elas, fontes sintéticas (glicose, xilose, maltose, lactose, sacarose, avicel, carboximetilcelulose, xilano de aveia, pectina de citrus, glicerol e glicose) e fontes naturais (bagaço de cana, bagaço de laranja, farelo de aveia, farelo de trigo, azeite de oliva, óleo de soja, óleo de pescado, borra de óleo de soja) (KNOB et al., 2007). Meios de cultura líquidos, suplementados com concentrações fixas de vários compostos lipídicos, têm sido empregados na obtenção de um rendimento elevado na produção de lipase. A atividade lipolítica tem sido detectada em meios de cultura que contém substratos lipídicos como óleo de oliva, ácido oléico, triburitina e óleo de soja, o que sugere que a enzima seja induzida por estes substratos (DEIVE et al.,2003; SHIRAZI et al., 1998). Segundo a literatura, as fontes de nitrogênio mais utilizadas na produção de lipases são peptona, uréia, sulfato de amônio, extrato de levedura, cloreto de amônia e nitrato de amônia. Geralmente, os microrganismos fornecem altos rendimentos de lipase quando se utiliza como fonte de nitrogênio um composto orgânico (SHARMA et al., 2001). Atualmente, a estratégia de cultivo melhor definida para a produção de lipases é a de cultivo submerso (YANG et al., 2007). Os cultivos submersos são aqueles em que a célula produtora se desenvolve no interior do meio de cultivo, sob agitação. Os cultivos submersos podem ser realizados em frascos agitados (erlenmeyers), em incubadora rotatória (onde os controles de pH e transferência de oxigênio são difíceis) ou em biorreatores, que permitem o controle de vários parâmetros (ALONSO, et al., 2001). Com base na literatura, muitos estudos demonstram que a agitação e a aeração são parâmetros que influenciam diretamente na produção de enzimas lipolíticas. Diaz et al. (2006), para produção de lipase pelo fungo termotolerante Rhizopus homothallicus, em fermentação submersa, utilizaram pH 6,5, temperatura de 40º C e velocidade de agitação de 170 rpm, obtendo atividade lipolítica máxima de 50 U/mL/min. Por sua vez, Shu et al. (2006), obtiveram atividade lipolítica máxima de 26 U/mL/min utilizando lipase de A. cinnamomea a uma velocidade de agitação de 150 rpm, temperatura de 28º C e pH 4,0. Amaral (2007) relatou que a produção de diversas substâncias em escala laboratorial é realizada tradicionalmente em erlenmeyers incubados em banhos agitados. Portanto, nesses casos, para se estudar a influência da concentração de oxigênio na produção de lipases, é comum variar o volume de meio de cultura em frascos com volume constante. Desta forma, quanto maior o volume de meio, menor é a disponibilidade de oxigênio, pois se reduz à superfície de contato com o ar. Além da diversidade de lipases existentes, várias metodologias de dosagem de atividade lipolítica têm sido utilizadas. Não existe um ensaio universal, mas a reação padrão mais comum para a determinação da atividade lipolítica é a hidrólise de triglicerídeos de um óleo com a quantificação dos ácidos graxos liberados (SCHMIDT et al., 2005). Um dos métodos mais recomendados para quantificação de lipases é o titulométrico, que se baseia na titulação alcalina dos íons de hidrogênio liberados na dissociação dos ácidos graxos resultantes da ação das lipases sobre as moléculas do triglicerídeo (WATANABE et al., 1977). 1.2.5 Aplicações de lipases Hoje em dia, o uso comercial de lipases é um negócio que envolve bilhões de dólares e compreende uma ampla variedade de diferentes aplicações em processos químicos, indústria alimentícia, oleoquímica, de papéis, de comésticos, farmacêutica, de detergentes e de polímeros sintéticos (SHARMA et al., 2011). As lipases se tornaram fundamentais para a indústria alimentícia moderna (THEIL, 1995). Elas são utilizadas para a obtenção de ácidos graxos livres a partir da hidrólise seletiva de óleos e gorduras presentes em diversos alimentos que, em geral, conferem um peculiar sabor e aroma aos alimentos, muitas vezes alterando as propriedades físico-químicas, organolépticas e nutricionais de diversos produtos (JAEGER; REETZ, 1998). As lipases também são utilizadas para hidrolisar gorduras do leite, acelerar os processos de maturação de queijos e obter margarinas de baixo valor calórico (ALONSO et al., 2001). A indústria de cosméticos e perfumaria tem desenvolvido processos que empregam lipases na produção de emulsificantes, aromas, surfactantes e emolientes que fazem parte da composição de cremes (SHARMA et al., 2001). Os componentes da madeira, principalmente triglicerídeos e ceras, causam graves problemas na fabricação de celulose e papel. De acordo com Sharma et al. (2001), as enzimas lipolíticas são utilizadas para a remoção do “pitch” da polpa de celulose no processamento industrial do papel. Para o controle de “pitch” foi desenvolvido no Japão um método que utiliza a lipase fúngica de Candida rugosa para hidrolisar mais que 90% dos triglicerídeos presentes na madeira. As lipases também podem ser utilizadas para substituir reagentes químicos. A enantioseletividade, característica que a maioria dos fármacos possuem, permite aos mesmos se encaixarem perfeitamente num sítio ativo. O uso de lipases permite a enantioseletividade de algumas reações, ou seja, elas conseguem fazer uma diferenciação entre dois compostos químicos e hidrolisar preferencialmente um deles (HASAN et al., 2006; SHARMA et al., 2001). Por apresentar capacidade de hidrolisar gorduras, as enzimas lipolíticas são largamente utilizadas como aditivos na indústria e como detergentes domésticos. Os detergentes que apresentam este tipo de enzima são especialmente selecionados para atender aos seguintes requisitos: baixa especificidade do substrato, ou seja, capacidade de hidrolisar gorduras de diversas composições, resistência à lavagem em condições relativamente duras com pH entre 10 e 11 e temperatura de 30ºC a 60ºC, e resistência aos danos causados pelas enzimas tensioativas (proteases, muito utilizadas na formulação de detergentes) (HASAN et al., 2006; SHARMA et al., 2001). 1.3 Biossurfactantes 1.3.1 Aspectos gerais dos biossurfactantes Surfactantes são moléculas anfipáticas que apresentam a capacidade de reduzir a tensão superficial, força existente entre uma superfície ar-líquido, e a tensão interfacial, força existente entre uma superfície líquido-líquido, por se acumular na interface de líquidos imiscíveis e aumentar a solubilidade e mobilidade de compostos orgânicos insolúveis ou hidrofóbicos (BODOUR; MILLER-MAIER, 1998; MULLIGAN, 2005; PRINCE, 1997; ROSENBERG; RON, 1999). Os surfactantes podem ser de origem química ou biológica. Os compostos microbianos que apresentam atividade surfactante são denominados biossurfactantes. A capacidade dos biossurfactantes promoverem a redução da tensão superficial e interfacial, formando microemulsões onde os hidrocarbonetos podem mesmos, excelente detergência, emulsificação, formação ser de solubilizados, espuma e confere, aos capacidade de dispersão, o que aumenta a importância de seu uso em muitos processos industriais (GREEK, 1990; GREEK, 1991). Os biossurfactantes apresentam muitas vantagens em relação aos surfactantes sintéticos, como: aceitabilidade ecológica, pois são potencialmente aplicáveis em proteção ambiental (RAHMAN et al., 2002), apresentando baixa toxicidade e alta biodegrabilidade (COSTA et al., 2006; MAKKAR; CAMEOTRA, 2002; RAHMAN et al., 2002); maior formação de espuma; são efetivos em ampla faixa de temperatura e pH (BANAT et al.,2000; MULLIGAN, 2005); podem ser produzidos a partir de fontes renováveis (BENINCASA et al., 2002; NITSCHKE et al.,2005b) e podem ser mais eficientes que surfactantes químicos (BANAT, 1995). A maioria dos biossurfactantes é do tipo aniônico ou neutro. Alguns são catiônicos, como, por exemplo, aqueles que contêm grupos amino. A porção hidrofóbica da molécula pode ser formada por ácidos graxos de cadeia longa, hidróxi ácidos graxos ou por α- alquil-βhidroxi ácidos graxos. A porção hidrofílica pode ser composta por carboidratos, aminoácidos, peptídeos cíclicos, fosfato ou ácido carboxílico (JACOBUCCI, 2000). Quase todos os surfactantes são quimicamente derivados de petróleo. Por estes compostos não serem biodegradáveis, podendo ser tóxicos ao meio ambiente, o interesse por surfactantes de origem biológica tem aumentado cada vez mais, uma vez que os mesmos são biodegradáveis. Com isso, há um crescente interesse na possibilidade do uso de biossurfactantes no transporte de petróleo em tubulações, no gerenciamento de derramamentos de óleo, na limpeza de tanques de armazenagem de óleo, na biorremediação de solos e na recuperação melhorada de petróleo (MEOR – microbial enhanced oil recovery) (DESAI; BANAT, 1999). 1.3.2 Biossurfactantes: classificação e organismos produtores Ao contrário dos surfactantes sintéticos, que são classificados de acordo com a natureza do seu grupo polar, os biossurfactantes são classificados principalmente pela composição química e pela origem microbiana (DESAI; BANAT, 1999). Os biossurfactantes podem ser divididos em dois grandes grupos: os de baixo peso molecular e os de alto peso molecular. Os de baixo peso molecular apresentam maior eficiência em reduzir a tensão superficial e interfacial de meios líquidos, enquanto os surfactantes de alto peso molecular demonstram maior eficiência em estabilizar emulsões óleo/água (ROSENBERG; RON, 1999). De acordo com Rosenberg e Ron (1998), os biossurfactantes são classificados em sete grupos distintos: glicolipídeos, lipopolissacarídeos, lipopeptídeos, fosfolipídeos, ácidos graxos ou lipídeos neutros, surfactantes poliméricos e os surfactantes particulados. Os biossurfactantes mais conhecidos são os glicolipídeos. Eles são constituídos a partir de uma combinação de carboidratos com longas cadeias de ácidos alifáticos ou ácidos hidróxi-alifáticos (DESAI; BANAT, 1999). Uma determinada espécie microbiana é capaz de produzir diferentes tipos de glicolipídeos, dependendo da fonte de carbono disponível para seu crescimento (ZAJIC; STEFFANS, 1984). Dentre os glicolipídeos, os mais conhecidos são os ramnolipídeos, os trealolipídeos e os soforolipídeos (MUTHUSAMY et al., 2008). O número de lipopeptídeos com propriedades tensoativas, reportado na literatura, tem sido cada vez maior (DESAI; BANAT, 1999; FIETCHER, 1992; ZAJIC; SEFFENS, 1984). Estes compostos são sintetizados principalmente por bactérias, também existindo alguns relatos de sua obtenção por leveduras (ZAJIC; SEFFENS, 1984). Dentre os lipopeptídeos conhecidos, a surfactina é um dos que mais se destaca. Sendo produzido por algumas linhagens de B. subtilis, também denominada de subtilisina ou serolisina, ela é um dos mais efetivos biossurfactantes conhecidos (ARIMA et al., 1968; COOPER et al., 1981; DESAI; BANAT, 1999; MAKKAR; CAMEOTRA, 1997; REIS et al., 2004). Segundo Fox et al. (1993), a surfactina foi capaz de reduzir a tensão superficial da água de 72 para 27,9 dina/cm. Dentre outras características importantes deste lipopeptídeo, podem ser citadas a capacidade de lisar eritrócitos e de induzir a formação de esferoplastos (ARIMA et al., 1968; BERNHEIMER e AVIGAD, 1970). Por isso, a produção de surfactina pode ser detectada através de hemólise, cultivando-se a bactéria em ágar sangue (DESAI; BANAT, 1999). Os fosfolipídeos, ácidos graxos e lipídeos neutros são, naturalmente, componentes estruturais das células microbianas. Quando crescidas em meio rico em hidrocarbonetos, bactérias e leveduras aumentam consideravelmente o nível de fosfolipídeos. Alguns desses fosfolipídeos têm grande potencial biossurfactante (DESAI; BANAT, 1999; KARANTH et al., 1999; BOGNOLO, 1999). Algumas bactérias e leveduras, durante o crescimento na presença de n-alcanos, excretam grandes quantidades de ácidos graxos e fosfolipídeos com altas propriedades tensoativas (DESAI; BANAT, 1999). Os biossurfactantes poliméricos mais estudados são emulsan, liposan, alasan e mamanoproteína (ROSENBERG et al., 1979). O termo mais adequado para se referir a esses compostos é bioemulsificante, considerando sua principal característica. Estas biomoléculas apresentam alta afinidade por interfaces óleo/água, propiciando, desta forma, a formação de emulsões estáveis (KOSARIC et al., 1987). Microvesículas extracelulares produzidas por bactérias do gênero Acinetobacter, que captam e dispersam os hidrocarbonetos em pequenas gotículas, formando uma emulsão, são denominadas surfactantes particulados. Estas pequenas vesículas apresentam a mesma composição da membrana do microrganismo, porém uma quantidade cinco vezes maior de fosfolipídeos e 350 vezes maior de polissacarídeos do que outras membranas do microrganismo. Células microbianas com alta hidrofobicidade, principalmente os microrganismos degradadores de hidrocarbonetos, têm alta afinidade pela interface hidrocarboneto-água ou ar-água. Nestes casos, a célula microbiana é, por si só, um biossurfactante (DESAI; BANAT, 1999; KARANTH et al., 1999). 1.3.3 Ramnolipídeos Biossurfactantes glicolipídeos, produzidos por várias espécies de bactérias que apresentam em sua estrutura ramnose e ácido β-hidroxidecanóico, são denominados de ramnolipídeos (MÜLLER; HAUSMAN, R., 2011). Estes foram descritos pela primeira vez por Bergström et al. (1946), que denominou um glicolipídeo oleoso produzido por Pseudomonas pyocyanea (hoje, P. aeruginosa) como ácido piolipídico, onde suas unidades estruturais identificadas como ramnose e ácido β-hidroxidecanóico, sem determinação da sua real proporção (ABDEL-MAWGOUD et al., 2010). Isto foi elucidado por Jarvis e Johnson (1949), que demonstraram que através de uma ligação glicosídica, dois ácidos βhidroxidecanóico encontram-se ligados a duas moléculas de ramnose. Segundo Abdel-Mawgoud et al. (2010), os principais ramnolipídios produzidos por P. aeruginosa são o ramnosil-β-hidroxidecanoil-β-hidroxidecanoato (monorramnolipídio) (Figura 04) e o ramnosil-ramnosil-β-hidroxidecanoil-β-hidroxidecanoato (dirramnolipídio) (Figura 05). As variações de estruturas químicas de ramnolipídeos produzidos por bactérias dão origem a uma ampla gama de homólogos que se aproxima de 60 estruturas (ABDELMAWGOUD et al., 2010). Figura 04 - Monorramnolipídeo. Fonte: Olvera et al., 1999. Figura 05 – Dirramnolipídeo. Fonte: Olvera et al., 1999. Espécies de Pseudomonas tem sido a principal fonte de produção de ramnolipídeos, sendo Pseudomonas aeruginosa considerada como produtora primária. Algumas espécies bacterianas pertencentes aos filos Actinobacteria e Firmicutes também tem sido relatadas como produtoras de ramnolipídeos (GUNTHER et al., 2005). Variações na natureza e distribuição dos diferentes tipos de ramnolipídeos identificados podem ser atribuídas às diversas condições de cultivo, além de variações relacionadas às linhagens (DÉZIEL et al., 2000). Os ramnolipídeos podem ser produzidos a partir de resíduos industriais ou substratos renováveis e apresentam excelente biodegrabilidade, além de baixa toxicidade (MARSUDI et al. 2008; RAHMAN et al. 2002; WEI et al. 2005). Também demonstram boa estabilidade quando comparados aos surfactantes convencionais, de origem petroquímica (ABALOS et al., 2001; HABA et al., 2003). Sua aplicação na biorremediação (NGUYEN et al. 2008), na recuperação avançada do petróleo (WANG et al. 2007), na biodegradação (ZHANG et al. 2005), na indústria de detergentes (BANAT et al. 2010) e farmacêutica, especialmente devido a sua atividade anti-microbiana e anti-adesiva (VATSA et al. 2010) , tem se tornado cada vez mais evidente. Fisiologicamente, o papel dos ramnolipídeos ainda não foi precisamente definido. Algumas evidências apontam que os mesmos estão envolvidos com a assimilação de substratos insolúveis, especialmente hidrocarbonos, tão bem como mudanças na hidrofobicidade da superfície celular (AL-TAHHAN et al., 2000); atividade antimicrobiana (WANG et al., 2005) e atividade hemolítica em patogêneses humanas (FUJITA et al., 1988). Entender os mecanismos envolvidos na produção dos ramnolipídeos é um passo fundamental para aumentar sua produção industrial em larga escala e torná-lo competitivo com seus homólogos sintéticos. Para degradar substratos hidrofóbicos, a maioria das bactérias libera biossurfactantes, que facilitam a absorção e assimilação dos hidrocarbonos (HOMMEL, 1994). Como alcanos lineares, de alto peso molecular, são insolúveis em água e excelentes fontes de nutrientes para algumas bactérias, é provável que as mesmas tenham acesso às moléculas hidrofóbicas por um processo facilitado pela ação de ramnolipídeos (emulsificação e solubilização) ou por adesão direta às gotículas de hidrocarbonetos (ABDEL-MAWGOUD et al., 2010). Por muitos anos, Pseudomonas aeruginosa ficou conhecida por produzir um glicolipídeo com atividade hemolítica. O avanço nas pesquisas demonstrou que os ramnolipídeos, produzidos por essas bactérias, eram os responsáveis pela lise das hemácias (SIERRA, 1960). Ramnolipídeos são citolíticos para macrófagos derivados de monócitos humanos (MCCLURE; SCHILLER, 1992) e ao reduzir suas concentrações, também podem inibir a resposta fagocítica dos macrófagos (MCCLURE; SCHILLER, 1996). As propriedades antimicrobianas dos ramnolipídeos mostram que os mesmos são ativos contra uma ampla variedade de bactérias, tanto de espécies Gram-negativas quanto Gram-positivas. Destas últimas, Bacillus subtilis são os mais suceptíveis aos efeitos tóxicos dos ramnolipídeos (ITOH et al., 1971; LANG et al., 1989). Muitas pesquisas têm sido voltadas para investigar as propriedades das misturas dos tipos de ramnolipídeos produzidos por diferentes linhagens de P. aeruginosa crescidas com vários tipos de óleos vegetais (ABALOS et al., 2001; BENINCASA et al., 2004; HABA et al., 2003b). Várias combinações de ramnolipídeos possuem atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas (Staphylococcus, Mycobacterium e Bacillus) e Gram-negativas (Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes e Klebsiella pneumoniae). Atividade antifúngica também foi demonstrada pelos ramnolipídeos, especialmente contra as espécies Chaetomium globosum, Aureobasidium pullulans, Gliocladium virens, Botrytis cinerea e Rhizoctonia solani (ABALOS et al., 2001; BENINCASA et al., 2004; HABA et al., 2003b). 1.3.4 Fatores que influenciam a produção de biossurfactantes O tipo, a quantidade e a qualidade dos biossurfactantes produzidos por um microrganismo são influenciados por fatores tais como: a natureza da fonte de carbono (GEORGIOU et al., 1992); as concentrações de nutrientes como N, P, Mg, Fe, S e Mn no meio (ABU-RUWAIDA et al., 1991; ATLAS, 1981; HAFERBURG et al., 1986) e as condições de crescimento tais como pH, temperatura, agitação e oxigênio disponível. Embora os vários biossurfactantes possuam estruturas diferentes, há alguns aspectos comuns no que se refere à sua biossíntese. Geralmente, a produção de biossurfactantes é induzida por hidrocarbonetos ou por outros substratos insolúveis (KARANTH et al., 1999). Os parâmetros que têm sido mais utilizados para analisar a produção dos biossurfactantes e medir sua eficiência são: redução da tensão superficial, redução da tensão interfacial, emulsificação, dispersão, atividade hemolítica e concentração micelar crítica (DESAI; BANAT, 1999). A emulsificação é uma propriedade que alguns compostos anfifílicos apresentam ao promover a dispersão de um líquido em outro, através da formação de gotículas ou emulsões. Um importante critério de avaliação do poder de emulsificação das bactérias é o Índice de Emulsificação (IE) e da estabilidade da emulsão (ABU-RUWAIDA et al., 1991; COOPER; GOLDENBERG, 1987; COSTA, 2005; NITSCHKE, 2004). Segundo vários trabalhos, as bactérias com atividade biossurfactante produzem emulsões estáveis após 24 horas, pelo fato de produzem substâncias anfifílicas (BANAT et al., 2000; MESQUITA, 2004; NITSCHKE; PASTORE, 2002). Singh et al. (2007) relatam que alguns fatores podem influenciar na estabilidade da emulsão, tais como viscosidade, volume do líquido a ser testado, a razão entre os volumes do líquido e do hidrocarboneto, temperatura, pH, tipo de agente emulsificante presente na amostra, diferenças de densidade do líquido e tempo de agitação. Um dos fatores chave para otimização da produção de biossurfactantes é o substrato, pois o mesmo influencia diretamente tanto no custo e na quantidade de produção quanto na constituição de sua estrutura química. Os substratos, em geral, podem ser classificados em solúveis (glicose, sacarose, glicerol, etanol) ou insolúveis (hidrocarbonetos, óleos vegetais) (GUTIERREZ et al., 1992). Para reduzir custos dos processos de produção alguns substratos baratos são usados na produção de biossurfactantes. Dentre esses substratos pode-se destacar: óleos de babaçu, milho, girassol, soja, jojobá, entre outros. Existem ainda os substratos baratos provenientes de recursos renováveis, aqueles que apresentam fonte de carbono, especialmente os de resíduos agroindustriais como: polpa de café, farelo de cereais, palhas, bagaço de cana, cascas de frutas processadas, batata, farinha de cereais e mandioca, entre outros (GUTIERREZ et al., 1992; MAKKAR; CAMEOTRA, 2002). Fatores ambientais e condições de crescimento também afetam a produção de biossurfactantes através de seu efeito no crescimento ou na atividade celular. O valor de pH do meio é de grande importância na produção de soforolipídios por Torulopsis bombicola (GOBBERT et al., 1984). A produção de ramnolipídios por Pseudomonas sp. aumenta quando em meio de cultura com um pH na faixa de 6,0 a 6,5, diminuindo acentuadamente quando o pH excede de 7,0 (GUERRA-SANTOS et al., 1984). 1.3.5 Aplicação dos biossurfactantes O interesse por surfactantes de origem biológica tem crescido cada vez mais nesses últimos anos, principalmente devido as suas várias propriedades funcionais e por serem produzidos por uma ampla faixa de microrganismos (MUTHUSAMY et al., 2008). Algumas das mais importantes características dos biossurfactantes são: sua aceitabilidade ecológica, baixa toxicidade e fácil biodegradabilidade na natureza, o que acarretou no aumento das pesquisas interessadas em produzi-lo a um custo compatível ao dos surfactantes derivados de produtos petroquímicos (DELEU et al., 2004; HEYD, et al., 2008). Os biossurfactantes podem ser utilizados em várias atividades industriais que envolvam o uso de surfactantes sintéticos como a indústria petrolífera, farmacêutica, de cosméticos, na agricultura para a formulação de herbicidas e pesticidas, na produção de produtos de higiene pessoal, detergentes, vestuário, processamento de alimentos, tratamento e processamento de metais, processamento de polpas de papel, entre outros (ANISZEWSKI et al., 2003; BANAT et al., 2000). Na indústria petrolífera, os biossurfactantes são utilizados para recuperação avançada do petróleo, reduzindo a tensão interfacial e melhorando a drenagem do óleo preso nos capilares (SINGH et al., 2007). A biodegradação de hidrocarbonetos do petróleo é um processo complexo que depende da natureza e quantidade de óleo ou hidrocarbonetos presentes. Além disso, o crescimento de microrganismos sobre hidrocarbonetos apresenta problemas particulares, pois estes são imiscíveis em água. Porém, muitas bactérias são capazes de produzir agentes biossurfactantes (BENINCASA et al., 2002; KOCH et al., 1991), como as espécies de Pseudomonas, que aumentam a adesão de células ao substrato permitindo a degradação do mesmo (BALDI et al., 1999; BENINCASA et al., 2002). A aplicação de biossurfactantes neste processo foi iniciada na década de 70, e nos anos 80 foram relatados os primeiros estudos em pequena escala do uso do emulsan (produzido pelo Acinetobacter calcoaceticus) na limpeza de vasos contaminados por óleo (BOGNOLO, 1999). Na área ambiental existe um interesse muito grande para utilização dos biossurfactantes na biorremediação e descontaminação de solos, devido à sua capacidade de degradar hidrocarbonetos, reduzir a tensão superficial e interfacial, formando microemulsões nas quais os hidrocarbonetos podem solubilizar- se (LANG; PHILP, 1998; SINGH et al., 2007). Na agricultura, os surfactantes de origem microbiana têm sido utilizados, especialmente, para emulsificar formulações de pesticidas organofosforados (NITSCHKE; PASTORE, 2002). Muitos biossurfactantes têm apresentado ação contra bactérias, fungos, algas e vírus. Segundo Besson et al. (1976), o lipopeptídeo inturin A, produzido por B. subtillis, demonstrou atividade antifúngica. A inativação do envelope viral do herpes e de retrovírus foi observada com baixa dosagem de surfactina (80mM) (VOLLENBROICH et al., 1997). Ramnolipídeos já demonstraram impedir o desenvolvimento espécies de algas nocivas como Heterosigma akashivo e Protocentrum dentatum (MUTHUSAMY et al., 2008) . O lipídeo manosileritrol, biossurfactante glicolipídeo produzido por Candida antartica, tem demonstrado atividade antimicrobiana especialmente contra espécies Gram-positivas (KITAMOTO et al., 1993). Na indústria alimentícia, os biossurfactantes são utilizados como emulsificantes de gorduras e no processamento de matérias-primas, na panificação e em produtos derivados de carne. Eles também apresentam papel importante na formação da consistência e textura, bem como na dispersão de fases e na solubilização de aromas dos alimentos (MUTHUSAMY et al., 2008). Alguns desses biossurfactantes são utilizados comercialmente, como por exemplo, o bioemulsificante produzido por Candida utilis, utilizado em molhos prontos para saladas (NITSCHKE; PASTORE, 2002; BANAT et al., 2000). Outra aplicação dos biossurfactantes é na indústria de laticínios, onde eles retardam a colonização de Streptococcus thermophilus, responsável pelo cheiro ruim durante a pasteurização (BANAT et al., 2000). Os biossurfactantes ainda não são capazes de competir com os surfactantes sintéticos devido ao seu alto custo de produção. Para que possam competir significativamente no mercado, dois pré-requisitos são necessários: 1) aumentar o conhecimento e a habilidade em manipular o metabolismo de microrganismos produtores, de forma que substratos de baixo custo possam ser usados; 2) otimizar tecnologias de processo para facilitar a recuperação do produto (FIECHTER, 1992). 1.4 Métodos de caracterização de microrganismos Os estudos taxonômicos em microbiologia, por mais de 100 anos, não foram tão precisos em vista das grandes dificuldades de classificação imposta pelos métodos tradicionais, baseados essencialmente em características fenotípicas, resultando na formação de grupos taxonômicos relativamente heterogêneos e, muitas vezes, artificiais. Com a utilização de técnicas de biologia molecular associadas a testes microbiológicos tradicionais, produziu-se um sistema estável e altamente informativo, que tem colaborado para o avanço de várias áreas abrangentes da microbiologia, como a genômica, a ecologia e a biotecnologia (BUSSE et al., 1996). A primeira etapa do processo de identificação de bactérias, em muitos casos, é a sua caracterização fenotípica (BOONE; CASTENHOLZ, 2001). Estes métodos não envolvem manipulação ou análise direta de moléculas de DNA ou RNA, mas compreendem características morfológicas, fisiológicas e bioquímicas (PONTES et al., 2007). Individualmente, muitas destas características têm se mostrado irrelevante na determinação precisa de bactérias, ainda que como um todo, estas forneçam informações importantes para o reconhecimento de alguns gêneros e espécies. A análise morfológica se baseia tanto em características da célula (forma, formação de endosporo, flagelos) quanto da colônia (cor, dimensão, forma). As características fisiológicas e bioquímicas incluem informações de cultivo e adaptabilidade como o crescimento em diferentes temperaturas, valores de pH, concentrações de sais e açúcares, crescimento na presença de vários substratos, atividades enzimáticas e metabolização de compostos variados. Muitas destas propriedades fenotípicas podem ser utilizadas, não só para o processo de identificação, mas também para verificar uma provável adaptabilidade ecológica dos diferentes microrganismos às condições ambientais. Embora os testes fenotípicos forneçam inúmeras informações essenciais à identificação dos microrganismos, a combinação das informações fenotípicas e genômicas é necessária para uma descrição e classificação precisa das bactérias (ROSSELLÓ-MORA; AMANN, 2001). Os métodos genotípicos são aqueles direcionados para moléculas de rDNA ou rRNA (VANDAMME et al., 1996 ). Atualmente, estes métodos dominam os estudos da taxonomia moderna de bactérias como uma consequência do progresso tecnológico. O DNA ribossomal de bactérias é objeto de grande número de estudos, com diversas aplicações em genética, evolução e filogenia. Os genes ribossomais são considerados cronômetros evolutivos (WOESE; FOX, 1977), pois a comparação de sua seqüência entre diversos organismos permite inferências filogenéticas entre os mesmos. Isto é possível dado que estes genes estão presentes em todos os seres vivos e são conservados ao longo da evolução, mas apresentam regiões com variações de nucleotídeos nas diferentes espécies, o que permite comparações mesmo entre organismos filogeneticamente distantes. De acordo com Peixoto et al. (2002), o RNAr 16S preenche todos os requisitos que definem um marcador filogenético universal, pois além de apresentar regiões altamente conservadas entre regiões variáveis, está presente e tem a mesma função em todas as espécies; não é afetado pelas mudanças ambientais; seu tamanho é suficientemente grande, permitindo comparações significativas e apresenta um grande número de seqüências disponíveis via base de dados pela internet. A combinação destas propriedades faz deste gene essencial para estudos de evolução microbiana e filogenia (ACINAS et al., 2004). Com o advento das técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR) (SAIKI et al, 1988) e sequenciamento de DNA (SANGER et al., 1977), os métodos moleculares, especialmente aqueles baseados no estudo da sequência do rDNA 16S, tem sido muito úteis na descoberta de novos microrganismos. Estas técnicas se baseiam na amplificação do rDNA 16S por PCR e posterior sequenciamento. Entre outros métodos para estudo da comunidade global podem ser destacados: análise de restrição do DNA ribossomal amplificado (ARDRA), análise do polimorfismo do tamanho do fragmento de restrição terminal (TRFLP), amplificação aleatória de DNA polimórfico (RAPD), análise do espaço ribossomal intergênico (RISA), eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE), eletroforese em gel de gradiente de temperatura (TGGE) e polimorfismo conformacional de fita simples (SSCP) (TORSVIK; OVREAS, 2002). Existem ainda métodos que se baseiam no perfil dos ácidos graxos fosfolipídico (PLFA) e ácido graxo metil éster (FAME) para obter um perfil da comunidade bacteriana (KOZDRÓJ; VAN-ELSAS, 2001). A técnica conhecida como ARDRA se baseia no grau de conservação dos sítios de restrição do rDNA que reflete padrões filogenéticos, sendo bastante útil para uma rápida análise da diversidade genética (GRIFONI et al., 1995). Sua ação depende de um conjunto de enzimas de restrição, sendo mais indicada a utilização de 3 a 4 enzimas, possibilitando o agrupamento de linhagens a nível de espécie (STAKENBORG et al., 1995; WEIDNER et al., 1996). 1.5 Planejamento experimental e otimização de experimentos Quando se estuda a produção de produtos específicos é comum a existência de vários fatores ou variáveis que afetem a qualidade global do produto final. O planejamento experimental representa uma poderosa metodologia na qual um conjunto de ensaios é estabelecido, com base em critérios estatísticos, determinando a influência de diferentes fatores nos resultados de um processo. Wekerman e Aguiar (1996) afirmam que para que um experimento seja realizado de forma eficiente, uma abordagem científica deve ser utilizada para o seu planejamento, visando a coleta dos dados em tempo e custo mínimos. De acordo com Barros Neto et al. (2007), otimizar um experimento ou sistema significa descobrir quais os valores dos fatores ou variáveis envolvidas produzem a melhor resposta. Com a metodologia de planejamentos, o pesquisador pode obter as melhores características de um produto, aumentar a produtividade do processo e obter o melhor planejamento do mesmo para assegurar sua qualidade, através de estudos simultâneos de diversas variáveis e da redução do número de experimentos, sem prejuízo para a qualidade da informação, obtendo resultados com altos níveis de confiabilidade (ELIBOL, 2002). A razão para avaliar muitas variáveis ao mesmo tempo se deve ao fato que as mesmas podem se influenciar mutuamente e o valor ideal para uma delas pode depender do valor da outra. No planejamento experimental, as variáveis de saída do sistema são as respostas que podem ou não ser afetadas por modificações induzidas nas variáveis de entrada (fatores) que o experimentador tem condições de controlar (Figura 06). Figura 06 – Diagrama de blocos interligando os fatores às respostas. Fonte: Barros Neto et al., 2007. 1.5.1 Planejamento fatorial em dois níveis Planejamento fatorial é aquele no qual se investigam todas as possíveis combinações dos níveis dos fatores em cada ensaio (Box et al., 1978). Diferentes níveis podem ser analisados, entre eles temperatura, pH, velocidade de rotação de um agitador e tempo de agitação de uma mistura. Os planejamentos fatoriais com dois níveis são constituídos por k fatores. Eles apresentam grande utilidade em investigações preliminares, quando o sistema não é bem conhecido e se deseja saber se determinados fatores têm ou não influência sobre a resposta. Um planejamento fatorial requer a execução de experimentos para todas as possíveis combinações dos níveis dos fatores. Havendo k fatores, isto é, variáveis controladas pelo experimentador, o planejamento de dois níveis irá requerer a realização de 2x2x2...x2 = 2k ensaios diferentes, sendo por isso chamado de planejamento fatorial 2k (BARROS NETO et al., 2007). Os experimentos fatoriais 2k são amplamente utilizados principalmente pelo fato da interpretação dos resultados ser bastante intuitiva, o número de ensaios envolvidos, por fator estudado, ser relativamente pequeno e por poder aumentar o número de experimentos com a inclusão de novos níveis e/ou fatores para uma análise mais detalhada do fenômeno que está sendo estudado. 1.5.2 Metodologia de Superfície de Resposta A metodologia de superfície de resposta (RSM - Response Surface Methodology) se baseia num conjunto de técnicas matemáticas e estatísticas utilizadas para modelamento e análise dos problemas onde a resposta de interesse é influenciada por diversas variáveis (BOX et al., 1978). Essa metodologia apresenta duas etapas distintas: modelagem e deslocamento. Essas etapas são repetidas quantas vezes forem necessárias até ser atingida uma região ótima (máxima ou mínima) da superfície investigada. A modelagem normalmente é feita ajustandose modelos lineares ou quadráticos a resultados experimentais obtidos a partir de planejamentos fatoriais. Quanto ao deslocamento, este se dá sempre ao longo do caminho de máxima inclinação de um determinado modelo, trajetória na qual a resposta varia de forma mais acentuada (BOX et al., 1978). A figura obtida quando uma resposta é representada graficamente em função de dois ou mais fatores do processo é a superfície de resposta. Outra representação é através de uma curva de nível que identifica os valores dos fatores analisados para as quais a variável resposta é constante (BARROS NETO et al., 2007). A metodologia de superfície de resposta tem sido utilizada em muitos trabalhos para otimizar o cultivo de bactérias, fungos e leveduras, além dos parâmetros que permitam uma maior atividade enzimática. Muitos autores têm ressaltado a importância dessa metodologia para aumentar a atividade lipolítica (BURKERT et al., 2003; EBRAHIMPOUR et al., 2008; SHIEH, et al., 2003). OBJETIVOS 2 OBJETIVOS 2. 1 Objetivo Geral O objetivo deste trabalho foi analisar a produção de lipases e biossurfactantes por bactérias isoladas de um solo contaminado com óleo vegetal residual. 2.2 Objetivos Específicos  Analisar as principais características físico-químicas e microbiológicas de um solo contaminado com óleo vegetal residual;  Isolar as linhagens bacterianas do solo e caracterizá-las quanto aos aspectos morfofisiológicos;  Verificar a atividade lipolítica dessas bactérias em meios sólidos, na presença de diferentes susbtratos;  Analisar quantitativamente a atividade lipolítica das bactérias isoladas, em diferentes condições de cultivo, pelo método titulométrico;  Avaliar o efeito do pH e da temperatura sobre a atividade lipolítica das bactérias isoladas utilizando a Metodologia de Superfície de Resposta (RSM- Response Surface Metodology);  Analisar a produção de biossurfactantes pelas bactérias isoladas através de diferentes métodos;  Identificar as linhagens lipolíticas mais ativas utilizando métodos moleculares (análise de restrição do gene rRNA 16S amplificado (ARDRA) e sequenciamento do gene rRNA 16S). MATERIAL E MÉTODOS 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Área de estudo e coleta da amostra A amostra de solo foi coletada em uma área experimental, utilizada para descarte de óleo vegetal, localizada em uma chácara em Jacarapé (7°12'9,5" S - 34°48'21,8" O) no município de João Pessoa – PB. Na área experimental, um volume de cerca de 1 litro do óleo vegetal usado (óleo de cozinha) foi despejado na superfície do solo (cerca de 2 m2) a cada dois meses durante três anos (2007 - 2010) com a finalidade de enriquecimento do solo para favorecer a presença de microrganismos lipolíticos. A coleta do solo tratado com óleo residual foi realizada em novembro de 2010 (Figura 07), onde, aproximadamente, 500g de solo foram coletados a uma profundidade de 0 - 10cm. Uma amostra do solo da área não tratada com óleo vegetal também foi coletada, a 50 metros de distância da área tratada, para analisar o impacto do efeito do óleo residual no solo. As duas amostras coletadas foram armazenadas em sacos plásticos e conduzidas em caixa isotérmica ao laboratório, sendo refrigerado até o processamento. Figura 07 – Coleta da amostra de solo utilizado para descarte de óleo vegetal residual. Fonte: Krystyna Gorlach Lira. 3.2 Caracterização físico-química do solo As seguintes características físico-químicas foram determinadas nas amostras do solo tratado com óleo vegetal residual e do solo não tratado: a) pH, b) Matéria orgânica; c) Concentração dos elementos: P, K+, Na+, Ca2+, Mg2+, Al3+, Zn2+, Fe e Cu2+. d) Teor de umidade O teor de umidade foi determinado utilizando 5 g do solo aquecido por 24h em estufa a 105ºC, efetuando-se, em seguida, o cálculo da diferença de peso úmido e peso seco. A análise química do solo foi realizada por CEIMIC Análises Ambientais Ltda., São Paulo-SP. 3.3 Processamento do solo e contagem dos microrganismos As amostras do solo tratado com óleo vegetal residual foram tamizadas em peneira de aço (malha 2 mm). Foram preparadas diluições decimais seriais da amostra do solo: cinco gramas do solo foram adicionadas a 495 ml de água destilada (diluição 10-2) e a mistura foi homogeneizada em blender de aço estéril por 5 minutos. Demais diluições em série foram feitas, adicionando 10 mL da diluição anterior a 90 mL de água destilada e agitando em shaker a 200 rpm por 15 min. A semeadura ocorreu em profundidade, onde alíquotas de 1 mL de cada diluição foram adicionadas a placas de Petri, em triplicatas, juntamente com os meios de cultivo sólidos específicos. Foram utilizados os seguintes meios: - Meio para bactérias totais: Caldo Triptico de Soja (TSA) (Biobras); - Meio para bactérias lipolíticas (BL): extrato do solo (100mL/L), uréia (0,2g/L), ágar (15g/L), micostatina (50mg/ml), óleo de girassol emulsificado (0,1%); pH 7,0 (TSAO, 1970); -Meio para actinomicetos lipolíticos (AL): uréia (0,2g/L), ágar (15g/L), micostatina (50mg/ml), óleo de girassol emulsificado (0,1%); pH 7,0 (TSAO, 1970). As placas foram incubadas a 30°C, em estufa bacteriológica. A contagem das colônias foi realizada após 4 dias de incubação e o número de bactérias foi expresso em UFC/g do solo seco. Todo o material utilizado (frascos, meios de cultura, soluções) foi previamente esterilizado em autoclave a 121 °C, por 15 min. 3.4 Isolamento e purificação dos microrganismos Após o período de incubação e contagem nas placas de Petri, as bactérias provenientes do solo tratado com óleo vegetal foram isoladas dos meios TSA, BL e AL. As linhagens bacterianas foram purificadas no meio completo (ALEF, 1995) composto de: glicose – 0,5g/L; extrato de levedura – 0,5g/L; peptona – 0,5g/L; casamino acids – 0,5g/L; amido – 0,5g/L; piruvato de sódio– 0,3g/L; K2PO4 – 0,3g/L; MgSO47H2O – 0,05g/L; ágar – 15g/L). As linhagens foram estocadas no meio completo semi-sólido, no meio caldo nutriente (NB) semi-sólido e em água destilada, sendo mantidas sob refrigeração a 4°C. 3.5 Caracterização Morfofisiológica e Bioquímica das Bactérias As linhagens bacterianas foram caracterizadas utilizando método de coloração de Gram, teste de formação de endosporos e teste de produção de catalase. 3.5.1 Coloração de Gram A coloração de Gram foi realizada pelo método de Huecker (SMIBERT; KRIEG, 1994) modificado. As lâminas devidamente coradas foram observadas em microscópio óptico, na objetiva de imersão (100x). As bactérias Gram positivas adquiriram cor púrpura, enquanto as Gram negativas apresentaram coloração cor-de-rosa. 3.5.2 Presença de endosporos A presença de endosporos foi determinada de acordo com o método de Gerhardt et al. (1994). As linhagens foram cultivadas por 7 dias em estufa a 30oC. Uma alçada da cultura bacteriana foi transferida para eppendorf contendo 1 ml de água destilada, o qual foi incubado a 80oC por 15 minutos. Da suspensão de células aquecida, 350 µL foram transferidos à placa de Petri. Em seguida, foi adicionado à mesma o meio contendo: caldo nutriente (8g/L), MgSO4.7H20 0,5 M (2mL/L), CaCl2 1M (0,7 mL), MnCl2.4H2O 0,1M (0,5 mL), ágar (15 g/L). As placas foram incubadas por 7 dias em estufa a 30oC e o crescimento bacteriano indicou a formação de endosporos. 3.5.3 Prova de catalase Teste de catalase foi realizado de acordo com Smibert e Krieg (1994). Uma alçada da cultura bacteriana pura, de 24 horas, foi adicionada a uma gota de peróxido de hidrogênio 3%, em uma lâmina de vidro. A linhagem catalase positiva foi indicada pelo aparecimento de bolhas, metabolismo oxidativo (desprendimento de O2). O não aparecimento de bolhas indicou a linhagem como catalase negativa. 3.6 Análise da atividade lipolítica de bactérias 3.6.1 Produção de lipases no meio sólido (análise quantitativa) 3.6.1.1 Teste no meio sólido com tributirina Para uma seleção preliminar de cepas lipolíticas, 66 linhagens bacterianas foram analisadas quanto à produção de lipases em placas de Petri contendo o meio de cultura composto por: tributirina (10ml/L), peptona (5g/L), extrato de levedura (3g/L) e ágar (15g/L), em pH 7,5. As placas foram incubadas a 30ºC por 4 dias. As linhagens com atividade lipolítica promoveram a hidrólise da tributirina, levando a formação de um halo transparente ao redor da colônia. 3.6.1.2 Teste no meio sólido com rodamina B As 66 linhagens bacterianas foram incubadas no meio contendo o corante rodamina B (0.001% m/v), caldo nutriente (8 g/l), ágar (10 g/l), NaCl (4 g/l) e 3% (v/v) de Azeite de Oliva (Vale Fértil) ou óleo se soja (Soya) (KOUGER; JAEGER, 1987). A análise foi realizada em diferentes pHs do meio (6,0, 7,0 e 8,0). As placas foram incubadas a 30°C por 4 dias. A produção de lipase foi evidenciada pela formação de um halo alaranjado fluorescente, monitorado pela irradiação das placas com UV a 350 nm (Figura 07) (SHELLEY et al., 1987). 3.6.2 Produção de lipases no meio líquido (análise quantitativa) As 25 linhagens que apresentaram atividade lipolítica no meio contendo azeite de oliva e rodamina B foram selecionadas para determinação da atividade lipolítica e dosagem de proteínas totais e de biomassa. 3.6.2.1 Cultivo das bactérias A análise quantitativa da atividade lipolítica das linhagens selecionadas foi avaliada em quatro meios com composição diferenciada, em pH 7,0: a) Meio I (Caldo Nutriente com azeite de oliva - 1%); b) Meio II (Caldo Nutriente com óleo de soja - 1%); c) Meio III (meio mineral Bushnell Haas com glicerol - 1%, azeite de oliva - 1%); d) Meio IV (meio mineral Bushnell Haas com glicose – 1%, azeite de oliva -1%). As linhagens foram previamente cultivadas em tubos contendo 10 mL de cada um dos meios líquidos, em uma incubadora com agitação (150 rpm) a 30°C por 24 horas. Uma alíquota de 1mL de cada cultura foi colocada em erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL de cada meio. A incubação foi realizada sob agitação durante 48 horas, a 150 rpm e temperatura de 30oC. Cada uma das culturas foram centrifugadas a 8000 rpm por 15 minutos. O sobrenadante obtido utilizado para dosagem de proteínas e quantificação de lipases pelo método titulométrico, enquanto que os precipitados foram utilizados para determinar o peso seco das células bacterianas. 3.6.2.2 Concentração de proteínas A quantidade total de proteínas no sobrenadante foi determinada pelo método de Bradford (BRADFORD, 1976), utilizando albumina sérica bovina como padrão, nas concentrações 20, 40, 60, 80 e 100 µg/µL. 3.6.2.3 Determinação da biomassa (massa celular seca) Para este fim foi utilizado o precipitado de cada cultura, proveniente da centrifugação a 8000 rpm por 15 minutos. A massa celular foi transferida para placa de Petri e pesada, após secagem em estufa a 105oC por 24 horas. 3.6.2.4 Quantificação da atividade lipolítica pelo método titulométrico A determinação da atividade lipolítica por titulometria foi baseada no método proposto por Stuer et al. (1986), com modificações. A análise foi realizada utilizando 1 mL do sobrenadante da amostra, 5 mL de emulsão contendo 50 mL azeite de oliva ou óleo de soja, 50 mL de goma arábica 7% (m/v) e 2 mL de tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 7,0. A mistura foi agitada no vórtex por 1 minuto e incubada por 20 minutos a 30oC em banhomaria. A reação foi finalizada pela adição de 10 mL de uma mistura de etanol e acetona (1:1). Os ácidos graxos formados pela hidrólise dos triacilgliceróis presentes na emulsão foram quantificados pela titulação com NaOH 0,025N, utilizando fenolftaleína (1%) como indicador. Para o controle, o sobrenadante de amostra foi substituído por 1 mL de água destilada. Uma unidade de atividade enzimática (1U) foi definida como a quantidade de enzima que produz 1μmol de ácido graxo por minuto de reação, nas condições do ensaio. As atividades foram expressas em 1U/mL = 1μmoles/mL.min e calculadas de acordo com a equação: Atividade lipolítica total (U/mL) = onde: Va = volume de NaOH gasto na titulação da amostra (mL); Vb = volume de NaOH gasto na titulação do branco (mL); N = normalidade da solução de NaOH (mol/L); t = tempo de reação (minutos). A atividade lipolítica específica foi expressa em U/mg de células, utilizando os dados da atividade total e de biomassa de bactérias. 3.6.3 Efeito do pH e da temperatura na atividade lipolítica analisado pela Metodologia de Superfície de Resposta A metodologia de superfície de resposta foi utilizada para analisar o efeito do pH e da temperatura na atividade lipolítica. Os efeitos da temperatura e do pH sobre a atividade lipolítica da linhagem O19 foram avaliados utilizando a metodologia de superfície de resposta do software Statistica (Experimental Desing). Foi adotada a metodologia do planejamento de experimentos empregando uma matriz 22 com três pontos centrais (Tabela 02) (BARROS NETO, 2007). O modelo do experimento utilizado para estabelecer as condições ótimas da atividade de lipases (pH e temperatura) consistiu em 11 ensaios, 8 combinações únicas e 3 replicações no ponto central (pH 8,5 e 50oC) (Tabela 03). A linhagem O19 foi cultivada em erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL do meio caldo nutriente (NB), em incubadora com agitação (150 rpm) a 30°C por 48 horas. O sobrenadante livre de células foi obtido da cultura por centrifugação a 8000 rpm por 15 minutos. A atividade lipolítica total do sobrenadante foi analisada por titulometria, como foi descrita no item 3.6.2.4. Entretanto foram utilizadas diferentes condições de temperatura e pH, conforme a Tabela 03. O sobrenadante da linhagem O19 (1 mL) foi incubado em banhomaria por 20 minutos junto com 5 mL de emulsão contendo 50 mL óleo de oliva, 50 mL de goma arábica 7% (m/v) e 2 mL de tampão, em diferentes pHs (7,0 – tampão fosfato de sódio 0,1M; 7,4 – tampão fosfato de sódio 0,1M; 8,5 – tampão glicina 0,1M; 9,4 e 10,0 tampão glicina 0,1M) e temperaturas (30 oC, 35,9oC , 50,0 oC, 64,1 oC ou 70 oC). Tabela 02 - Níveis das variáveis utilizadas no experimento quanto ao efeito da temperatura e do pH sobre a atividade lipolítica. Níveis Variáveis -α (-√2) -1 0 1 +α (√2) Xtemp(oC) 30,0 35,9 50 64,1 70,0 XpH 7,0 7,4 8,5 9,6 10,0 Tabela 03 - Valores reais e respectivos valores codificados para as variáveis (temperatura e pH) analisadas. Temperatura oC pH Experimentos V.codificado V. real V. codificado V. real 1 +1 64,1 +1 9,6 2 +1 35,9 -1 9,6 3 -1 64,1 +1 7,4 4 -1 35,9 -1 7,4 5 0 70,0 +α 8,5 6 0 30,0 -α 8,5 7 +α 50,0 0 10,0 8 -α 50,0 0 7,0 9 0 50,0 0 8,5 10 0 50,0 0 8,5 11 0 50,0 0 8,5 A análise dos resultados foi feita utilizando o software Statistica (Experimental Design). Os resultados foram apresentados em gráficos de superfície de resposta. O efeito de cada fator e das suas interações foi obtido com ANOVA (95% e 99%). 3.7 Análise de produção de biossurfactantes por bactérias 3.7.1 Teste de emulsificação As 66 linhagens bacterianas foram analisadas quanto a emulsificação do óleo diesel sem aditivos, de acordo com os métodos descritos por Batista et al. (2006), Das et al. (1998) e Gaylarde (2000). As mesmas foram incubadas a 30 oC por 5 dias em tubos de ensaio com 10 ml do meio NB contendo azeite de oliva (1%). Após o cultivo, foram retirados 2 ml de cada cultura e transferidos para um tubo de ensaio adicionando 2 ml de óleo diesel. Os tubos foram agitados em vórtex por 2 minutos e deixados em repouso durante 5 minutos (E5 – índice de emulsificação após 5 minutos) e 24 horas (E24 – índice de emulsificação após 24 horas). Os índices de emulsificação E5 e E24 foram calculados dividindo a altura da camada emulsificada (mm) pela altura total da coluna (mm) e expressa em %. A razão entre o índice E24 e E5 serviu para calcular a estabilidade do emulsificante, sendo também expressa em %. Para verificar se no processo de emulsificação foram envolvidos os biossurfactantes intracelulares ou extracelulares, centrifugou-se a cultura bacteriana por 10 minutos a 6000 rpm (temperatura ambiente) para obter o sobrenadante livre de células. A emulsificação do óleo diesel por sobrenadante livre de células foi verificada seguindo a técnica descrita acima, para as culturas bacterianas. Todos os experimentos foram realizados em duplicata e como controle foi utilizado 1% SDS em água deionizada. 3.7.2 Método de dispersão do óleo diesel As linhagens utilizadas para análise de dispersão foram cultivadas conforme o item 3.7.1. Seguindo a metodologia descrita por Bodour et al. (1998) e Youssef et al. (2004), o teste foi realizado utilizando, para cada linhagem, uma placa de Petri (140 mm de diâmetro) com 35 mL de água e 100µL de óleo diesel colocado na superfície de água. O volume de 10µL da cultura bacteriana foi adicionado na superfície de óleo e a formação de uma zona clara indicou o tamanho da zona de dispersão, a qual foi medida em mm. 3.7.3 Atividade hemolítica As linhagens utilizadas para análise da atividade hemolítica foram cultivadas em placas de Petri no meio NB por 48 horas (30oC). Em seguida, as mesmas foram inoculadas, em placa de Petri, no meio Ágar Sangue (Difco) com 5% de sangue de coelho desfibrinado e incubadas a 30ºC por 48 horas. Após esse período, as linhagens foram observadas. A presença de um halo claro ao redor das colônias indicou a produção de biossurfactantes. Os halos hemolíticos foram medidos em mm. 3.7.4 Seleção de linhagens produtoras de ramnolipídeos As linhagens que apresentaram atividade hemolítica foram submetidas à análise da produção de ramnolipídeos. Inicialmente, as linhagens foram incubadas no meio NB com azeite de oliva 1%, a 30oC, 150 rpm por 48 horas. Em seguida, 3 µL da cultura ou do sobrenadante foram colocados dentro de poços perfurados no meio contendo a seguinte composição (g/L): NH4Cl2 – 1,49; KCl- 1,07; Tris-HCl – 18,91; MgSO4 - 0,19; glicose – 5,0; peptona – 10,0; brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB) - 0,2; azul de metileno - 0,005; ágar 20g; e pH 7,0 ± 0,2 (SIEGMUND; WAGNER, 1991). A produção de ramnolipídeos foi detectada através da formação de um halo azulado ao redor da colônia, após a incubação das linhagens em estufa a 30oC por 21 dias. 3.8 Caracterização molecular das linhagens bacterianas 3.8.1 Extração do DNA bacteriano Seis linhagens bacterianas, que apresentaram maior atividade lipolítica total, foram selecionadas para extração de DNA genômico, utilizando o método de Cheng e Jiang (2006) modificado. As bactérias foram crescidas em 10 mL de meio NB e incubadas no shaker a 30°C, 150 rpm, por um período de 24 horas. Esse volume foi centrifugado a 6.000 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, o precipitado foi ressuspendido em 0,5 mL de tampão TE (Tris-HCl-EDTA) e armazenado a -20°C. O material foi centrifugado a 12.000 rpm por 5 minutos a temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspendido em 400 µL de tampão de lavagem STE e centrifugado a 12000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado foi ressuspendido em 200 µL de tampão TE, seguido da adição de 200 µL de pérolas de vidro e de 200 µL de fenol saturado (pH 8,0), sendo levado ao vórtex por 90 segundos e, em seguida, centrifugado a 12000 rpm por 5 minutos. Da fase superior, 160 µL foram transferidos para um novo eppendorff e 40 µL de TE e 100 µL de clorofórmio foram adicionados ao mesmo, misturando-se bem para fazer uma emulsão, seguido de centrifugação a 12000 rpm por 5 minutos. Em seguida, 160 µL da fase superior foi transferida para um novo eppendorff, seguida da adição de 40µL de TE e 5 µL de RNAse, com incubação a 37oC por 10 minutos. Posteriormente, foram adicionados 100 µL de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1), misturando bem. Após centrifugação a 12.000 rpm por 5 minutos a 4°C, 150 µL da fase superior, contendo DNA, foi removida para um novo eppendorff e estocada a -20°C. 3.8.2 Quantificação do DNA As amostras de DNA foram quantificadas utilizando aparelho NanoDrop Spectrophotometer ND-1000 UV/Vis (USA), que determinou a concentração do DNA em ng/μL no comprimento de onda de 260 nm e estabeleceu o grau de pureza da amostra pela razão entre os valores dos comprimentos de onda 260 nm / 280 nm. 3.8.3 Amplificação do gene rRNA 16S Os genes rRNA 16S para o domínio Bacteria foram amplificados utilizando os seguintes primers universais: forward 26F : 5′- GAG TTT GAT CMT GGC TCA G - 3′ reverse 1492R: 5′ - ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT - 3′ Para a reação da PCR foi utilizado kit IllustraTM PureTaqTM Ready-To-GoTM PCR beads (GE Healthcare, Reino Unido), segundo as instruções do fabricante. A amplificação ocorreu em termociclador (Primus, EUA) com as seguintes etapas: 94°C por 5 min, 25 ciclos (94°C por 1 min, 55°C por 2 min e 72°C por 2 min), extensão final a 72°C por 10 min e manutenção a 4ºC por no mínimo 15 min. As amostras foram estocadas a –20ºC. O DNA amplificado foi examinado por eletroforese em gel de agarose 0,8% submerso em tampão TAE (Tris-Acetato-EDTA), contendo GelRed (0,1 μL/mL). Foi utilizado o padrão de peso molecular de 100 bp (Axygen Biosciences). 3.8.4 Análise de restrição do rDNA 16S amplificado Os fragmentos de DNA amplificados foram submetidos à digestão com três enzimas de restrição: Taq I, Hpa II, Hae III. As digestões foram realizadas durante 3 horas de incubação a 37ºC (Hpa II, Hae III) e a 65ºC (Taq I), em um volume de 50µL contendo, 10 µL do produto da PCR, 5U (unidades) da enzima de restrição, 5µL do tampão 10x correspondente e água Milli – Q estéril (q.s.p. 50 µL). Os padrões dos fragmentos gerados foram analisados por meio da eletroforese em gel de agarose 2%, contendo GelRed (0,1 μL/mL), submerso em tampão TAE (Tris-AcetatoEDTA) (80 V). O gel resultante foi fotografado e os padrões de bandas foram analisados. 3.8.5 Purificação e sequenciamento do rDNA 16S Na base dos resultados do RFLP do rDNA 16S foram selecionadas duas linhagens para o seqüenciamento parcial do rDNA 16S. O produto amplificado conforme o item 3.8.3 foi purificado utilizando o kit AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante. O sequenciamento das amostras foi realizado pela empresa ACTGene Análises Moleculares Ltda. (Centro de Biotecnologia, UFRGS, Porto Alegre, RS) utilizando o sequenciador automático ABI-PRISM 3100 Genetic Analyzer armado com capilares de 50 cm e polímero POP6 (Applied Biosystems). Os DNA-moldes (30 a 45 ng) foram marcados utilizando-se 3,2 pmol dos primers (26F: 5′- GAG TTT GAT CMT GGC TCA G - 3′; 1492R: 5′ - ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT - 3′) e 3 L do reagente BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing RR-100 (Applied Biosystems) em um volume final de 10L. As reações de marcação foram realizadas em termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) com uma etapa de desnaturação inicial a 96 ºC por 3 min seguida de 25 ciclos de 96ºC por 10 seg, 55ºC por 5 seg e 60ºC por 4 min. Uma vez marcadas, as amostras foram purificadas pela precipitação com isopropanol a 75% e lavagem com etanol a 60%. Os produtos precipitados foram diluídos em 10L de formamida Hi-Fi (Applied Biosystems), desnaturados a 95ºC por 5 min, resfriados em gelo por 5 min e eletroinjetados no sequenciador automático. Os dados de sequenciamento foram coletados utilizando-se o programa Data Collection v 1.0.1 (Applied Biosystems) com os parâmetros Dye Set “Z”; Mobility File “DT3100POP6{BDv3}v1.mob”; BioLIMS Project “3100_Project1”; Run Module 1 “StdSeq50_POP6_50cm_cfv_100”; e Analysis Module 1 “BC- 3100SR_Seq_FASTA.saz”." As seqüências geradas foram submetidas à consulta de similaridade de nucleotídeos, com seqüências depositadas no banco de dados GenBank acessado através do site do NCBI (National Center for Biotecnology Information). A ferramenta utilizada para esta consulta foi o BLAST - “Basic Local Alignment Search Tools” (ALTSCHUL et al., 1997), realizada em 18/01/2012. As sequencias com mais de 97% de similaridade foram consideradas válidas. 3.9 Processamento e análise de dados Os resultados das determinações de atividade lipolítica total, atividade específica, biomassa e proteínas totais, das linhagens bacterianas cultivadas em diferentes meios, foram avaliados através de análise de variância (ANOVA) e as médias foram comparadas através do teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade. O procedimento foi realizado utilizando o programa GraphPad InStat, v.2.01. Foram calculados também os coeficientes de correlação entre a produção de lipases e emulsificação do óleo, dispersão do óleo e hemólise. RESULTADOS 4 RESULTADOS 4.1 Características físico-químicas e microbiológicas do solo A análise do solo tratado com óleo vegetal residual comparado com o mesmo solo sem tratamento, permitiu observar que a adição do óleo gerou alterações na umidade, no pH, na concentração de matéria orgânica e de vários macro e microelementos no solo tratado (Tabela 04). O solo utilizado para o descarte do óleo vegetal apresentou umidade baixa, pH ácido e maior quantidade da matéria orgânica em comparação ao solo sem adição do óleo. O teor de sódio, alumínio e magnésio diminuiu drasticamente após o tratamento do solo com óleo vegetal residual, enquanto foi observado um aumento do teor de fósforo, cobre e cálcio (Tabela 04). Tabela 04 - Parâmetros físico-químicos do solo tratado com óleo vegetal residual e do solo não tratado, da área experimental (Jacarapé, PB). Solo tratado com óleo Solo sem tratamento 1 % 0,4 1,1 2 4 5 3,87 3 dag/kg* 11,04 31 0,5 5,92 2,13 79 50,6 6 7 3** mg/dm 3,0 0,37 1,7 0,07 8 9 35,1 10 11 3*** cmolc/dm 3,16 0,06 0 27,7 0,26 0,82 1,17 1 Umidade; 2 pH em água; 3 Matéria orgânica; 4 K; 5 Na; 6 P; 7 Cu; 8 Fe; 9 Al; 10 Mg2+; 11 Ca2+. * decagrama por quilograma; ** miligrama por decímetro cúbico; *** centimol de carga por decímetro cúbico As contagens de microrganismos do solo contaminado com óleo vegetal residual diferiram de acordo com o meio de cultura. No meio para bactérias totais (Caldo Triptico de Soja - TSA), foi observado maior número de bactérias (3,37x107 UFC/g) em comparação com outros meios. No meio para bactérias lipolíticas (BL) e no meio para actinomicetos lipolíticos (AL), o valor médio de bactérias foi de 3,92x106 UFC/g e de 6,0x105 UFC/g, respectivamente (Tabela 05). Tabela 05 – Contagem de bactérias nos meios para bactérias totais (TSA), bactérias lipolíticas (BL) e actinomicetos lipolíticos (AL) do solo contaminado com óleo vegetal residual. Meio TSA BL AL UFC/g 3,37 x 107 3,92 x 106 6,00 x 105 4.2 Caracterização Morfofisiológica das Bactérias Com base nas características morfofisiológicas, as 66 linhagens bacterianas isoladas do solo utilizado para o descarte do óleo vegetal, foram agrupadas em 7 biotipos (Tabela 06). O biotipo F, composto por bastonetes Gram-negativos, catalase positivos, foi predominante, apresentando o maior número de linhagens (53,7%) (Figura 09). Com 22 linhagens (33,3%), o biotipo A foi o segundo que mais se destacou, agrupando bastonetes Gram-positivos com endosporos, catalase positivos (Figuras 08 e 11). O biotipo C, com quatro linhagens (6,0%), englobou os bastonetes Gram-positivos, sem endosporos, catalase positivos. Apresentando duas linhagens (3,0%), o biótipo E compreendeu as bactérias filamentosas Gram-positivas com esporos (actinomicetos) (Figura 10). Os biótipos B, D e G foram representados apenas por uma linhagem cada. . Tabela 06 – Biotipos das linhagens bacterianas isoladas do solo contaminado com óleo vegetal residual Biotipo Características morfofisiológicas Linhagens O1, O3, O12, O14, O16, O18, O25, O26, O27, O31, O34, O37, O38, O39, O40, O42, O43, O44, O46, O48, O59, O65 Biotipo A Bastonetes Gram + com endosporos, catalase + Biotipo B Bastones Gram + com endosporos, catalase - O63 Biotipo C Bastonetes Gram + sem endosporos, catalase + O13, O21, O30, O64 Biotipo D Cocos Gram + sem endosporos, catalase + O29 Biotipo E Filamentosos Gram + com esporos O28, O49 Biotipo F Bastonetes Gram - , catalase + Biotipo G Bastonetes catalase - Gram -, Total 22 (33%) 01 (1,5%) 04 (6%) 01 (1,5%) 02 (3%) O2, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O15, O17, O19, O20, O22, O23, O24, O32, O33, O35, O36, O41, O45, O47, O50, O51, O52, O53, O54, O56, O57, O58, O60, O61, O62, O66 35 (53,7%) O55 01 (1,5%) Figura 08 - Fotomicrografia das células da linhagem O1 (Biotipo A). Figura 09 - Fotomicrografia das células da linhagem O23 (Biotipo F) Fonte: Laís Campos. Fonte: Laís Campos. Figura 10 - Fotomicrografia das células da linhagem O28 (Biotipo E) Figura 11 - Fotomicrografia das células da linhagem O16 (Biotipo A) endosporo Fonte: Laís Campos. Fonte: Laís Campos. 4.3 Atividade lipolítica de bactérias 4.3.1 Análise qualitativa da produção de lipases As 66 linhagens bacterianas foram analisadas inicialmente no meio ágar tributirina (pH 7,5, 30oC). Todas elas foram capazes de hidrolisar a tributirina, sendo que 63 linhagens demonstraram atividade lipolítica após 48 horas de cultivo, e três linhagens após 96 horas (Tabela 07). A Figura 12 mostra as linhagens positivas no teste de hidrólise de tributirina. A Tabela 08 e a Figura 14 mostram os dados da atividade lipolítica de bactérias no meio com rodamina B e azeite de oliva ou óleo de soja em diferentes pHs. No meio contendo o corante rodamina B e azeite de oliva (Figura 13), em pH 6,0, 7,0 e 8,0, o percentual de linhagens que apresentaram atividade lipolítica foi de 31,8, 37,8 e 37,8, respectivamente. Quando cultivadas no meio contendo rodamina B e óleo de soja, nos pHs 6,0, 7,0 e 8,0, o percentual de linhagens com atividade lipolítica foi de 31,3, 37,8 e 36,3, respectivamente. Figura 12 – Cultura das linhagens bacterianas no meio ágar tributirina. As linhagens produtoras de lipase (O2, O4 e O5) apresentaram um halo transparente ao redor da colônia. Fonte: Laís Campos. Tabela 07– Atividade lipolítica das linhagens bacterianas no meio ágar tributirina após 48 e 96 horas de cultivo. Linhagens O1 48 horas ++++ * 96 horas ++++ O2 ++ +++ O3 ++++ ++++ O4 ++ +++ O5 ++ +++ O6 ++ +++ O7 ++ +++ O8 ++ +++ O9 +++ +++ O10 ++ +++ O11 ++ ++ O12 ++ ++ O13 +++ ++++ O14 ++ ++ O15 +++ ++++ O16 ++ ++++ O17 ++ +++ O18 ++ ++++ O19 +++ ++++ O20 +++ ++++ O21 ++ ++++ O22 ++ ++++ O23 ++ +++ O24 ++ +++ O25 +++ ++++ O26 ++ ++ O27 ++++ ++++ O28 + ++ O29 ++ ++ O30 ++ +++ O31 +++ ++++ O32 +++ ++++ O33 ++ +++ O34 ++ ++++ O35 +++ +++ O36 ++ ++ O37 ++ +++ O38 + +++ O39 +++ ++++ O40 + ++++ O41 +++ +++ O42 ++ ++++ O43 ++ ++ O44 ++ ++++ O45 ++ +++ O46 ++ ++++ O47 +++ ++++ O48 + ++ O49 + ++ O50 ++ +++ O51 + ++ O52 ++ +++ O53 ++++ ++++ O54 ++ +++ O55 + ++ O56 ++ +++ O57 ++++ ++++ O58 ++ ++++ O59 + +++ O60 - + O61 ++ +++ O62 ++ ++++ O63 - +++ O64 ++ ++++ O65 +++ ++++ O66 + ++ * diâmetro do halo; +: 0,5cm - 1,0cm; ++: 1,1cm – 2,0cm; +++: 2,1cm – 3,0cm; ++++: > 3,0 cm. - ausência de halo Figura 13 – Cultura das linhagens bacterianas no meio contendo azeite de oliva e rodamina B, em pH 7,0. As linhagens O2, O4, O5 e O7 apresentaram halo fluorescente, sendo positivas quanto à produção de lipases. A linhagem O35 não apresentou atividade lipolítica. Fonte: Laís Campos. Figura 14 – Percentual de linhagens bacterianas que apresentaram atividade lipolítica em meios com rodamina B e azeite de oliva ou óleo de soja, em diferentes pHs. 39,00% Percentual das linhagens (%) 38,00% 37,00% 36,00% 35,00% pH 6,0 34,00% pH 7,0 33,00% pH 8,0 32,00% 31,00% 30,00% 29,00% 28,00% Azeite de oliva Óleo de soja Tabela 08 – Atividade lipolítica das linhagens bacterianas analisadas no meio de cultura contendo rodamina B e azeite de oliva ou óleo de soja em diferentes pHs. Linhagens O1 pH 6,0 Azeite de Oliva - Óleo de Soja - pH 7,0 Azeite de oliva - Óleo de soja - pH 8,0 Azeite de Oliva - Óleo de soja - O2 +++ +++ ++++ +++ ++ ++ O3 - - - - - - O4 +++ +++ ++++ +++ + +++ O5 +++ +++ ++++ +++ +++ +++ O6 +++ ++++ ++++ +++ ++++ +++ O7 +++ ++ ++++ +++ ++++ ++++ O8 +++ +++ ++++ ++++ ++++ +++ O9 - - - - - - O10 - - - - - - O11 - - - - - - O12 - - - - - - O13 +++ +++ +++ +++ ++ +++ O14 - - - - - - O15 +++ ++++ ++ +++ ++++ +++ O16 - - - - - - O17 - - +++ +++ ++ ++ O18 - - - - - - O19 ++++ ++++ ++++ ++ ++++ ++++ O20 - - - - - - O21 +++ +++ +++ +++ ++ ++ O22 +++ +++ ++++ +++ ++ + O23 +++ +++ ++++ +++ + + O24 - - - - - - O25 - - - - - - O26 - - - - - - O27 - - - - - - O28 - - - - - - O29 - - - - - - O30 +++ ++++ +++ +++ + - O31 - - - - - - O32 - - - - - - O33 - - - - - - O34 - - - - - - O35 - - - - - - O36 - - - - - - O37 - - - - - - O38 - - - - - - O39 - - - - - - O40 - - - - - - O41 - - - - - - O42 - - - - - - O43 - - - - - - O44 - - - - - - O45 +++ +++ ++++ +++ +++ +++ O46 - - - - - - O47 +++ +++ ++++ ++++ + + O48 - - - - - - O49 - - - - - - O50 +++ +++ +++ - +++ ++ O51 - - - + - - O52 +++ +++ +++ ++ +++ ++ O53 - - - - - - O54 - - ++++ +++ +++ ++ O55 - - - - - - O56 - - ++++ ++ ++ +++ O57 - - ++++ +++ ++ ++ O58 +++ +++ +++ ++ ++ +++ O59 - - - - - - O60 - - - - - - O61 - - - - - - O62 +++ +++ ++++ +++ +++ +++ O63 - - - - - - O64 +++ +++ +++ ++ + + O65 +++ ++ +++ ++ +++ +++ O66 - - - - - - * diâmetro do halo; +: 0,5cm - 1,0cm; ++: 1,1cm – 2,0cm; +++: 2,1cm – 3,0cm; ++++: > 3,0cm. - ausência de halo. 4.3.2 Análise quantitativa da produção de lipases As 25 linhagens que apresentaram produção de lipases no meio sólido com azeite de oliva e rodamina B foram selecionadas para análise quantitativa da atividade lipolítica nas condições de pH 7,0 e temperatura 30oC. Quando as culturas bacterianas foram incubadas no meio caldo nutriente contendo azeite de oliva, as linhagens que apresentaram maior atividade lipolítica foram O19, O17 e O45, com 12,4 U/mL/min, 10,7 U/mL/min e 10,5 U/mL/min, respectivamente (Tabela 09). Os valores de biomassa variaram entre 1,5 mg/mL (O56) e 3,9 mg/mL (O19). A atividade lipolítica específica das bactérias ficou entre 0,21 U/mg (O56) e 4,96 U/mg de células (O19) (Tabela 09). Quanto às proteínas totais ocorreu uma variação de 0,010 mg/mL (O30, O50) a 0,088 mg/mL (O19, O22) (Tabela 09). Das 25 linhagens testadas foram selecionadas seis linhagens mais ativas: O17, O19, O22, O23, O45 e O62 para analisar o efeito do meio de cultivo na atividade lipolítica (meio NB com óleo de soja e meio mineral com azeite de oliva e glicerol ou glicose). O tipo do meio influenciou significativamente (p<0,01) a atividade lipolítica total e específica, biomassa e a quantidade de proteínas. No meio NB com óleo de soja, apenas três linhagens (O17, O19 e O22) apresentaram atividade lipolítica, com destaque para a linhagem O19 (7,2 U/mL/min) (Tabela 10). A mesma também apresentou maior teor de proteína total, 0,088 mg/mL. A biomassa variou de 2,3 mg/mL (O22) a 3,2 mg/mL (O19, O62). A maior atividade específica, 2,44 U/mg de células, foi da linhagem O17 (Tabela 10). Quando as linhagens foram cultivadas no meio mineral com glicerol e azeite de oliva apenas a O19 apresentou atividade lipolítica, embora todas as linhagens tenham apresentado crescimento (Tabela 11). Entretanto, no meio mineral com glicose e azeite de oliva, apenas a linhagem 062 apresentou atividade lipolítica. As outras cinco linhagens não apresentaram crescimento (Tabela 12). O meio de cultivo com NB e azeite de oliva foi o que proporcionou às linhagens uma maior atividade lipolítica (total e específica) com destaque para a linhagem O19 (Tabela 09) (Figuras 15 e 16). Tabela 09 – Atividade lipolítica total e específica, biomassa e proteínas totais de linhagens bacterianas cultivadas no meio NB com azeite de oliva. Linhagens Atividade específica (U/mg de células) 0,69 Biomassa* (mg/mL) O2 Atividade total (U/mL/min) 2,5 3,6 Proteínas totais (mg/mL) 0,038 O4 2,25 0,75 3,0 0,036 O5 3,75 1,04 3,6 0,014 O6 2,0 0,55 3,6 0,028 O7 0,62 0,28 2,2 0,015 O8 0,62 0,28 2,2 0,014 O13 0,87 0,37 2,3 0,038 O15 2,12 1,06 2,0 0,035 O17 10,7 3,96 2,7 0,063 O19 12,4 4,96 2,5 0,088 O21 1,12 0,46 2,4 0,033 O22 8,7 2,9 3,0 0,088 O23 9,7 4,04 2,4 0,070 O30 0,68 0,29 2,3 0,010 O45 10,5 3,6 2,9 0,069 O47 3,5 2,33 1,5 0,011 O50 2,37 0,91 2,6 0,010 O52 2,75 1,05 2,6 0,032 O54 2,25 0,64 3,5 0,029 O56 1,06 0,27 3,9 0,049 O57 0,81 0,31 2,6 0,011 O58 1,25 0,48 2,6 0,041 O62 8,9 3,06 2,9 0,077 O64 4,5 2,04 2,2 0,012 O65 2,12 0,96 2,2 0,018 *Peso seco de células bacterianas Tabela 10 – Atividade lipolítica total e específica, biomassa e proteínas totais de linhagens bacterianas cultivadas no meio NB com óleo de soja. Linhagens Atividade específica (U/mg de células) 2,44 Biomassa* (mg/mL) O17 Atividade total (U/mL/min) 6,1 2,5 Proteínas totais (mg/mL) 0,083 O19 7,2 2,25 3,2 0,088 O22 4,5 1,95 2,3 0,070 O23 0 - 2,4 0,010 O45 0 - 2,7 0,010 O62 0 - 3,2 0,014 *Peso seco de células bacterianas Tabela 11 – Atividade lipolítica total e específica, biomassa e proteínas totais de linhagens bacterianas cultivadas no meio mineral azeite de oliva e glicerol. Linhagens Atividade específica (U/mg de células) - Biomassa* (mg/mL) O17 Atividade total (U/mL/min) 0 0,3 Proteínas totais (mg/mL) 0,004 O19 1,0 1,42 0,7 0,075 O22 0 - 0,4 0,029 O23 0 - 0,2 0,012 O45 0 - 0,6 0,038 O62 0 - 0,4 0,014 *Peso seco de células bacterianas Tabela 12 – Atividade lipolítica total e específica, biomassa e proteínas totais de linhagens bacterianas cultivadas no meio mineral com azeite de oliva e glicose. Linhagens Atividade específica (U/mg de células) - Biomassa* (mg/ml) O17 Atividade total (U/mL/min) 0 - Proteína totais (mg/ml) 0 O19 0 - - 0 O22 0 - - 0 O23 0 - - 0 O45 0 - - 0 O62 0,93 1,03 0,9 0,009 *Peso seco de células bacterianas Figura 15 – Atividade lipolítica total das bactérias no meio caldo nutriente (NB) e meio mineral (MM) com diferentes substratos. 14 Atividade total (U/mL/min) 12 10 8 NB + azeite NB + óleo de soja 6 MM + azeite e glicerol 4 MM + azeite e glicose 2 0 O17 O19 O22 O23 O45 O62 Linhagens Figura 16 – Atividade lipolítica específica das bactérias no meio caldo nutriente (NB) e meio mineral (MM) com diferentes substratos. Atividade Específica (U/mg de células) 6 5 4 NB + azeite 3 NB + óleo de soja MM + azeite e glicerol 2 MM + azeite e glicose 1 0 O17 O19 O22 O23 Linhagens O45 O62 4.3.3 Efeito do pH e da temperatura na atividade lipolítica total através da Metodologia de Superfície de Resposta Para análise do efeito do pH e da temperatura na atividade lipolítica, utilizando a metodologia de superfície de resposta, foi selecionada a linhagem O19, que apresentou melhor atividade lipolítica de acordo com os dados obtidos ( item 4.3.2). Os resultados são apresentados na Tabela 13. Tabela 13 – Resultados obtidos pela análise da atividade lipolítica total, da linhagem O19, através do planejamento experimental. Variáveis Experimentos pH Resposta T(oC) Atividade total Atividade total observada (U/mL/min) prevista (U/mL/min) 1 7,4 35,9 10,83 13,54 2 7,4 64,1 10,80 15,06 3 9,4 35,9 6,68 8,57 4 9,4 64,1 13,30 16,74 5 7,0 50,0 13,62 13,92 6 10,0 50,0 8,25 11,68 7 8,5 30,0 7,65 10,40 8 8,5 70,0 16,40 17,98 9 8,5 50,0 15,70 18,19 10 8,5 50,0 15,15 18,19 11 8,5 50,0 15,20 18,19 A análise de variância foi utilizada para verificar se os principais efeitos dos fatores e das interações foram, de fato, significativos. Esta análise também foi utilizada para avaliar numericamente a qualidade de ajuste do modelo obtido a partir dos dados experimentais. O maior valor possível de R2 (coeficiente de determinação) é 1,0 e só ocorrerá se não houver resíduo algum e, portanto, se toda a variação em torno da média for explicada pela regressão. Melhor será o ajuste do modelo aos dados observados quanto mais perto de 1,0 estiver o valor de R2. Baseando-se nisso, os resultados da ANOVA mostrados na Tabela 13 indicam que o modelo polinomial obtido para atividade total tem alto coeficiente de determinação (R2 = 0,91), mostrando bom ajuste com o modelo obtido. A Figura 17 apresenta o Gráfico de Pareto para o efeito das duas variáveis estudadas para a linhagem O19. O eixo Y exibe as variáveis independentes (pH e temperatura) ou as interações entre as variáveis. No eixo X, tem-se o valor absoluto do Efeito Estimado, calculado pela razão entre os efeitos estimados e seus respectivos desvios padrões. Todos os valores que aparecem nos Gráficos de Pareto que se situem à direita do valor p de 0,05 são de elevada significância estatística (estatisticamente significantes). Estes valores concordam com os dados da Tabela 14. Em relação à atividade lipolítica total, a temperatura e pH mostraram os efeitos quadrático e linear significantes na atividade total (p < 0,05) (Tabela 14) (Figura 17). A partir dos dados experimentais mostrados nas Tabelas 12 e 13, o programa Statistica – Experimental Desing gerou a seguinte equação do modelo para os efeitos das diferentes variáveis (pH – x(pH); temperatura – x(Temp)) na atividade lipolítica total (AT): AT = -134.0973 + 34.5596 X(pH) – 2.3919 X2(pH) + 0.1715 X(Temp) – 0.0091 X2(Temp) + 0.1071 X(Temp) X(pH) As Figuras 18 e 19 representam a superfície de resposta e as curvas de nível, respectivamente, para atividade lipolítica total da linhagem testada. A região onde se observa alta atividade lipolítica está localizada em pH 7,5 – 9,0 e temperatura 45oC – 70oC. A maior atividade lipolítica foi prevista para pH e temperatura de 8,5 e 65oC (19,04 U/mL) (Figuras 18 e 19). Tabela 14 – Coeficiente de determinação do modelo polinomial e valor p dos efeitos lineares e quadráticos e a interação da temperatura e pH para a variável atividade lipolítica total. Os valores em negrito são significativos (p < 0,05). Fonte de variação Soma quadrática Grau de liberdade Quadrado Teste F significante (significância do modelo) pH (Quadrático) 10,0153 1 10,01532 108,2737 0,009110* pH (Linear) 36,2952 1 36,29519 392,3804 0,002539* Temperatura (Quadrática) 44,9559 1 44,95591 486,0098 0,002051* Temperatura (Linear) 19,2010 1 19,20096 207,5779 0,004783* 1L x 2L 11,0556 1 11,05563 119,5203 0,008263* Ajuste do modelo 9,9371 3 3,31238 35,8095 0,027290* Erro puro 0,1850 2 0,09250 - Valor-p - Figura 17 – Gráfico de Pareto para vários efeitos da variável atividade lipolítica total da linhagem O19. Figura 18 – Superfície de resposta para atividade lipolítica total da linhagem O19. Figura 19 – Curvas de nível para a atividade lipolítica total da linhagem O19. 4.4 Caracterização molecular das linhagens bacterianas mais ativas na produção de lipases 4.4.1 Amplificação do rDNA 16S pela técnica de PCR A amplificação dos fragmentos do rDNA 16S das seis linhagens bacterianas através da técnica de PCR, realizada com o par de primers 26F e 1492R, revelou a presença de uma única banda com cerca de 1500pb (Figura 20). Figura 20 – Amplificação do gene rDNA 16S das linhagens bacterianas selecionadas. M – marcador de peso molecular de 100bp ladder; linhagens: 1 – O17; 2 – O19; 3 – O22; 4 – O23; 5 – O45; 6 – O62. M O17 O19 O22 O23 O45 O62 1500 pb Fonte: Laís Campos. 4.4.2 Padrões de restrição do rDNA16S das bactérias O produto da PCR foi submetido à digestão com as seguintes enzimas de restrição: Hae III, Hpa II e Taq I. As enzimas Hae III e Taq I geraram três bandas, enquanto que a enzima Hpa II gerou duas. Todas elas apresentaram um único padrão de banda, formando um único genótipo de rDNA 16S (Figura 21). Figura 21 – Padrão de restrição de rDNA 16S (ARDRA) das linhagens bacterianas selecionadas (O17, O19, O22, O23, O45, O62). A (padrão de restrição gerado pelas enzimas Hae III, Hpa II e Taq I); M – marcador molecular. Taq I M A O17 A O19 A O22 A O23 A A O45 O62 Hae III M A A O17 O19 1000 pb 500 pb 300 pb 200 pb 500 pb 400 pb Hpa II M A O17 A O19 A O22 A O23 450 pb 300 pb Fonte: Laís Campos A A O45 O62 A O22 A O23 A O45 A O62 4.4.3 Análise das sequências de rDNA 16S das linhagens bacterianas O19 e O23 O produto do PCR das linhagens O19 e O23 foi seqüenciado utilizando os primers F26 e R1492, gerando assim, 2 sequências para cada uma com um tamanho que variou de 645pb a 745pb (Anexos 1 - 4), sendo analisadas no programa Blastn de acordo com os dados depositados no GenBank. O alinhamento mais significativo da sequência gerada (739pb), para linhagem O19, a partir do primer F26, foi com a espécie Burkholderia cenocepacia, com identidade máxima de 99%. Com o primer R1492, a sequência gerada (645pb), para a mesma linhagem, mostrou o alinhamento mais significativo com a espécie Burkholderia sp., com identidade máxima de 99% (Tabela 15). Para a linhagem O23, a sequência gerada (745pb) com o primer F26 mostrou o alinhamento mais significativo com a espécie Burkholderia cenocepacia, com identidade máxima de 99%. O primer R1492, em relação à mesma linhagem, gerou uma sequência com 723pb, apresentando o alinhamento mais significativo com a espécie Burkholderia sp. (Tabela 15). Tabela 15 – Resultados das comparações das sequências parciais do gene rRNA 16S com as sequências depositadas no GenBank, utilizando o programa Blastn (refseq_rna). Isolado (F1) Tamanho (pb) Código de acesso NCBI Alinhamento mais significativo do Blastn (GenBank ID) 739 NR_025013. Burkholderia 1 cenocepacia strain LMG O19 (R12) 0.0 99% 0.0 99% 0.0 99% 0.0 99% 16656 645 (F1) E-value Identidade máxima 745 O23 NR_042634. Burkholderia sp. R- 1 24201 strain R-24201 NR_025013. Burkholderia 1 cenocepacia strain LMG (R12) 16656 723 NR_042634. Burkholderia sp. R- 1 24201 strain R-24201 4.5 Análise da produção de biossurfactantes 4.5.1 Atividade emulsificante das bactérias O método da emulsificação demonstra a capacidade que uma cultura bacteriana possui de emulsificar uma substância oleosa em água (Figura 22). A tabela 16 apresenta os índices de emulsificação e estabilidade de emulsão das linhagens cultivadas no meio NB com azeite de oliva (1%). Em relação à cultura bacteriana, das 66 linhagens analisadas, 73% das linhagens apresentaram emulsificação do óleo diesel com os índices de emulsificação (E24) entre 10,5% e 60,5%. A estabilidade da emulsificação variou de 0,4 a 1 (Tabela 16). O teste de emulsificação do óleo diesel pelo sobrenadante livre de células revelou que 68,1% das linhagens produziram surfactantes extracelulares, apresentando índices de emulsificação E24 entre 5,2% e 60,5%. A estabilidade da emulsificação variou de 0,2 a 1 (Tabela 16). Não foi observada a corelação entre produção de lipases e emulsificação do óleo (r = 0,10). Figura 22 - Emulsificação do óleo diesel por cultura bacteriana. (A) linhagem positiva (O19) (B) linhagem negativa (O42). A B Coluna de emulsão Fonte: Laís Campos. 4.5.2 Análise de dispersão do óleo diesel A técnica de dispersão do óleo diesel demonstrou que, tanto as culturas quanto os sobrenadantes livres de células, das 66 linhagens analisadas, apresentaram capacidade de dispersar o óleo, indicando assim a produção de biossurfactantes. Quanto ao poder de dispersão das culturas bacterianas analisadas, 50% delas apresentaram zona de dispersão de 140 mm. Em relação ao sobrenadante livre de células, apenas 25% apresentaram zona de dispersão de 140 mm (Tabela 17). Não foi observada correlação entre produção de lipases e dispersão do óleo (r= -0,03). Tabela 16 – Emulsificação do óleo diesel pela cultura e pelo sobrenadante livre de células das 66 linhagens bacterianas. Linhagens Cultura Sobrenadante livre de células E5(%) E24(%) ES E5(%) E24(%) ES O1 63,15 57,89 0,9 50 44,7 0,9 O2 15,7 - - 15,7 - - O3 50 47,3 0,9 55,2 44,7 0,8 O4 44,7 44,7 1 52,6 47,3 0,9 O5 53,3 53,3 1 40 36,6 0,9 O6 30 - - 16,6 - - O7 30 30 1 26,6 23,3 0,8 O8 21 21 1 10,5 7,8 0,75 O9 55,2 52,6 0,9 39,4 39,4 1 O10 21 15,7 0,7 18,4 - - O11 57,8 52,6 0,9 44,7 44,7 1 O12 57,8 52,6 0,9 21 15,7 0,7 O13 44,7 44,7 1 28,9 28,9 1 O14 44,7 39,4 0,8 39,4 36,8 0,9 O15 53,3 46,6 0,8 46,6 43,3 0,9 O16 28,9 - - 23,6 - - O17 - - - - - - O18 10,5 10,5 1 30 30 1 O19 42,1 42,1 1 44,7 44,7 1 O20 31,5 26,3 0,8 21 21 1 O21 44,7 44,7 1 52,6 36,8 0,7 O22 - - - - - - O23 55,2 52,6 0,9 50 50 1 O24 31,5 26,3 0,8 - - - O25 36,8 34,2 0,9 42,1 36,8 0,8 O26 34,2 21 0,6 50 13,1 0,2 O27 10,5 - - 21 - - O28 - - - - - - O29 26,3 13,1 0,5 15,7 15,7 1 O30 - - - - - - O31 39,4 36,8 0,9 42,1 42,1 1 O32 36,8 36,8 1 36,8 28,9 0,7 O33 60,5 55,2 0,9 50 47,3 0,9 O34 44,7 44,7 1 47,3 44,7 0,9 O35 60,5 57,8 0,9 50 44,7 0,8 O36 63,1 60,5 0,9 52,6 52,6 1 O37 52,6 44,7 0,8 39,4 36,8 0,9 O38 31,5 13,1 0,4 26,3 10,5 0,4 O39 21 - - 13,1 - - O40 26,3 10,5 0,4 23,6 5,2 0,2 O41 57,8 52,6 0,9 34,2 34,2 1 O42 - - - - - - O43 26,3 26,3 1 23,6 23,6 1 O44 23,6 18,4 0,7 50 - - O45 50 47,3 0,9 44,7 42,1 0,9 O46 21 - - 21 - - O47 39,4 39,4 1 31,5 31,5 1 O48 - - - - - - O49 10,5 - - - - - O50 68,4 55,2 0,8 60,5 60,5 1 O51 28,9 21 0,7 21 21 1 O52 46,6 43,3 0,9 46,6 46,6 1 O53 47,3 47,3 1 44,7 - - O54 44,7 44,7 1 26,3 23,6 0,9 O55 55,2 55,2 1 55,2 26,3 0,4 O56 23,3 - - 30 - - O57 5,2 - - 39,4 39,4 1 O58 - - - - - - O59 47,3 26,3 0,5 50 26,3 0,5 O60 47,3 47,3 1 57,8 57,8 1 O61 55,2 55,2 1 39,4 36,8 0,9 O62 13,1 13,1 1 21 15,7 0,7 O63 50 50 1 57,8 34,2 0,6 O64 - - - - - - O65 - - - - - - O66 57,8 52,6 0,9 52,6 13,1 0,2 Tabela 17 – Dispersão do óleo diesel pela cultura e pelo sobrenadante livre de células das 66 linhagens bacterianas. Linhagens O1 Zona da dispersão (mm) Cultura Sobrenadante livre de células 85 80 O2 140 140 O3 140 110 O4 140 130 O5 140 110 O6 140 110 O7 140 90 O8 45 35 O9 140 34 O10 140 100 O11 140 100 O12 93 140 O13 90 90 O14 140 95 O15 140 120 O16 120 110 O17 140 120 O18 80 25 O19 50 30 O20 140 140 O21 140 95 O22 140 40 O23 140 140 O24 120 115 O25 140 140 O26 80 60 O27 110 110 O28 140 100 O29 140 40 O30 140 140 O31 140 55 O32 140 140 O33 140 73 O34 100 100 O35 75 105 O36 80 140 O37 80 140 O38 80 140 O39 140 60 O40 80 140 O41 140 62 O42 140 100 O43 95 50 O44 90 38 O45 140 140 O46 140 75 O47 110 100 O48 140 60 O49 130 140 O50 90 55 O51 125 100 O52 120 120 O53 87 60 O54 50 35 O55 90 90 O56 140 120 O57 140 140 O58 140 140 O59 90 35 O60 90 85 O61 95 50 O62 90 90 O63 80 110 O64 140 140 O65 40 140 O66 55 55 4.5.3 Atividade hemolítica das bactérias A análise da produção de biossurfactantes no meio ágar sangue demonstrou que, após 96 horas, 57,5% das linhagens apresentaram formação de halo hemolítico ao redor da colônia (Figura 23), com destaque para a linhagem O27, que apresentou halo de 49 mm (Tabela 18). Não foi observada correlação entre produção de lipases e atividade hemolítica (r = 0,29). Figura 23 – Teste da atividade hemolítica de bactérias. As linhagens O37, O39 e O43 formaram um halo ao redor da colônia, sendo positivas quanto à produção biossurfactantes. As linhagens O16, O17 e O18 foram negativas. Fonte: Laís Campos Tabela 18 – Atividade hemolítica das linhagens bacterianas analisadas no meio ágar sangue após 48 e 96 horas de crescimento. Linhagens Zona de hemólise (mm) 48 horas 96 horas O1 O2 - 18 O3 - - O4 9 21 O5 12 27 O6 - 21 O7 10 22 O8 8 23 O9 - 17 O10 - - O11 - 37 O12 - - O13 - 17 O14 - - O15 - 21 O16 - - O17 - - O18 - - O19 - 12 O20 - 25 O21 - 17 O22 - 17 O23 - 17 O24 - - O25 17 30 O26 - - O27 35 49 O28 - - O29 - 15 O30 - 20 O31 21 ND O32 - 25 O33 + 37 O34 - - O35 - - O36 - - O37 11 37 O38 - O39 30 32 O40 - - O41 8 20 O42 20 38 O43 22 27 O44 - - O45 - 14 O46 23 26 O47 - 24 O48 - - O49 - 6 O50 - 24 O51 - 31 O52 - 28 O53 - - O54 - 14 O55 - - O56 12 23 O57 - 20 O58 - - O59 - - O60 - - O61 - - O62 12 O63 - - O64 - - O65 25 O66 - - ausência de halo; ND: não determinado - 30 39 - 4.5.4 Produção de ramnolipídeos A produção de ramnolipídeos foi testada em 24 linhagens que apresentaram atividade hemolítica. Apenas duas linhagens, O42 e O62, demonstraram produzir ramnolipídeos, apresentando halo azul ao redor da colônia (Figura 24). Segundo Siegmund e Wagner (1991), o teste realizado com brometo cetiltrimeltilamônio e azul de metileno para caracterização de linhagens produtoras de ramnolipídeos é um teste semi-quantitativo onde o biossurfactante aniônico forma um par iônico insolúvel em presença de brometo cetiltrimetilamônio mais azul de metileno. Portanto, o halo azul em volta da colônia (Figura 24) caracteriza a linhagem como produtora do biossurfactante aniônico. Figura 24 – Análise da produção de ramnolipídeos. A presença de um halo azul das linhagens O42 e O62 demonstrou a produção de ramnolipídeos. As linhagens O43 e O5 não produziram ramnolipídeos. O crescimento desta última promoveu a redução do pH do meio, promovendo a formação de uma halo amarelado. Fonte: Laís Campos. DISCUSSÃO 5 DISCUSSÃO O solo é um habitat de natureza heterogênea complexa e dinâmica, onde diversos fatores físicos, químicos e biológicos atuam simultaneamente, determinando as condições ambientais de cada microambiente que é propício para o desenvolvimento de certas comunidades microbianas (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). O solo utilizado neste trabalho para o isolamento de bactérias foi tratado com óleo vegetal residual (proveniente de frituras). Este tratamento alterou vários parâmetros físicoquímicos do solo como o pH, a umidade, o teor de matéria orgânica e vários micro e macro elementos. Semelhante ao nosso trabalho, Alvarez et al. (1999) mostraram que solos tratados com óleo apresentam pH baixo, sendo caracterizados como fortemente ácidos quando seu pH se encontra abaixo de 4,0. Segundo Raij (1991), solos com características ácidas apresentam baixo teor de cátions, como Mg2+, K+, Na+ e altas concentrações de Cu2+ e Fe. No solo analisado neste trabalho também foram observadas essas características. Zongqiang et al. (2008), analisando os efeitos do óleo de soja sobre o crescimento de plantas superiores, percebeu que um solo, quando tratado com óleo, apresentou redução de pH em relação ao solo controle, sem tratamento com óleo, demonstrando assim o significante efeito da ação dos metabólitos do óleo sobre as propriedades do solo. Uma vez utilizado em processos de fritura, o óleo vegetal residual passa a apresentar grandes quantidades de ácidos graxos livres, o que aumenta sua acidez. Adicionalmente à redução do pH do solo, a acidez causa a perda de nutrientes pelo mesmo (OLIVEIRA et al., 2000), o que implica em menor disponibilidade dos elementos essenciais para o metabolismo microbiano na degradação dos contaminantes. Todavia, o enriquecimento do solo com óleo levou a uma maior concentração de matéria orgânica e, consequentemente, a uma menor permeabilidade do solo e redução da taxa de umidade, em comparação ao solo não contaminado. Segundo Jaramillo (1996), o solo é considerado rico em matéria orgânica quando apresenta teor acima de 4,2 dag/kg, o que foi observado no solo contaminado com óleo, mas não no solo sem contaminação. Em geral, os microrganismos presentes numa área alterada pela adição de algumas substâncias específicas, apresentam maior probabilidade de adquirirem a capacidade genética de decodificar enzimas que atuem na degradação desses xenobiontes, tanto quanto maior for o seu tempo de exposição a tais compostos (DIAS, 2000). Diversos autores enfatizam que, embora os avanços nos campos da genética, fisiologia microbiana e instrumentação tenham provocado grande impacto na produção de enzimas, programas de screening visando à seleção de microrganismos com habilidade para produzir moléculas bioativas continuam a ser um importante aspecto da biotecnologia (BUZZINI; MARTINI 2002; HA et al., 2007; JAEGER et al., 1999; OGAWA; SHIMIZU, 2002; RUIZ et al., 2005). Entre os substratos que podem ser utilizados para selecionar os microrganismos que produzem lipases, bem como os biossurfactantes, os óleos vegetais vêm se destacando cada vez mais. Um estudo realizado por Haba et al. (2000) mostrou que o solo, uma vez enriquecido com óleo vegetal residual, proporcionou condições favoráveis para o desenvolvimento e seleção de microrganismos lipolíticos. Neste trabalho, todas as linhagens bacterianas isoladas do solo contaminado com óleo vegetal residual demonstraram atividade lipolítica quando testadas no meio ágar tributirina. Entretanto, quando as bactérias foram analisadas no meio confirmativo, contendo caldo nutriente, rodamina B e azeite de oliva ou óleo de soja, 33,3% a 39,3% das linhagens apresentaram atividade lipolítica, dependendo do substrato e do pH do meio. O meio com azeite de oliva, pH 7,0, mostrou-se o melhor substrato para a produção de lipases, uma vez que as linhagens apresentaram halos de hidrólise maiores (> 3cm). De acordo com Kouker e Jaeger (1987), o tamanho do halo de hidrólise apresenta correlação positiva com a atividade lipolítica. Segundo Kim (2001), o teste com azeite de oliva e rodamina B é mais recomendado para identificar bactérias lipolíticas do que o teste com tributirina, já que tanto esterases como lipases podem hidrolisar a tributirina. Um estudo realizado por Cardenas et al. (2001b), utilizando ágar contendo tributirina ou óleo de oliva para a detecção da atividade lipolítica, mostrou que das 2000 cepas testadas, 450 apresentaram halo com tributirina, enquanto apenas 92 com óleo de oliva. Segundo os autores, a formação do halo nas placas contendo óleo de oliva indica a presença de lipases que atuam sobre os triglicerídeos de cadeia longa, enquanto que a detecção no ágar tributirina indica a produção de esterases, além de lipases. Apesar dos inconvenientes do uso da tributirina, por nem sempre haver uma correlação entre a sua hidrólise e a produção de lipases e por ela não ser um substrato específico para esta enzima, alguns autores têm recomendado seu emprego em procedimentos de detecção e seleção primária de microrganismos lipolíticos (LIMA et al., 1991), mas com posterior confirmação com lipídios insolúveis (SMITH; HAAS, 1992). A alta porcentagem de linhagens lipolíticas isoladas nesse trabalho ocorreu provavelmente devido ao tratamento do solo com óleo vegetal residual, proporcionando uma seleção e enriquecimento do solo com os microrganismos capazes de utilizar o óleo como fonte de carbono e se adaptar as condições específicas do ambiente como pH ácido, teores de macro e microelementos alterados e reduzida umidade. A maioria das bactérias descritas como produtoras de lipases extracelular são Gramnegativas (JAEGER; REETZ, 1998; JAEGER et al., 1994). O mesmo fato foi verificado no nosso estudo, onde no meio com rodamina B, das 25 linhagens que apresentaram atividade lipolítica, a maioria delas (80%) foi caracterizada como Gram-negativa e apenas 20% como Gram-positivas. Entre as bactérias lipolíticas Gram-negativas, catalase positivas, com alta eficiência na secreção de lipases extracelulares se destacam as espécies Pseudomonas aeruginosa (DHARMSTHITI; KUHASUNTISUK, 1998; JAEGER; EGGERT, 2002), Pseudomonas sp. (JAEGER et al., 1999) e Burkholderia cepacia (JAEGER; EGGERT, 2002). Segundo Arpigny e Jaeger (1999), bactérias Gram-positivas dos gêneros Bacillus e Staphylococcus são muito conhecidas por produzirem diversas carboxilesterases e lipases distintas. Um dos principais agentes envolvidos com a atividade lipolítica tem sido fonte de carbono, uma vez que as lipases são enzimas induzíveis geralmente produzidas na presença de lipídeos como um óleo ou qualquer outro indutor como triacilgliceróis, ácidos graxos, ésteres hidrolisáveis, tweens, sais biliares e glicerol (BRADOO et al., 1999; GHOSH et al., 1996; LI et al., 2004; LOTTI et al., 1998; RATHI et al. 2001). No presente trabalho, 25 linhagens positivas pelo método ágar rodamina B com azeite de oliva foram selecionadas para quantificação da atividade lipolítica através do método titulométrico. Uma vez cultivadas no meio NB com adição de azeite de oliva, a atividade lipolítica total variou de 0,62 U/mL/min a 12,4 U/mL/min. Entre estas linhagens analisadas, seis se destacaram com atividade total superior a 8,7 U/mL/min, as quais foram testadas com relação ao efeito do meio sobre a produção de lipases. Enquanto todas as linhagens produziram lipases no meio NB com azeite de oliva, apenas três apresentaram atividade lipolítica no meio NB com óleo de soja. Desta forma, o azeite de oliva demonstrou ser um melhor indutor para a atividade lipolítica. O azeite de oliva é uma fonte de lipídeos amplamente utilizada como indutora de lipases devido à alta quantidade de ácido oléico em sua composição, sendo este considerado, em estudos de Gordilho et al. (1998), Motensinos et al. (1996) e Obradors et al. (1993), o melhor indutor para a produção de lipases. Segundo Ghosh et al. (1996) e Hadeball (1991), ácidos graxos insaturados de cadeia longa como ácido oléico, linoléico e linolênico, ao contrário dos ácidos graxos saturados, que não apresentam efeitos significativos, são conhecidos por aumentar a produção de lipases em várias bactérias. Enquanto o óleo de soja contém, aproximadamente, 20% de ácido oléico (C18:1), o azeite de oliva contém cerca de 70%, o que vem determinando sua utilização como substrato padrão para aumentar a atividade lipolítica (GURR et al., 2002). Quando o óleo de oliva é a única fonte de carbono, o microrganismo utiliza-o de modo seqüencial. Inicialmente, o óleo de oliva é hidrolisado por uma pequena quantidade de lipase proveniente do próprio inóculo do microrganismo em glicerol e ácidos graxos livres. Em seguida, o microrganismo consome o glicerol liberado, ainda sem a produção da lipase. Finalmente, os ácidos graxos livres são aproveitados com a indução da produção de uma quantidade significativa de lipases (MONTESINO et al., 1996). Geralmente, nitrogênio orgânico, como peptona e extrato de levedura, tem sido utilizado juntamente com outras fontes de carbono para aumentar a produção de lipases por várias espécies como Bacillus sp., Burkholderia sp., Pseudomonas sp. e Staphylococcus haemolyticus (GHANEM et al. 2000; GOSH et al., 1996; KHYAMI-HORANI 1996; LANSER et al. 2002; OH et al. 1999; PABAI et al. 1996; SHARMA et al. 2002b; WANG et al. 1995). Os resultados mostraram que no meio mineral com azeite de oliva e glicerol ou glicose, além da biomassa reduzida ou ausente, também foi observada atividade lipolítica muito baixa quando comparada ao meio NB, sendo o meio mineral ineficiente para produção de lipases. A produção de lipases no meio mineral com azeite de oliva e glicerol ou glicose foi observada apenas para uma linhagem em cada meio. O meio NB, uma vez muito rico em substâncias orgânicas (peptona, extrato de carne e extrato de levedura), propiciou melhor crescimento e maior atividade lipolítica pelas bactérias. Um estudo realizado por Dahiya e Purkayastha (2011) também mostrou que o meio que proporcionou uma maior atividade lipolítica para Bacillus sp. PD-12 continha em sua composição: azeite de oliva, extrato de levedura, peptona, NaCl e glicose. No nosso trabalho, a adição de substratos como glicose ou glicerol não demonstraram aumentar a atividade lipolítica, apesar de o glicerol, ao contrário da glicose, ter promovido o crescimento, mesmo baixo, de todas as linhagens analisadas. Apesar de análises que relacionem a produção enzimática com o glicerol serem muito interessantes, uma vez que o mesmo é subproduto excedente da produção biodiesel, poucos estudos têm demonstrado o seu efeito na atividade lipolítica. Lin et al. (2006), ao estudarem diversas fontes de carbono para produção de lipases por Antrodia cinnamomea, obtiveram uma maior atividade lipolítica utilizando glicerol como fonte de carbono. O glicerol também foi a melhor fonte de carbono para produção de lipases por Bacillus sp. (GUPTA et al., 2004a). Dalmau et al. (1999) apresentaram resultados que mostram o efeito repressor da glicose na produção de lipase de Candida rugosa (LOTTI et al., 1998 apud SHARMA et al., 2001). Além disso, alguns trabalhos demonstram o efeito indutor deste mesmo açúcar na produtividade da lipase de diferentes cepas de Yarrowia lipolytica (CORZO; REVAH, 1999) e de outros microrganismos, como o fungo Antrodia cinnamomea (LIN; KO, 2005). Shirazi et al. (1998) observaram que a atividade lipolítica de uma cepa de Saccharomyces cerevisiae foi inibida pela glicose adicionada ao meio contendo substratos lipídicos como óleo de oliva, ácido oléico, tributirina e óleo de soja. Análise molecular das seis linhagens mais ativas na produção de lipases, isoladas neste trabalho, revelou apenas um genótipo de rDNA 16S na base da análise de ARDRA. A pesquisa por similaridade das sequências de rDNA 16S realizada no GenBank, pelo BLAST, indicou que as linhagens O19 e O23 pertencem ao gênero Burkholderia, com 99% de similaridade com as espécies do complexo Burkholderia cepacia. As bactérias do complexo Burkholderia cepacia são espécies aproximadamente relacionadas que compartilham um alto grau de similaridade quanto à sequência do gene rRNA 16S (> 97,5%) (VANDAMME; DAWYNDT, 2010). Atualmente, o complexo Burkholderia cepacia compreende 9 variantes genômicas formalmente nomeadas e 1 variante aguardando publicação de um estudo polifásico formal, totalizando 10 variantes, sendo elas: Burkholderia cepacia (variante genômica I), Burkholderia multivorans (variante genômica II), Burkholderia cenocepacia (variante genômica III), genômica IV), Burkholderia stabilis (variante Burkholderia vietnamiensis (variante genômica V), Burkholderia dolosa (variante genômica VI), Burkholderia ambifaria (variante genômica VII), Burkholderia anthina (variante genômica VIII), Burkholderia pyrrocinia (variante genômica IX) e Burkholderia ubonensis (variante genômica X) (MAHENTHIRALINGAM et al., 2008). Burkholderia cepacia (anteriormente Pseudomonas cepacia) (NASSER et al., 2004) é uma bactéria ubíqua, classificada como bacilo gram-negativo, não-fermentador, não esporulado, móvel, da família Pseudomonadaceae (ROMERO-GOMEZ et al., 2008). Para determinar os valores ótimos de pH e temperatura na atividade lipolítica total da linhagem Burkholderia sp. O19, mais ativa na produção de lipases, foi utilizada a Metodologia de Superfície de Resposta. De acordo com a análise de variância, o modelo experimental foi significativo, apresentando o coeficiente de determinação (R2) de 0,86, indicando o bom ajuste do modelo. A alta atividade lipolítica da linhagem Burkholderia sp. O19 foi prevista, pela análise de superfície de resposta, em ampla faixa de pH e temperatura. Entretanto, os maiores valores da atividade (> 14,87 U/mL/min) foram previstas para o pH alcalino (> 8,5) e altas temperaturas (>65oC). O pH inicial do meio de crescimento é importante para a produção de lipases. Em grande parte, o pH preferencial das bactérias para crescimento e produção da enzima é em torno de 7,0, como no caso de Bacillus sp. (SUGIHARA et al. 1991), Acinetobacter sp. (BARBARO et al. 2001) e Burkholderia sp. (RATHI et al. 2001). Entretanto, alta atividade lipolítica em pH acima de 7,0 tem sido observada em muitos casos (DONG et al. 1999; GILBERT et al., 1991a; KHYAMI-HORANI 1996; NASHIF; NELSON 1953; SHARMA et al. 2002b; WANG et al. 1995). Liu et al. (2006) observaram, ao utilizar a metodologia de superfície de resposta, que a maior produção de lipases por Burkholderia sp. C20 foi prevista para o pH 9,0 e a temperatura de 55oC. Tal temperatura e pH ótimo são similares a relatos prévios da atividade lipolítica total da lipase de Burkholderia (RATHI et al., 2001). É provável que no pH ótimo, a conformação da lipase seja adequada para adsorver à interface óleo/água, ajudando a abrir o lid que bloqueia o sítio ativo da lipase, para que ela exerça sua atividade de hidrólise (BRZOZOWSKI et al., 1991; JAEGER et al., 1994). Apesar das lipases bacterianas serem relatadas por apresentarem, em geral, temperatura ótima de atividade na faixa de 30 – 60 oC (DHARMSTHITI et al. 1998; LESUISSE et al. 1993; LITTHAUER et al. 2002; WANG et al. 1995), já foram descritas exceções desta faixa de temperatura, como é o caso do Bacillus sp. THLO27 (DHARMSTHITI; LUCHAI, 1999) e da Burkholderia sp. (RATHI et al., 2000), que apresenta atividade máxima em 70 e 90°C, respectivamente. Segundo Lu et al. (2009), uma linhagem bacteriana isolada de um solo contaminado com óleo, identificada como Burkholderia cepacia, apresentou alta atividade lipolítica em pH 9,0 e temperatura 70oC. Vários tipos de lipases provenientes de espécies de Burkholderia foram identificados e suas propriedades enzimáticas e estruturas de cristal foram elucidadas (FRENKEN et al., 1992; GUPTA et al., 2004a; KIM et al., 1997; JORGENSEN et al., 1991; SUGIHARA et al., 1992). Devido a sua preferência por hidrolisar triglicerídeos de cadeia longa, excelente enantioseletividade (WEISSFLOCH; KAZALAUSKAS, 1995), tolerância a solventes e a altas temperaturas (RATHI et al., 2000; RATHI et al., 2001; SUGIHARA et al., 1992), lipases de Burkholderia começaram a ser mais estudadas a partir da duas últimas décadas para seu uso industrial. As lipases do gênero Burkholderia tem sido amplamente estudadas devido a sua variedade de aplicações biotecnológicas nas áreas alimentícias, de laticínios, de detergentes e farmacêuticas. Além disso, o gênero Burkholderia é um dos mais importantes gêneros bacterianos produtores de lipases. Além das lipases, os biossurfactantes também são moléculas produzidas por microrganismos, geralmente envolvidas no metabolismo de substratos oleosos. Entretanto, a relação entre a produção de lipases e biossurfactantes ainda não está bem estabelecida (COLLA et al., 2010). Como as porções polar e apolar constituintes das moléculas com propriedades surfactantes são sintetizadas a partir das vias de síntese de lipídios e carboidratos, as lipases podem estar envolvidas no processo de síntese de biossurfactantes, uma vez que realizando a hidrólise dos triacilgliceróis constituintes do indutor (azeite de oliva), ocasionam a liberação de ácidos graxos livres, mono e diacilgliceróis, os quais são compostos que apresentam estruturas com porções polares e apolares em uma mesma molécula, podendo, portanto, apresentar atividades de redução da tensão superficial e emulsificantes (DESAI; BANAT, 1999). Com base em pelo menos um dos métodos analisados para produção de biossurfactantes, como teste de emulsificação, dispersão e atividade hemolítica, não foi observada correlação com a produção de lipases. Enquanto Martins et al. (2008), ao realizarem um estudo sobre a co-produção de lipases e biossurfactantes por Aspergillus fumigatus e Phialemonium sp., verificaram que a produção de lipases não interferiu na produção de biossurfactantes, Colla et al. (2010) observaram uma correlação de 91% entre atividade lipolítica e atividade emulsificante. O método de dispersão do óleo diesel foi o mais eficiente, dos três métodos, para detecção de biossurfactantes. Nele, todas as linhagens demonstraram capacidade de produzir tais moléculas. No teste de emulsificação, o número de linhagens positivas caiu para 70%. Quando analisadas em relação à atividade hemolítica, 59% das bactérias apresentaram resultado positivo. Destas, a partir da seleção das linhagens mais ativas, apenas duas demonstraram produzir ramnolipídeos. De acordo com Morikawa (2000), a análise de dispersão do óleo é um sistema de ensaio sensível e conveniente para se analisar a presença de biossurfactantes, uma vez é capaz de detectar os mesmos até quando sua atividade e sua quantidade não é tão alta. Um estudo realizado por Techaoei et al. (2007) mostrou que as melhores linhagens estudadas apresentaram zonas de dispersão de 70 mm a 92 mm, enquanto que no nosso trabalho, as maiores zonas de dispersão foram de 140 mm. De todas as culturas bacterianas que apresentaram capacidade de emulsificar o óleo diesel, apenas o sobrenadante livre de células de três delas não apresentaram tal capacidade, comprovando assim que a grande maioria dos biossurfactantes produzidos, por tais linhagens, foi extracelular. A produção de biossurfactantes extracelulares é, em geral, mais visada, porque facilita a sua extração a partir do meio de cultivo e sua utilização em processos industriais. Um estudo realizado por Wattanaphon et al. (2008) com a cultura de 130 linhagens mostrou que 64 delas foram capazes de promover a emulsão do óleo diesel, e apenas o sobrenadante de 5 linhagens apresentou resultado positivo. Em nosso trabalho, a cultura e o sobrenadante das linhagens que apresentaram melhor atividade emulsificante também apresentaram estabilidade máxima. Segundo Willumsen e Karlson (1997), um critério utilizado para analisar a capacidade de estabilização da emulsão está relacionado diretamente à capacidade da cultura bacteriana ou do sobrenadante em manter pelo menos 50% do volume original 24 horas após a formação da emulsão. Kitamoto et al. (2008) e Nitschke e Pastore (2002) afirmaram que algumas bactérias possuem a capacidade de produzir biossurfactantes com características de detergência, o que as permite emulsificar o óleo, facilitando sua degradação e apresentando assim, grande potencial para a aplicação em técnicas de biorremediação de solos contaminados com óleo. A análise da formação do halo hemolítico no meio ágar sangue tem sido utilizada para selecionar microrganismos produtores de surfactina e ramnolipídeos, sendo o tamanho do halo de hemólise associado à capacidade de produção dessas substâncias (BANAT, 1993; CARRILLO et al., 1996; JOHNSON et al, 1980; LIN, 1996; MULLIGAN et al., 1984). No nosso estudo, comparando o número de linhagens positivas no teste de dispersão do óleo diesel com as linhagens que apresentaram atividade hemolítica, percebemos uma redução de 41% no número de linhagens produtoras de biossurfactantes. Apesar de a atividade hemolítica ser considerada como um método para triagem preliminar da produção de tais moléculas, ele pode excluir muitos bons produtores dos mesmos (MULLIGAN et al., 1984). Um estudo realizado por Youseff et al. (2004) mostrou que 40% de linhagens que não formaram halo no meio ágar sangue foram positivas em outros métodos quanto a produção de biossurfactantes. Outro problema da atividade hemolítica é a geração de falsos-positivos, uma vez que outros produtos microbianos, como fatores de virulência, também são capazes de lisar as células sanguíneas (YOUSSEF et al., 2004). Como a positividade na análise hemolítica pressupõe que dois tipos de biossurfactantes podem ser produzidos, surfactina ou ramnolipídeo, a produção de ramnolipídeos foi avaliada. O fato de apenas duas linhagens terem demonstrado produzir os mesmos, sugere que as outras linhagens com atividade hemolítica podem produzir surfactina. A produção de ramnolipídeos a partir de óleos vegetais já tem sido relatada na literatura por vários pesquisadores (LANG; PHILP, 1998; PASSERI et al. 1991;SYLDATK et al. 1984). Estudos recentes têm demonstrado que óleos vegetais utilizados em fritura de alimentos se apresentam como uma excelente fonte de carbono para favorecer a produção de ramnolipídios por bactérias (RAZA et al., 2006). No Brasil, há uma grande produção e consumo destes óleos, principalmente óleo de soja, gerando muitos resíduos que podem ser tratados através de biotransformação. Uma das abordagens que mais têm sido utilizadas para favorecer a biodegradação de óleos no solo é a utilização de ramnolipídeos, por aumentarem a solubilidade do óleo na água e a biodisponibilidade de substratos hidrofóbicos, levando a maiores taxas de degradação dos mesmos (BANAT et al., 2000; DYKE et al., 1993; REILING et al., 1986; ZHANG; MILLER, 1992). Os resultados obtidos neste trabalho demonstraram que várias linhagens se apresentaram como ótimas produtoras de lipases e biossurfactantes, o que favorece a continuidade de pesquisas nessa área, com a finalidade de purificar as enzimas lipolíticas e os biossurfactantes, biotecnológicos. caracterizando-os e possibilitando sua utilização em processos CONCLUSÕES  O solo usado para o descarte de óleo vegetal mostrou-se propício à prospecção de microrganismos lipolíticos e produtores de biossurfactantes.  Das 66 linhagens de bactérias isoladas do solo contaminado com óleo vegetal residual, 55% foram Gram-negativas e 45% Gram-positivas, sendo agrupadas em sete biótipos.  Todas as linhagens bacterianas promoveram a hidrólise da tributirina, indicando produção de lipases.  Atividade lipolítica no meio ágar rodamina B com azeite de oliva ou óleo de soja, em diferentes pHs, foi observada em 32% e 38% das linhagens, dependendo do tipo do meio.  O meio de cultivo contendo caldo nutriente e azeite de oliva, pH 7,0, proporcionou uma maior atividade lipolítica entre as linhagens bacterianas.  As linhagens mais ativas na produção de lipases foram identificadas, através da análise de ARDRA e do seqüenciamento do gene do rRNA 16S, como espécies do complexo Burkholderia cepacia.  Na base da Metodologia de Superfície de Resposta, uma alta atividade lipolítica da linhagem Burkholderia sp. O19 foi prevista em ampla faixa de pH e temperatura.  A análise da produção de biossurfactantes pelas bactérias isoladas revelou que os testes de emulsificação, dispersão e atividade hemolítica apresentaram diferentes graus de capacidade para detectar os biossurfactantes.  A técnica de dispersão do óleo diesel mostrou ser a mais eficiente na detecção de biossurfactantes, pois todas as linhagens apresentaram resultado positivo nessa análise, seguida pela emulsificação (73% das linhagens) e hemólise (59%).  A produção de ramnolipídeos foi detectada em apenas duas linhagens de bactérias. REFERÊNCIAS REFERÊNCIAS ABADA, E. A. E. Production and characterization of a mesophilic lipase isolated from Bacillus stearothermophilus AB-1. Pakistan Journal of Biological Sciences, v. 11, p.1100– 1106, 2008. ABALOS, A.; PINAZO, A.; INFANTE, M.; CASALS, M.; GARCÍA, F.; MANRESA, A. 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Anexo 2 - O resultado da comparação e alinhamento da sequencia parcial do gene 16S rRNA da linhagem O23 gerada com primer F26 e as sequências disponibilizadas pelo GenBank através do BLAST. As sequências visualizadas na Tabela apresentam a similaridade acima de 95% com a sequência analisada. Anexo 3 - O resultado da comparação e alinhamento da sequencia parcial do gene 16S rRNA da linhagem O19 gerada com primer R1492 e as sequências disponibilizadas pelo GenBank através do BLAST. As sequências visualizadas na Tabela apresentam a similaridade acima de 95% com a sequencia analisada. Anexo 4 - O resultado da comparação e alinhamento da sequencia parcial do gene 16S rRNA da linhagem O19 gerada com primer F26 e as sequências disponibilizadas pelo GenBank através do BLAST. As sequências visualizadas na Tabela apresentam a similaridade acima de 95% com a sequencia analisada.
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