UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

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INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PốS-GRADUAđấO EM CIÊNCIAS BIOLốGICAS

  

Caracterização das subunidades catalíticas do proteassoma

  

20S em cepas de Trypanosoma cruzi susceptíveis e resistentes

ao benzonidazol

  AUTOR: CÁSSIO BARROS DE OLIVEIRA

  a a

  ORIENTADORA: PROF . Dr . RENATA GUERRA DE SÁ

  a

  CO-ORIENTADORA: DR SILVANE MARIA FONSECA MURTA Dissertação submetida ao programa de Pós-Graduação do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de mestre em Ciências Biológicas, área de concentração: Biologia Molecular.

  

Ouro Preto, fevereiro de 2007 O48c Oliveira, Cássio Barros de.

  

Caracterização das subunidades catalíticas do proteassoma 20S em cepas

do Trypanosoma cruzi susceptíveis e resistentes ao benzonidazol [manuscrito] / Cássio Barros de Oliveira. – 2007. 65 f.: il.; color.; grafs.; tabs. Orientadora: Profa. Renata Guerra de Sá.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto de

Ciências Exatas e Biológicas. Área de concentração: Biologia Molecular.

  1.Trypanosoma cruzi - Teses. 2. Drogas - Resistência - Teses.

  I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título. Catalogação: sisbin@sisbin.ufop.br Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular –

  ICEB/NUPEB/UFOP e Laboratório de Parasitologia Celular – Centro de Pesquisa René-Rachou, Fiocruz-MG, com apoio financeiro da Fundação de Amparo a Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG) e Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq).

  Dedico esta dissertação aos meus pais, Wellington e Anália, aos meus irmãos Júnior, Ana Cândida e Luís Antônio pelo apoio durante todas as dificuldades encontradas e pela compreensão de minhas diversas ausências.

  “A vida só pode ser entendida olhando-se para trás. Mas só pode ser vivida olhando-se para frente.” (S. Kierkegaard)

  

Agradecimentos

  A Deus; Aos meus queridos pais e irmãos, pelo amor, carinho e por sempre acreditarem na realização desse trabalho;

  a a

  À Prof. Dr. Renata Guerra de Sá, pelos vários ensinamentos, tanto na parte profissional quanto pessoal. Pelo exemplo de profissionalismo e persistência. E, sobretudo, por mostrar a vida de uma maneira mais simples; Ao Prof. Dr. Elísio Alberto Evangelista, um verdadeiro pai científico, que incentivou meu estudo na área da Bioquímica e apoiou toda a minha trajetória durante a graduação e mestrado, seus “causos” e exemplo de vida nunca serão esquecidos;

  a a

  À Prof. Dr. Maria Lúcia Pedrosa, pessoa atenciosa carismática, alegre e muito “chique”, sempre disposta a ajudar; Ao Prof. Dr. Elio Hideo Babá, pelos ensinamentos, conselhos e incentivos;

  a

  À Dr. Silvane Murta e todo o pessoal do Centro de Pesquisa René Rachou, pela ajuda durante os experimentos em Belo Horizonte; À minha namorada Isabela Silveira Miceli, pelo apoio, amor, compreensão e incentivo durante todo o meu mestrado; A equipe do Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular da UFOP (Alínia, Cláudia, Ezequiel, Fabiana, Helaine, Luciana, Matheus, Militão, Naiara, Natália, Rafaela, Roberta, Robertinha, Silvia, Thiago e Leonardo), pelo companheirismo, carinho e vária risadas;

  Ao Roenick, pela amizade e apoio técnico na área da informática; Aos colegas do mestrado, principalmente, a Nilza Satie Hangai uma verdadeira mãe; A Maísa Silva, grande amiga durante a graduação e mestrado; A todos os amigos dos laboratórios do NUPEB; Aos moradores e ex-moradores da República Nóis é Nóis, pela amizade, carinho e boas risadas; A Cida, secretária prestativa e atenciosa, sempre pronta para ajudar; Às seguintes instituições que colaboraram com recursos financeiros para a realização deste trabalho: CNPq e FAPEMIG.

  

Sumário

Sumário

1- Introdução ................................................................................................................... 1

  1.1- Doença de Chagas e Trypanosoma cruzi............................................................... 2 1.2- Tratamento da doença de Chagas .......................................................................... 4 1.3- Susceptibilidade e resistência a drogas.................................................................. 4 1.4- Genoma do T. cruzi ............................................................................................... 6 1.5- Proteassoma e ubiquitinação ................................................................................. 8 1.6- Proteassoma e T. cruzi......................................................................................... 12

  

2- Objetivos.................................................................................................................... 14

3- Material e Métodos................................................................................................... 16

  3.1-Obtenção de cepas ................................................................................................ 17 3.2-Extração de RNA total e verificação da integridade ............................................ 17 3.3-Transferência dos RNAs para a membrana de náilon .......................................... 19 3.4- Extração de DNA genômico................................................................................ 19 3.5- Digestão do DNA genômico com enzimas de restrição e transferência para membrana de náilon (Southern Blot).......................................................................... 20 3.6- Eletroforese em Gel de Campo Alternado (PFGE) ............................................. 21 3.7- Transferência dos cromossomos do Gel de PFGE para a membrana de náilon.. 21 3.8- Obtenção dos cDNAs .......................................................................................... 21 3.9- Purificação dos cDNAs ....................................................................................... 23 3.10- Obtenção das sondas.......................................................................................... 23 3.11- Reação de hibridização...................................................................................... 24 3.12- Lavagem das membranas .................................................................................. 24 3.13- Autoradiografia.................................................................................................. 25 3.14- Obtenção do extrato bruto de proteínas totais do parasito ................................ 25 3.15- Preparação de fração enriquecida de proteassoma ............................................ 26 3.16- SDS-PAGE e ensaios de Western Blot ............................................................. 26 3.17- Medida da atividade proteolítica exógena dos parasitos ................................... 27

  

4- Resultados ................................................................................................................. 28

  4.1- Localização Cromossômica dos Genes Beta-1, -2 e -5 ....................................... 29 4.2- Determinação do número de cópias dos genes Beta-1, -2 e -5............................ 31 4.3- Northern Blot....................................................................................................... 34 4.4- Detecção de conjugados proteína-ubiquitina....................................................... 36 4.5- Detecção do proteassoma 20S ............................................................................. 37 4.6- Atividades enzimáticas do proteassoma 20S....................................................... 38

  

5- Discussão ................................................................................................................... 41

6- Conclusões ................................................................................................................. 52

7- Perspectivas............................................................................................................... 54

8- Referências Bibliográficas ....................................................................................... 56

  

Resumo

  A doença de Chagas é causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi. Segundo a WHO existem 16-18 milhões de pessoas infectadas com este protozoário na América Latina. Devido ao envolvimento do proteassoma na biologia celular do T. cruzi e a baixa eficiência das drogas utilizadas no tratamento de indivíduos com doença de Chagas, entendemos que a caracterização das subunidades catalíticas do proteassoma 20S, poderá ajudar no desenvolvimento de futuros quimioterápicos contra essa doença.

  Neste sentido, este trabalho mostra a caracterização molecular e bioquímica das subunidades catalíticas do proteassoma 20S em um padrão de cepas do T. cruzi com sensibilidade e resistência induzida “in vitro” ao benzonidazol (17WTS e 17LER), sensibilidade e resistência selecionada “in vivo” ao benzonidazol (BZS e BZR) e cepas naturalmente sensíveis e resistentes a essa droga (CL e Colombiana, respectivamente).

  As análises de localização cromossômica utilizando a técnica de eletroforese em gel de campo alternado, mostraram vários perfis de hibridização, sugerindo que estes genes não estão associados com o fenótipo de resistência do T. cruzi a drogas. Além disso, utilizando a técnica de Southern blot, mostramos que estes genes estão presentes em no mínimo duas cópias por genoma haplóide do parasito.

  A expressão desses genes foi avaliada através da técnica de Northern blot e os níveis do proteassoma 20S identificados utilizando Western blot e anticorpos contra subunidades alfa. Podemos constatar que enquanto os níveis de mRNA não variaram entre as cepas, uma maior quantidade de proteassoma 20S foi detectado nas cepas sensíveis (17WTS, BZS e CL) quando comparado as cepas resistentes (17LER, BZR e Colombiana). Além disso, também não detectamos acúmulo de conjugados poliubiquitinados, sugerindo que o processo de poliubiquitinação e degradação de proteínas intracelulares dependente do proteassoma 26S são fortemente regulados no padrão de cepas de T. cruzi estudadas.

  A medida da atividade peptidásica utilizando substratos específicos para as subunidade Beta-1, -2 e -5, mostraram uma atividade peptidásica principal semelhante à tripsina em todas as cepas analisadas, entretanto, as cepas 17WTS e 17LER também apresentaram uma alta atividade peptidásica semelhante à quimotripsina.

  Os resultados obtidos até o momento, sugerem que modificações pós- traducionais são mais eficientes na função do proteassoma 20S do que a regulação ao nível transcricional ou pós-transcricional, na forma epimastigota do T. cruzi.

  

Abstract

  Chagas disease is caused by Trypanosoma cruzi. According to WHO, in Latin America, 16-18 million people is infected with this protozoan. Due the involvement of the proteasome in the cellular biology of the T. cruzi and the low efficiency of the drugs used in the individuals treatment with Chagas disease, we believed that the characterization of the catalytic subunits of the 20S proteasome, would help in the development of future drugs that could be used in the therapeutics of the Chagas disease. This work shows the molecular and biochemical characterization of the catalytic subunits of the 20S proteasome in a T. cruzi population with in vitro induced (17WTS and 17LER), in vivo (BZS and BZR) and strains naturally sensitive and resistant to benznidazole (CL and Colombian). Chromosomal localization by using the pulse field gel electrophoresis and hybridization profiles with specific probes showed several pattern in the different strains, suggesting that these genes are not associated with the drugs phenotype resistance in T. cruzi. Southern blot analyses showed that these genes are present in at least two copies for genome haploid of the parasite. The expression of those genes was evaluated through of Northern blot analyses and the levels of the 20S proteasome identified using Western blot and antibodies against alpha subunits. The mRNA levels did not vary among the strains, but a larger level of 20S proteasome were detected in the sensitive strains (17WTS, BZS and CL) when compared the resistant strains (17LER, BZR and Colombian). The absent of accumulation of poly-ubiquitin conjugated, suggest that the poly-ubiquitination pathway and degradation by 26S proteasome, are strongly regulated in the strains of T. cruzi studied. The measure of the peptidase activity using specific substrate for the subunit Beta-1, -2 and -5, showed that the main proteolytic activity is tripsin-like in all strains. Moreover, the strains 17WTS and 17LER also presented a high quimotripsin-like activity. These results obtained until the moment suggest that, in the epimastigote development stage of the T. cruzi the post-translation modifications are more efficient by the regulation of 20S proteasome function than the transcriptional or post- transcriptional modification.

  Lista de abreviaturas

  α Bis-Acrilamida N, N’ Metileno-Bis-Acrilamida BCA Ácido bicinchoninico BCIP 5-bromo-4-cloro-3 indolil-fosfato BSA Albumina sérica bovina BZ Benzonidazol cDNA DNA complementar DEPC Dietilpirocarbonato gDNA DNA genômico dNTP Deoxinucleotídeo trifosfato (N= A, C, G ou T) D.O. Densidade Óptica EDTA Ácido etilenodiaminotetracético (sal dissódico) MOPS [Ácido 3-(N-Mofolino)Propanosulfônico] mRNA RNA mensageiro NBT Nitrobluetetrazolium PFGE Eletroforese em gel de campo alternado TEMED N,N,N’,N’,-Tetrametil Etilenodiamina Tris Tris-hidroximetilaminometano µCi Microcuries

  Introdução

  1- Introdução

  

Introdução

1.1- Doença de Chagas e Trypanosoma cruzi

  A doença de Chagas também conhecida como Tripanosomíase Americana é uma doença causada pelo protozoário parasito Trypanosoma cruzi (Família: Tripanosomatidae, Ordem: Kinetoplastida). Segundo a WHO, existem 13 milhões de pessoas infectadas com o T. cruzi na América Latina (www.who.int/health- topics/chagas.html). Cerca de 20% dessas pessoas desenvolvem os sintomas clínicos que caracterizam a doença e aproximadamente 14000 mortes têm sido atribuídas anualmente a esta doença (WHO, 2005). A Tripanosomíase Americana apresenta algumas características clínicas associadas com a origem geográfica da cepa do T. como: maior freqüência de magaesôfago e megacólon no Brasil central (Cabral et

  cruzi,

  al., 1999) e rara ocorrência ao norte do rio Amazonas. Na Argentina, Chile e no Estado do Rio Grande do Sul ocorrem diferenças na resposta ao tratamento etiológico, com altos níveis de cura. A transmissão congênita no Brasil é menor comparada com a Bolívia, Chile e algumas partes da Argentina (WHO, 2000).

  Cerca de 100 espécies de mamíferos silvestres atuam como reservatórios da doença de Chagas. A sua transmissão natural é feita principalmente pelos insetos pertencentes à família Reduviidae subfamília Triatominae que infectam animais selvagens durante o repasto sanguíneo, mantendo o ciclo silvestre da doença. O T. cruzi apresenta três formas morfológicas distintas classificadas de acordo com as suas dimensões, morfologia flagelar e posição do cinetoplasto em relação ao núcleo. Nos triatomíneos, os parasitos se multiplicam ao longo do trato digestivo sob a forma epimastigota, longa, flagelada, em forma de fuso, com 35-40 µm de tamanho e com o cinetoplasto situado próximo ou anterior ao núcleo. Os parasitos na forma epimastigota se diferenciam para a forma tripomastigota metacíclica infectante quando chegam à ampola retal do triatomíneo (Dias, 1934). Esta forma é mais alongada variando de 16- 22 µm de tamanho e apresenta um grande cinetoplasto localizado posteriormente ao núcleo além de um flagelo que percorre ao longo de toda a extensão da célula. No interior das células do hospedeiro vertebrado, a forma encontrada é a amastigota, caracterizada pela forma arredondada ou oval, com flagelo pouco proeminente. Estas

  

Introdução

  formas se multiplicam por divisão binária até se diferenciarem em formas tripomastigotas antes do rompimento da célula parasitada (WHO, 2000).

  No hospedeiro vertebrado, a infecção pelo parasito ocorre quando as formas tripomastigotas metacíclicas eliminadas juntamente com as fezes dos barbeiros durante o repasto sanguíneo, atingem a camada da pele lesada pelo triatomíneo ou a mucosa. Essas formas invadem células locais dando início à multiplicação intracelular sob a forma amastigota. As células hospedeiras contendo um grande número de parasitos se rompem, liberando as formas tripomastigotas que através da circulação sanguínea seguem para outros órgãos ou tecidos do organismo onde reiniciam um novo ciclo intracelular. Ao sugar o sangue de um animal ou homem infectado com o T. cruzi, o triatomíneo ingere as formas tripomastigotas sanguíneas que se transformam em paramastigotas que se transformam a seguir em epimastigotas no tubo digestivo do inseto, onde passam a dividir-se intensivamente. Após algumas semanas de infecção, as formas epimastigotas diferenciam-se em tripomastigotas metacíclicos que se concentram nas porções terminais do intestino, sendo eliminados com as fezes durante o próximo repasto sanguíneo do vetor, reiniciando um novo ciclo evolutivo. Os passos desse ciclo encontram-se representados na figura abaixo (Dias, 1934 e Brack, C. 1968).

  

Figura 1: Ciclo de vida do T. cruzi. As diferentes formas do T. cruzi ao longo de seu ciclo

evolutivo no hospedeiro vertebrado e invertebrado. Figura adaptada de WHO, 2000.

  

Introdução

1.2- Tratamento da doença de Chagas

  Infelizmente, ainda não existem tratamentos quimioterápicos eficientes para indivíduos com doença de Chagas. Algumas drogas como o Nifurtimox, 5-nitrofurano [3-Metil-4-(5-nitrofurfuridileno-amino)-tetrahidro-4H-1,4-tiazina-1,1-dióxido] comer- cializado como Lampit (Bayer), e o Benzonidazol, 2-nitroimidazol-(N-benzil-2-nitro-1- imidazolacetamina), comercializado como Radamil ou Rochagan (Roche) apresentam baixa eficiência para a fase crônica da doença e são altamente tóxicas para os pacientes, causando muitos efeitos colaterais (comumente hipersensibilidade, alterações hematológicas e polineuropatia periférica) (Filardi e Brenner, 1987; Urbina e Docampo, 2003).

  Essas drogas são geralmente utilizadas na fase aguda da doença e em reativações da infecção em indivíduos imunossuprimidos. Existem divergências entre autores sobre o tratamento específico durante a fase crônica devido aos baixos índices de cura encontrado, e os efeitos colaterais observados.

  A procura de novas abordagens terapêuticas para o tratamento da doença de Chagas ainda é extremamente importante devido a grande prevalência e mortalidade da doença (WHO, 1991).

  1.3- Susceptibilidade e resistência a drogas

  As diferenças de susceptibilidade ao benzonidazol e nifurtimox entre cepas de T. cruzi (Neal e Van Bueren, 1988) podem explicar, pelo menos em parte, a eficácia distinta destes compostos entre hospedeiros vertebrados infectados com este parasito. De acordo com dados da literatura, acredita-se que os parasitos resistentes a drogas possam super-expressar ou deletar alguns dos genes envolvidos no metabolismo da droga a fim de sobreviverem e se adaptarem no organismo (Guimond et al., 2003). Algumas cepas naturalmente susceptíveis e resistentes ao benzonidazol e nifurtimox foram isoladas de vetores silvestres de áreas onde a doença de Chagas não existe, sugerindo que a resistência natural do T. cruzi aos derivados nitroheterocíclicos é uma

  

Introdução

  das causas da baixa eficácia de cura observada em pacientes chagásicos tratados com estas drogas (Filardi e Brener, 1987).

  Vários protocolos têm sido descritos na literatura para a obtenção “in vitro” de cepas do T. cruzi resistentes ao nifurtimox (Nozaki T. et al 1996), benzonidazol (Nirdé P. et al 1995), azole (Buckner F. et al 1998) e inibidores de enzimas cisteíno- proteases (Engel J. 2000 and Yong V. 2000). Nirdé et al. (1995) conseguiram obter “in vitro” uma população do T. cruzi, 23 vezes mais resistente ao BZ (17LER) comparado com seu par sensível (17WTS). Os autores observaram que o fenótipo de resistência foi estável mesmo após diferenciação de epimastigotas para amastigotas. Entretanto, estudos comparativos de susceptibilidade a drogas entre cepas do T. cruzi não detectaram correlação entre susceptibilidade a droga “in vitro” comparado com testes “in vivo” (Scott e Matthews, 1987; Neal e Van Bueren, 1988; Ribeiro- Rodrigues et. al., 1995). Diante disso, com o objetivo de obter um modelo de resistência do T. cruzi a drogas mais próximo do que acontece no homem, Murta & Romanha (1998) fizeram a seleção “in vivo” de uma população de T. cruzi e clones resistentes para o benzonidazol.

  Murta e colaboradores (1998) realizaram um estudo com 45 cepas de T. sensíveis e naturalmente resistentes ao benzonidazol e nifurtimox analisando 6

  cruzi

  diferentes marcadores moleculares. Nesse estudo, o perfil heterozigoto (Zimodema B), agrupou exclusivamente cepas sensíveis e ocorreu principalmente em áreas geográficas onde o tratamento da doença de Chagas tem sido relatado como mais eficaz, demonstrando que este zimodema está associado ao fenótipo de sensibilidade a drogas pelo T. cruzi. Já os perfis isoenzimáticos Z1 e Z2 foram encontrados em populações de sensíveis e naturalmente resistentes a drogas.

  T. cruzi

  Em abril de 1999, durante o Simpósio Internacional Comemorativo dos 90 anos da descoberta da doença de Chagas, no Rio de Janeiro, foi adotada a subdivisão da espécie de T. cruzi em dois grupos principais. O grupo T. cruzi I está associado com o ciclo de transmissão silvestre e infecção de marsupiais (Clark et al., 1994). O grupo T.

  cruzi

  II apresenta cinco sub-grupos chamados: IIa, IIb, IIc, IId, e IIe (Brisse et al., 2000) e está associado com o ciclo de transmissão doméstico envolvendo mamíferos placentários (Briones et al., 1999).

  

Introdução

  A preocupação pela identificação de marcadores moleculares que caracterizam a susceptibilidade ou resistência do T. cruzi a drogas é importante porque possibilita uma futura utilização no prognóstico de cura da doença de Chagas (Murta e Romanha, 1998).

  1.4- Genoma do T. cruzi

  Informações a respeito da organização estrutural e expressão do genoma do

  

T. cruzi são de grande interesse, uma vez que o ciclo de desenvolvimento do parasito e

  os mecanismos de infecção são direcionados pela modulação e expressão da informação contida no genoma nuclear.

  Uma das particularidades observadas no genoma do T. cruzi é a grande variação no conteúdo de DNA entre diferentes cepas e até mesmo entre clones de uma mesma cepa uma vez que diferenças de 30-70% no conteúdo total de DNA foram observadas (Mcdaniel e Dvorak, 1993). Diante disso, um primeiro passo para o seqüênciamento genômico do T. cruzi, foi escolher uma das várias cepas. A cepa escolhida foi a CL Brener que pertence ao subgrupo IIe. Esta escolha foi feita porque esta cepa está muito bem caracterizada em diferentes aspectos biológicos e moleculares (Zingales B. et.al., 1997), e por ser aparentemente um híbrido derivado de T. cruzi I (Brisse et. al., 1998; Machado, C. A. et. al., 2001; Gaunt et. al., 2003; Brisse et. al., 2003).

  A organização dos genes nos tripanosomas difere daquela conhecida em outros eucariotos. A maioria dos genes codificadores de proteínas estão presentes em múltiplas cópias na célula, sendo o espaçamento entre os genes de um dado arranjo bem curto (variando de 100 até algumas centenas de pares de base). Genes que codificam tubulinas, calmodulinas, ubiquitinas, antígenos de superfície de membrana e enzimas da via glicolítica existem em arranjos em “tandem” no genoma (Ullu e Nilsen, 1995; El- Sayed et al., 2005).

  Os resultados do seqüenciamento genômico revelaram que a cepa CL Brener apresenta um genoma diplóide com 22.570 proteínas preditas. Dos genes que codificam essas proteínas 12.570 representam pares de alelos. Seu genoma (100-200 x

  

Introdução

  6

  10 pb) possui um tamanho relativamente maior que o tamanho dos genomas de outros

  6

  parasitos, como, por exemplo, Leishmania (45-65 x 10 pb) e Trypanosoma brucei (25

  6

  x 10 pb), porém, a complexidade do genoma do T. cruzi é significativamente inferior à

  6 do genoma humano, cujo tamanho é da ordem de 3000 x 10 pb (El-Sayed et al., 2005).

  Mais de 50% do genoma consiste de seqüências repetitivas tais como retrotransposons e genes para grandes famílias de moléculas de superfície, como: Trans-sialidases, mucinas, gp63s e uma grande família (contendo pelo menos 1300 cópias) de genes de mucinas-associadas a proteínas de superfícies. (El-Sayed et al., 2005).

  As análises dos genomas do T. cruzi, T. brucei e L. major (Tritryp) evidenciaram diferenças em relação a outros eucariontes no reparo de DNA (estes organismos são capazes de catalisar mais vias de reparo), início da replicação (os Tritryp apresentam uma maquinaria de início de replicação diferente dos eucariontes superiores) e DNA mitocondrial (El-Sayed et al. 2005).

  Uma das características mais marcantes da família trypanosomatidae é a presença do cinetoplasto, uma região especializada na única mitocôndria da célula que contém o DNA mitocondrial ou do cinetoplasto, também conhecido como kDNA. O kDNA é uma estrutura complexa, organizada como uma rede compacta constituída por dois tipos diferentes de moléculas de DNA: os maxicírculos e os minicírculos (Shapiro e Englund, 1995).

  Embora os Tritryp não apresentem muitas classes de moléculas sinalizadoras como por exemplo: receptores tipo serpentina, proteínas G heterotriméricas, muitas classes de receptores catalíticos, domínios de interação SH2 e SH3 e fatores de transcrição regulatórios, seus quinomas mostraram uma grande diversidade de proteínas quinases e fosfatases, o que sugere um papel importante da fosforilação na biologia celular destes parasitos (El-Sayed et. al., 2005).

  Através da utilização da técnica de eletroforese de campo pulsátil (PFGE), foi possível verificar que o genoma do T. cruzi está organizado em pelo menos 20-25 bandas cromossômicas variando de 300Kb a 1,6Mb e que alguns poucos cromossomos maiores que 1,6 Mb, se acumulam na zona de compressão (Henriksson et al., 1990). Uma otimização da técnica PFGE permitiu resolver esta zona de compressão revelando cromossomos de tamanho máximo em torno de 2,5-4Mb (Wagner e So, 1990; Cano et

  

Introdução

  al., 1995; Henriksson et al., 1995). Com essa técnica foi possível observar a existência de um grande polimorfismo no genoma de diferentes cepas do T. cruzi no que se refere ao número de bandas cromossômicas e a localização de determinados marcadores moleculares, entretanto, apesar desta variabilidade no cariótipo, a organização cromossômica em T. cruzi parece conservada em algum aspecto (Aymerich e Goldenberg, 1989 e Henriksson et al., 1995). A localização de vários marcadores genéticos em uma mesma banda cromossômica permitiu a identificação de oito grupos de ligações conservadas. Além disso, Henriksson e colaboradores (1993) observaram uma correlação entre a variabilidade do cariótipo com a classificação de zimodemas.

  É bom ressaltar que Porcele et al. (2003) promoveram um refinamento do cariótipo molecular do clone CL Brenner (cepa referência do projeto genoma do T.

  

cruzi ). Utilizando 210 marcadores genéticos para bandas cromossômicas separadas por

  PFGE, esse grupo identificou 61 marcadores específicos de cromossomos e dois cromossomos com tamanhos polimórficos. Além disso, esse grupo construiu o mapa integrado da banda cromossômica XX. O isolamento de marcadores cromossômicos específicos e o mapa físico das bandas cromossomais contribuíram muito para o seqüênciamento do genoma nuclear do parasito.

  Os esforços para o seqüênciamento genômico e localização cromossômica do T. cruzi, auxiliarão no entendimento da biologia do parasito, o que certamente permitirá o desenvolvimento de futuros alvos terapêuticos.

  1.5- Proteassoma e ubiquitinação

  O proteassoma 20S é um complexo proteolítico com peso molecular de 750 kDa, presente em archaeobactérias (Seemuller et al., 1995), leveduras (Hilt & Wolf, 1995), Entamoeba histolytica (Scholze et al., 1996), Leishmania mexicana (Robertson, 1999), Trypanosoma brucei brucei (Lomo, et al., 1997), T. cruzi (Gonzales et al., 1996) e em células de mamíferos. Este complexo está relacionado a várias funções biológicas nas células como: proteólise de proteínas anormais, controle do ciclo celular por meio da degradação seletiva de proteínas regulatórias (fatores de transcrição e ciclinas),

  

Introdução

  diferenciação celular, respostas a estresse, adaptação metabólica e resposta imune celular.

  O proteassoma de mamíferos apresenta 14 tipos diferentes de subunidades polipeptídicas, com peso molecular variando entre 22-34 kDa e pontos isoelétricos entre 4,5 a 8,7. Essas subunidades são agrupadas em duas famílias distintas: alfa e beta (Hendil et al., 1995), sendo as alfas estruturais e as betas catalíticas (Coux et al., 1996). Estudos utilizando microscopia eletrônica demonstraram a existência de uma estrutura cilíndrica constituída de quatro anéis superpostos, sendo os dois anéis externos, constituídos de sete subunidades alfa, e os anéis internos, constituídos de sete subunidades betas. Esse arranjo alfa1-7beta1-7beta 1-7alfa1-7 formam um “barril” com um canal central constituído de três cavidades, por onde passam as proteínas desenoveladas para serem degradadas. As duas cavidades externas estão localizadas nas interfaces entre os anéis alfa e beta. A terceira cavidade está localizada no centro do complexo e é formada pelos anéis beta. O complexo 20S apresenta uma atividade hidrolítica semelhante à caspase, tripsina e quimotripsina localizadas, respectivamente, nas subunidades beta-1,-2 e -5 (Tanaka, 1998). Cada uma dessas subunidades apresenta um resíduo de treonina na porção amino-terminal, o que caracteriza o proteassoma como membro da subfamília T1A de peptidases. Essa característica das subunidades catalíticas do proteassoma (único membro dessa subfamília) é que permitiu o desenvolvimento de inibidores específicos dessa protease. A estrutura do proteassoma

  20S encontra-se ilustrada na figura 2.

A B

  

Figura 2: Estrutura do proteassoma 20S. Em A, encontra-se representado de vermelho os

dois anéis heptaméricos constituídos pelas subunidades α, e de azul os anéis heptaméricos

internos contituídos de subunidades β. Em B, destacam-se as três cavidades formadas pelas

subunidades α e β, sendo o sítio catalítico representado de azul e formado pelas subunidades β.

Figura adaptada de Tanaka et al., 1998.

  

Introdução

  O proteassoma 20S pode se associar a outros complexos como: complexo regulatório 19S (também conhecido por Proteasome Activation 700) e Complexo 11S (também conhecido por Proteasome Activation 28). Quando o complexo 20S se associa ao complexo regulatório 19S, ocorre à formação do proteassoma 26S, que está envolvido no processo de degradação de proteínas poliubiquitinadas. O PA700 é constituído por subunidades diferentes, com peso molecular variando entre 25-110 kDa. Essas subunidades heterólogas são classificadas em dois subgrupos: subunidades com funções ATPásicas e não ATPásicas. O papel das ATPases está relacionado ao desenovelamento das proteínas e fornecimento de energia necessária a degradação seletiva. As subunidades não ATPásicas, como a RPN10 e RPN11, apresentam funções de reconhecimento de proteínas poliubiquitinadas e ação desubiquitinadora, respectivamente (Tanaka, 1998, Baumesteir et al., 1998). Diversas evidências experimentais sugerem que o proteassoma 20S, ligado ao ativador PA28 ou 11S, está envolvido no processo de apresentação de antígenos (Zhang et al., 1998). A figura 3 ilustra a estrutura do complexo 19S e o proteassoma 26S.

B A

  

Figura 3: Estrutura do complexo 19S e formação do complexo 26S. Em A, encontra-se

representado o complexo regulatório 19S formado por 6 subunidades ATPásicas representadas

por azul e 11 subunidades não ATPásicas representadas por círculos claros. O conjunto dessas

subunidades formam uma base e uma tampa. Em B, encontra-se representado o complexo 26S

formado pela união dos complexos 20S e 19S. Figura adaptada de Hicke L. 1999. Trends Cell

Biol. 9: 107-112.

  A ubiquitina é um polipeptídeo constituído por 76 aminoácidos, presente em todas as células eucarióticas, sendo encontrada no citosol, núcleo e superfície celular.

  

Introdução

  Em eucariontes superiores, um dos papéis da ubiquitina é marcar proteínas que serão degradadas via proteassoma. Este processo requer a participação de três famílias de enzimas: E1 (enzima ativadora da ubiquitina), E2 (enzima conjugadora de ubiquitina) e E3 (enzima ligante de ubiquitina), todas envolvidas concomitantemente no processo de conjugação da ubiquitina às proteínas (Jentsch, 1995; Finley, 1991; Wilkinson, 1995).

  Para a ubiquitinação de uma proteína alvo, inicialmente ocorre à formação de uma ligação tio-éster entre a carboxila terminal da ubiquitina e o grupo sulfidrila da enzima E1, sendo o ATP necessário para esta reação. Posteriormente, a ubiquitina ativada é transferida para uma sulfidrila da enzima E2 e, finalmente, a enzima E3 catalisa a transferência da ubiquitina de E2 para a proteína alvo (Wilkinson et al., 1995). Após sucessivos ciclos, as proteínas alvos vão tornar-se poliubiquitinadas, sendo que em alguns casos requer a participação da enzima E4 para esse processo (revisado por Hoppe T. 2005). Os passos da ubiquitinação encontram-se ilustrados na figura 4.

  

Figura 4: Poliubiquitinação de proteínas alvos. Esse processo de poliubiquitinação requer a

participação de três enzimas: E1: enzima ativadora, E2: enzima conjugadora e E3: enzima

ligante. Fonte: www.infom-firc.it

  

Introdução

  É importante ressaltar que esse processo de ubiquitinação é reversível. Existem enzimas desubiquitinadoras (Dubs) que podem promover a desubiquitinação de proteínas ligadas a ubiquitinas.

  1.6- Proteassoma e T. cruzi

  González e colaboradores (1996) foram os primeiros grupos a mostrar que os inibidores MG132 e lactocistina preveniam a transformação de tripomastigota em amastigota em meio axênico. No T. cruzi, o envolvimento do proteassoma na transformação estágio-específico de tripomastigota para amastigota tem recebido uma atenção especial por parte dos pesquisadores. O “turnover” de proteínas em tripomastigotas é dependente da via proteassoma-ubiquitina, sendo acentuada durante a transformação em amastigotas. Quando a atividade do proteassoma é inibida, profundas mudanças morfológicas ocorrem durante a transformação, demonstrando que as proteínas do citoesqueleto associadas ao flagelo são alvos da via dependente de ATP, ubiquitina e proteassoma (Gonzáles et al., 1996 e De Diego, J. et al.,2001).

  O proteassoma 26S da forma epimastigota do T. cruzi foi identificado como tendo um peso molecular de 1400 kDa, apresentando uma atividade quimotripsina- símile dependente de ATP ao substrato Suc-LLVY-Amc (De Diego, J.L. et al.,2001). Mais de 30 proteínas abrangendo 25-110 kDa foram detectadas no purificado de proteassoma 26S de T. cruzi (De Diego, J. et al., 2001).

  Zou C. B. e colaboradores (2000) clonaram e caracterizaram pela primeira vez os genes RPN1-1 (Regulatory-Particle Non-ATPase subunit 1) e RPN1-2 do proteassoma de T. cruzi. Além disso, esse grupo localizou a posição desses genes no DNA cromossomal (2300 e 1900 kb, respectivamente). Os produtos gênicos, Rpn1-1 e Rpn1-2, atuam como a Nas1, uma subunidade homologa a Rpn1 em Saccharomyces cerevisiae .

  A caracterização e identificação molecular das subunidades do proteassoma em parasitos protozoários é um campo incompleto. O uso de inibidores tais como, peptídeos aldeídos [N-carbobenzoxyl-Leu-Leu-leucinal (MG132)] e lactocistina, tem ajudado a definir o papel do proteassoma em vários processos realizados pelos parasitos protozoários. Na Entamoeba invadens, Entamoeba histolytica e Leishmania mexicana,

  

Introdução

  os inibidores lactocistina e MG132 bloquearam o crescimento do parasito e previniram a encistação (Makioka, A. et al. 2000 e Robertson, C.D 1999); no Plasmodium berghei, a lactocistina bloqueou a replicação, porém, não impediu a entrada do parasito nas hemácias (Gantt, S.M. et al. 1998); no Plasmodium falciparum, a lactocistina bloqueou a replicação de linhagens sensíveis e resistentes a cloroquinona (Certad, G. et al. 1999); no T. brucei, a lactocistina bloqueou a progressão do ciclo celular, contudo, não inibiu a diferenciação de formas sangüíneas em formas procíclicas (Nkengu-Njinkeng, J. et al. 2002); finalmente, no T. cruzi, o MG132 e a lactocistina inibiram a transformação da forma tripomastigota em amastigota, no entanto, não bloquearam a invasão celular (De Diego, J. et al. 2001).

  Diferenças entre proteassomas dos protozoários e dos mamíferos envolvem imunoreatividade (Trypanossoma e Toxoplasma) e atividades de peptidases, nos mamíferos a atividade principal é quimotripsina-símile, enquanto que no T. cruzi a atividade principal é tripsina-símile (revisado por Paugam A. et al., 2003).

  Essas diferenças reforçam a possibilidade do proteassoma servir como um futuro alvo terapêutico. Entretanto, a limitada informação sobre a biologia do proteassoma de T. cruzi e a natureza das diferenças observadas com os proteassomas de mamíferos requer estudos mais aprofundados tanto na parte estrutural quanto funcional para que se torne concreto o uso de drogas específicas que bloqueiam o proteassoma do T. cruzi.

  Objetivos

2- Objetivos

  

Objetivos

  Considerando que uma das características marcantes do T. cruzi é a grande heterogeneidade tanto genômica como fenotípica, entre as cepas e também clones de uma mesma cepa, entendemos que este parasito constitui não só um bom modelo para avaliar a relevância biológica da via ubiquitina-proteassoma como também um bom exemplo de um organismo onde alterações na proteólise mediada pelo proteassoma poderiam influenciar comportamentos biológicos como taxa de crescimento, patogenicidade e susceptibilidade às drogas.

  Diante destas considerações, este trabalho teve como objetivo geral estudar aspectos moleculares e bioquímicos do proteassoma 20S em cepas com o fenótipo de resistência e susceptibilidade a drogas. De modo a estabelecer estas correlações, utilizamos as cepas do T. cruzi: 17LER, com resistência induzida “in vitro” ao benzonidazol (BZ) e seu par sensível 17WTS; BZR com resistência selecionada “in vivo” ao BZ e seu par sensível BZS; CL (sensível) e Colombiana (naturalmente resistente ao BZ) e os seguintes objetivos específicos:

  1- Localizar os genes beta-1, -2 e -5 nos cromossomos do parasito; 2- Verificar o tamanho desses transcritos por Northern Blot; 3- Determinar o número de cópias, utilizando a técnica de Southern blot; 4- Investigar a presença de conjugados proteína-ubiquitina; 5- Analisar os níveis de proteassoma 20S; 6- Avaliar as atividades peptidásicas semelhantes à caspase, tripsina e quimotripsina do proteassoma 20S.

  Material e Métodos

3- Material e Métodos

  

Material e Métodos

3.1-Obtenção de cepas

  Todas as cepas utilizadas neste trabalho foram gentilmente cedidas pelo Laboratório de Parasitologia Celular (Centro de Pesquisa René-Rachou, Fiocruz) e encontram-se representadas na tabela 1. Os blocos dos parasitos utilizados na técnica de PFGE foram também cedidos pelo Laboratório de Parasitologia Celular (Centro de Pesquisa René-Rachou Fiocruz). Além das cepas listadas na tabela abaixo, foram utilizadas as cepas Yuyu, Noel, Berenice, Ja e Romano na técnica de PFGE.

  Tabela 1- Característica das cepas utilizadas neste trabalho.

Cepas Origem Hospedeiro Susceptibilidade* Zimodema

  17WTS México Triatomíneo Susceptível

  1

  17LER México Triatomíneo Resistente

  1 Caso Agudo BZS São Paulo Susceptível

  2 Humano Caso Agudo

  BZR São Paulo Resistente

  2 Humano Cl RGS** Triatomíneo Susceptível B

  Caso Crônico Colombiana Colômbia Resistente

  1 Humano

  • * Susceptibilidade ao Benzonidazol (Murta e Romanha, 1998; Nirdé et al, 1995;

    Filardi & Brener, 1987).
    • **RGS= Rio Grande do Sul 3.2-Extração de RNA total e verificação da integridade

  Nos experimentos de extração de RNA, a água utilizada foi inicialmente tratada com dietilpirocarbonato (DEPC-Sigma) na proporção de 1/1000, deixada em repouso por 12 horas e a seguir esterilizada com auxílio de uma autoclave, 1 atm 120°C, para tornar-se isenta de RNases. Todos os materiais, tais como: ponteiras, tubos eppendorfs, e vidrarias foram lavados com água DEPC e autoclavados por 40 minutos.

  8 Para a extração de RNA total, 2x10 epimastigotas foram adicionadas a 1

  mL de Trizol (Gibco-BRL). A seguir a mistura foi homogenizada com o auxílio de um vórtex durante 3 vezes de 30 segundos. Os homogenados foram incubados por 40 minutos à temperatura ambiente. Após este intervalo foram adicionados 200 µL de

  

Material e Métodos

  clorofórmio ao homogenado, e estes agitados vigorosamente por 1 minuto em vórtex. A mistura resultante foi incubada por 20 minutos à temperatura ambiente e a seguir centrifugada por 10 minutos a 10.000 xg. A fase aquosa foi então transferida para um eppendorf de 1,5 mL e adicionado 500 µL de isopropanol (Sigma). A mistura foi homogenizada por inversão e incubada por 30 minutos a -20ºC. Após este período os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 10.000 xg e o sobrenadante descartado. O precipitado foi lavado com etanol 70% e centrifugado por 5 minutos a 10.000 xg, descartando novamente o sobrenadante.

  Posteriormente, o RNA total foi mantido por 20 minutos à temperatura ambiente para a evaporação total do etanol. A seguir, foi ressuspenso em 25 a 50 µL de água DEPC. Para quantificar o RNA, foram diluídos 4 µL da solução em 1000 µL de água. A leitura foi processada em 260 e 280 nm, para estimar o grau de contaminação com proteínas. Segundo SAMBROOK e Cols., (1989), 1 unidade de absorção na DO a 260 nm corresponde a 40 µg de RNA/mL.

  A integridade da preparação foi verificada em gel de agarose a 1,2% em MOPS 1X diluído com água DEPC (Mops 21g, Acetato de sódio diidratado 3,4g, EDTA tetrassódico 1,9g, água DEPC 500mL, o pH 7 e autoclavado) e encontra-se representado na figura 5. Antes de aplicar as amostras no gel, 10 µg de RNA foram adicionados a 15µl de tampão de amostra (formamida 187,5 µL, formaldeído 27,5 µL, Mops 10X 37,5 µL, azul de bromofenol [100mg/mL] 1 µL, água DEPC 42 µL e brometo de etídeo 0,5 µL). Essa mistura foi desnaturada por 15 minutos a 65°C, seguida de banho de gelo por 3 minutos. As amostras foram aplicadas no gel e adotou- se uma voltagem de 45 a 50 volts sendo o tampão de corrida MOPS 1X. O padrão de RNA (0,24 a 9,5 Kb Gibco) foi tratado nas condições descritas acima.

  S R T E L

S R

L W Z Z L O C

  17 2,1 1,7 1,3

  

Figura 5: Análise em gel de agarose/formaldeído do RNA total de T. cruzi. Cerca de 5 µg

de RNA total obtido como descrito no item 3.2 foram analisados.

  

Material e Métodos

3.3-Transferência dos RNAs para a membrana de náilon

  Após a corrida eletroforética, o formaldeído foi retirado do gel de agarose por meio de duas lavagens de 30 minutos cada, com solução de SSC 10X (solução estoque de SSC 20X= cloreto de sódio 175,3g, citrato trissódico 88,2g e água q.s.p 1000 mL em pH=7,0). O sistema de transferência foi montado de acordo com a seqüência: travessa de vidro Pirex (25 x 16 x 5 cm) contendo1000 mL de SSC 10X e uma espuma com densidade 23, quatro papéis Whatman 3 mm de 16x16 cm, gel de agarose invertido com tamanho 15x15cm, uma membrana de náilon (Genescreen plus) 15x15 cm previamente molhada em água (rapidamente) e incubada durante 10 minutos em SSC 10X, quatro papéis Whatman 3 mm 15x15 cm molhados em SSC 10X (neste momento uma pipeta estéril foi rolada por cima dos itens mencionados para retirar as bolhas) e, finalmente, uma pilha de papel toalha (25 cm), uma placa de vidro e um peso de 0,5 Kg foram colocados em cima de todo o conjunto. A transferência dos RNAs do gel para a membrana, ocorreu por 12 horas à temperatura ambiente.

  Após a transferência a membrana foi exposta a luz ultra violeta durante 5 minutos para fixar o RNA na membrana. Em seguida a membrana foi lavada por 10 minutos em SSC 2 X e acondicionada em papel Whatman 3mm até o uso.

  3.4- Extração de DNA genômico

  8 Para a extração de DNA genômico, um sedimento contendo 4x10

  epimastigotas foi ressuspendido em 500 µL de tampão de extração (Tris/EDTA 50/1) e homogeneizado em vórtex. Após as células serem ressuspendidas, foram adicionados 100 µL de SDS 10% e 50 µL de proteinase K (20 mg/mL), incubando a solução por 2 horas até completa homogenização. Foi adicionado, então, 250 µL de NaCl 5M, e o conteúdo incubado por 10 minutos a 65ºC. Após este período, 100 µL de CTAB/NaCl 10% foram adicionados e os tubos eppendors foram incubados por 20 minutos a 65ºC. Posteriormente as extrações com clorofórmio-álcool isoamílico (24:1) o DNA foi precipitado pela adição de igual volume de isopropanol a -20ºC por 30 minutos, centrifugado a 10.000 rpm, lavado com etanol a 70%, seco, ressuspendido em 60 µL de

  

Material e Métodos

  água milli-q e armazenados a 4ºC. A integridade do DNA genômico, foi analisada em gel de agarose a 0,7% corado com brometo de etídeo.

  3.5- Digestão do DNA genômico com enzimas de restrição e transferência para membrana de náilon (Southern Blot)

  Cerca de 5 µg de DNA genômico (DNAg) foram digeridos com uma quantidade apropriada de diversas enzimas de restrição, durante 16 horas, segundo recomendações do fabricante. As enzimas de restrição utilizadas para o gene beta 1 (855pb) foram: BamHI que corta o gene uma vez na posição 762 e XbaI que não corta o gene. Para o gene beta 2 (906pb) foram utilizadas: XhoI que corta o gene uma vez na posição 449 e XbaI que não corta o gene. Finalmente, para o gene beta 5 (933pb) foram utilizados: BamHI que corta uma vez na posição 148 e EcoRI que não corta o gene. Os fragmentos de DNA gerados foram submetidos a uma corrida em gel de agarose 0,7% sob uma voltagem de 40 V. Posteriormente, o gel foi corado com brometo de etídeo (0,5 µg/mL) durante 30 minutos, e lavado por 5 minutos para documentação.

  Após a obtenção do gel, antes de procedermos a transferência dos fragmentos de DNAg para as membranas de náilon (Genescreen plus), desnaturamos o DNA mergulhando o gel numa solução de HCl 0,25M por 15 minutos. Em seguida o gel foi neutralizado mergulhando-o em uma solução de NaOH 0,5M e NaCl 1,5M por 15 minutos a temperatura ambiente (esta operação foi repetida mais uma vez). O gel foi então equilibrado numa solução de NaCl 1,5M e Tris-HCl 0,5M pH7,4 por 2 vezes de 20 minutos. O aparato de transferência foi então montado para a transferência dos fragmentos de DNAg para a membrana de náilon. Decorridos 18 horas, o sistema foi desmontado, e os fragmentos de DNA foram imobilizados na membrana de náilon utilizando luz ultravioleta. Após a imobilização, a membrana foi lavada com SSC 2X por 10 minutos.

  

Material e Métodos

3.6- Eletroforese em Gel de Campo Alternado (PFGE)

  A metodologia PFGE foi utilizada para localizar os genes (β1, β2 e β5) nos cromossomos do T. cruzi. A eletroforese de pulso alternado foi realizada utilizando o

  TM

  aparelho “gene navigator system” (Pharmacia). Os blocos contendo as diferentes cepas do T. cruzi foram cedidos pelo Laboratório de Parasitologia Celular (LPCM/Fiocruz-BH). Os blocos foram colocados nos poços do gel de agarose à 1% em tampão TBE 1X. A corrida eletroforética foi realizada com uma voltagem constante de

  o

  180Volts (10-12 mA) a 9

  C. Conforme as condições padronizadas no laboratório LPCM foram aplicados pulsos homogêneos (N/S, L/O) de 70 seg por 9h, 90 seg por 24h, 200 seg por 17h e 400 seg por 22h, sem interpolação. O gel foi corado com brometo de etídio (1µg/ml) e documentado pelo sistema Eagle Eye Stratagene II.

  3.7- Transferência dos cromossomos do Gel de PFGE para a membrana de náilon

  O DNA foi desnaturado incubando o gel em uma solução de HCl 0,25 M por 2 vezes de 20 minutos. A seguir o gel foi neutralizado em uma solução NaOH 0,5M e NaCl 1,5M e submetida a incubação por 2 vezes de 15 minutos. Finalmente, a solução foi descartada e o gel incubado por 2 vezes de 20 minutos em uma solução de NaCl 1,5M e Tris-HCl 0,5M pH 7,4. Posteriormente, os cromossomos foram transferidos para a membrana de náilon conforme descrito no item 3.5. Após a transferência, os cromossomos foram fixados na membrana pela exposição por 5 minutos em luz ultravioleta e a seguir lavada por 10 minutos em uma solução de SSC 2X.

  3.8- Obtenção dos cDNAs

  Os oligonucleotídeos utilizados para a obtenção dos cDNAs correspondentes aos genes das subunidades beta-1, -2 e -5 do proteassoma 20S, foram desenhados com base nas seqüências de nucleotídeos (EST) de T. cruzi, depositadas no

  • 150 GeneDB, que apresentaram homologia significativa (> que e ) com seqüências de T.

  

Material e Métodos

  , Leishmania sp e Plasmodium sp. Todas estas seqüências encontram-se

  brucei

  disponíveis em www.genedb.org/genedb/tcruzi. A Tabela 2 apresenta o número de acesso dos genes, o tamanho dos genes amplificados, o desenho dos iniciadores e a temperatura de anelamento adotada.

Tabela 2- Número de acesso, seqüência dos iniciadores, tamanho esperado e temperatura de anelamento para os genes Beta-1, -2 e -5

  Gene Número de acesso Seqüência dos iniciadores Tamanho T. M Tc00.1047053507603.40 F:5’GGAGCATTGCTTCATGAG3’ 798pb Beta-1

  50°C Tc00.1047053509429.110 R:5’TCGCAGAGCTGCTGAATG3’ Tc00.1047053508461.430

  F: 5’TGGTTATTATGGCATGTG3’ Tc00.1047053510287.30 809pb Beta-2

  51°C R: 5’TGTTTCGGGTACTTACGC3’ Tc00.1047053503891.100 Tc00.1047053507639.40 F:5’CAACGCTTAGCTCGTATG3’

  805pb Beta-5 49°C Tc00.1047053503781.70 R:5’CTACAACACGTAGCGATC3’

  TM = Temperatura de Anelamento.

  A primeira fita do cDNA foi obtida utilizando 5 µg de RNA total e o kit thermoscript RT-PCR (GIBCO-BRL). As condições para esse experimento foram exatamente iguais às fornecidas pelo fabricante.

  Para a obtenção do cDNA, utilizamos um programa de amplificação com 35 ciclos, cada um composto por: uma etapa de desnaturação 95°C por 1 minuto, 1 minuto de anelamento (conforme indicado na Tabela 2) e 1 minuto e 30 segundos de extensão a 72°C. A seguir uma alíquota dessa reação foi analisada em gel de agarose a 1,2%, e os cDNAs visualizados pela coloração com brometo de etídeo. A identidade do produto obtido foi confirmada por seqüênciamento.

  Essa mesma condição de amplificação também foi utilizada para obter os respectivos fragmentos genômicos desses genes. Nestes experimentos utilizamos 600ng

  

Material e Métodos

  de gDNA obtido conforme descrito no item 3.4. Esses resultados encontram-se representados na figura 6.

  Β eta-1 Β eta-2 Β eta-5 800 pb

Figura 6: Gel de agarose 1,2% corado com brometo de Etídeo. Amplificação dos genes

beta-1, -2 e -5, com diferentes temperaturas de anelamento (50, 51 e 49ºC, respectivamente).

  3.9- Purificação dos cDNAs

  Foram adicionados 15 µL de acetato de sódio 3M, pH 7, e 375 µL de etanol absoluto em 150 µL dos cDNAs obtidos como descrito no item 3.8. Essa mistura foi incubada a -20°C por 30 minutos, seguida de uma centrifugação por 10 minutos a 14.000 xg sendo o sobrenadante descartado. A seguir, 500 µL de etanol 70% foram adicionados ao precipitado seguido de uma centrifugação a 14.000 xg por 5 minutos. O sobrenadante foi novamente descartado e o precipitado ressuspendido em 10 µL de água estéril. Após a purificação uma alíquota foi analisada em gel de agarose.

  3.10- Obtenção das sondas

  32 Para marcação do DNA com P , foram utilizados 5 µL dos cDNAs

  purificados e 33 µL de água. As amostras foram incubadas a 96ºC por cinco minutos, seguido de banho de gelo por 2 minutos. Após a desnaturacao, foi adicionado à mistura 5 µL de mix dNTP menos dCTP, 5 µL do fragmento Klenow da DNA polimerase I

  32

  (AMBOS DO KIT nicktranslation – INVITROGEN) e 2 µL de dCTP marcado com P na posição α, este último manipulado dentro da câmara de acrílico. A solução foi então incubada a 16ºC por uma hora, sendo a reação interrompida pela adição de tampão de parada, fornecido pelo kit. Para a remoção dos nucleotídeos não incorporados, as sondas foram purificadas em uma coluna de Sephadex G-50, previamente equilibrada com o tampão NT (Tris-HCL 10 mM, NaCl 50 mM, EDTA 0,1 mM pH=8,0).

  

Material e Métodos

  Para a obtenção das sondas não radioativas, utilizamos como molde 250 ng dos cDNAs correspondentes aos genes beta-1, -2 e -5. As sondas marcadas com fosfatase alcalina foram obtidas utilizando o kit Gene Images AlkaPhos direct Labeling (Amersham Biosciences), conforme instruções do fabricante.

  and Detection System 3.11- Reação de hibridização

  Primeiramente, as membranas de náilon foram pré-hibridizadas, em cilindros, com a solução de pré-hibridização (Tampão Fosfato de Sódio 0,5 M pH 6,8, EDTA 0,5 M, água destilada, BSA 5%, SDS 7%). Foi utilizada a temperatura de 56°C para hibridizar as membranas de Northern e Southern e 60°C para hibridizar as membranas de PFGE. As membranas foram incubadas em forno de hibridização durante 1 hora.

  Depois desse período, foi adicionada a sonda radioativa, previamente

  8

  desnaturada por 5 minutos a 100°C, com atividade específica de 2x10 µCi/µL. A reação de hibridização foi realizada durante 16 horas, sob agitação leve.

  As membranas a serem marcadas não radioativamente foram acondicionadas em sacos plásticos com cerca de 20 mL de tampão de hibridação (0,25

  2 mL/cm ). Esse conjunto foi pré-hibridado em banho Maria a 55°C por 30 minutos.

  Após este intervalo, foram adicionados 32 µL da sonda específica marcada com fosfatase alcalina, e a reação foi incubada por 18 horas em banho Maria a 55°C.

  3.12- Lavagem das membranas

  Decorrido o tempo de hibridização adotamos 2 protocolos distintos de lavagem utilizando a solução de SSC 2X e 0,1% de SDS. As membranas de PFGE foram lavadas com 75mL da solução por duas vezes de 15 minutos a temperatura ambiente. As membranas de northern e southern foram lavadas com 50ml da solução por 2 vezes de 20 minutos ( a primeira lavagem a 50ºC e a segunda a temperatura ambiente). As membranas foram secadas em papel de filtro por aproximadamente 2 horas em temperatura ambiente.

  

Material e Métodos

  As membranas marcadas com sondas não radioativas foram transferidas para novos sacos plásticos e lavadas duas vezes de 10 minutos a 55°C com tampão primário (uréia 2M, SDS 0,1%, fosfato de sódio 0,5M pH 7, NaCl 150mM, MgCl

  2

  1mM, reagente de bloqueio 0,2%). As membranas foram transferidas para recipientes plásticos e lavadas por 2 vezes de 5 minutos a temperatura ambiente sob agitação com tampão secundário (solução estoque 20 vezes: Tris-Base 1M, NaCl 2M, pH 10). Após este período elas foram secadas em papel de filtro.

  3.13- Autoradiografia

  Para verificar as regiões de homologia, as membranas marcadas com radioativo foram embrulhadas em sacos plásticos e acondicionadas em cassetes contendo intensificadores e filmes Kodak (X-OMAT-XAR-5). Os cassetes foram acondicionados a -70ºC por 1 semana. As revelações foram feitas com as soluções da Kodak, de acordo com as instruções do fabricante (Revelador e Reforçador GBX Kodac e Fixador e Revelador GBX Kodac).

  As membranas marcadas não radioativamente foram acondicionadas em

  TM

  cassetes juntamente com 2 mL de reagente de detecção (CDP-Star , Amersham Bioscience). Esse conjunto foi deixado por 20 horas. As revelações foram feitas de acordo com as instruções do fabricante.

  

3.14- Obtenção do extrato bruto de proteínas totais do parasito

  homogeneização (Tris-HCl 5mM pH 8,0, glicerol 1%, EDTA 1mM, leupeptina 50µM e β -mercaptoetanol 1mM). A seguir, a mistura foi estocada em banho de gelo e sonicada em sonicador adotando-se 4 pulsos de 45 segundos com intervalos de 1 minuto.

  A determinação da concentração protéica presente no extrato bruto, foi realizada segundo o método do BCA (SMITH et al., 1985). Para a construção da curva- padrão foi utilizada uma solução de soroalbumina bovina a 100 µg/mL em diversas diluições.

  

Material e Métodos

3.15- Preparação de fração enriquecida de proteassoma

  homogeneizadas em 1mL de tampão 20S (Tris-HCl 25 mM pH=7,5; DTT 1 mM, Glicerol 10%, EDTA 1mM, Leupeptina 1 mM, NEN 10 mM). O homogenado foi transferido para um eppendorff e submetido a uma sonicação por quatro vezes de 45 segundos a 60 watts com intervalo de 30 segundos em banho de gelo. A seguir, as amostras foram centrifugadas por 20 minutos a 10.000 g e o sobrenadante descartado.

  Feito isso, o material resultante foi ultracentrifugado por 1 hora a 100.000 g. Posteriormente, o sobrenadante foi transferido para um novo eppendorf e centrifugado por 6 horas nas mesmas condições. O precipitado foi ressuspendido em 100 µL do tampão 20S. A determinação da concentração protéica foi realizada segundo o método de Lowry (1951), usando soro albumina bovina para a construção da curva padrão.

  3.16- SDS-PAGE e ensaios de Western Blot

  Cerca de 20 µg de extrato bruto ou 5 µg da fração enriquecida de proteassoma foram fracionados em gel de SDS-PAGE 10% como descrito por Laemmli (1970). Foi utilizado como padrão de peso molecular o MultiMark Multi-Colored Standart (Invitrogen). A voltagem adotada foi de 120 Volts. Após a corrida, um dos géis foi corado com comassie blue. O outro gel foi preparado para a transferência de acordo com o método descrito por TOWBIN e Cols., 1979, com modificações no tampão de transferência (Tris-HCl 25 mM pH 8,3, glicina 192 mM, etanol 18% e SDS 0,02%). A voltagem aplicada no sistema foi de 25 Volts a uma temperatura de 4ºC por 16 horas. Após o término da transferência, a membrana foi corada com Ponceau (0,25% em ácido acético 1%) por 5 minutos e descorada com água para visualização das proteínas.

  Posteriormente, a membrana foi bloqueada por 16 horas a 4°C com TBS-T (Tris-HCl 50 mM pH 8,3, NaCl 150 mM, Tween-20 0,05% e leite desnatado em pó 5%) e submetida a immunoblot. Após o bloqueio, a membrana de PVDF foi lavada 3 vezes em TBS-T e incubada com anticorpo primário (anti-subunidades α para detectar o

  

Material e Métodos

  proteassoma 20S e anti-ubiquitina para detectar proteínas ubiquitinadas) numa diluição 1:1000 em TBS-T por 3 horas à temperatura ambiente. O anticorpo foi removido e a membrana lavada três vezes rapidamente com TBS-T. Em seguida a membrana foi incubada por 1 hora, à temperatura ambiente, com o anticorpo secundário (anti-IgG de rato conjugado com fosfatase alcalina para a detecção das subunidades α e anti-IgG de coelho conjugado com fosfatase alcalina para a detecção de proteínas ubiquitinadas) na diluição 1:1000. Após este período, a membrana foi lavada por três vezes durante 5 minutos em tampão de revelação (Tris pH=9,5, NaCl 5M, MgCl2 1M e H2O q.s.p 100ml). Finalmente, foram adicionados 5 mL de tampão de revelação colorimétrica, 66 µL de NBT e 33 µL de BCIP agitando-se o conteúdo por 30 minutos.

  

3.17- Medida da atividade proteolítica exógena dos parasitos

  Nos ensaios da atividade proteolítica exógena foram utilizados diferentes substratos fluorogênicos como: Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-7-amido-4-metilcumarina, Cbz- Gly-Gly-Arg-7-amido-4-metilcumarina e Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-7- amido-4- metilcumarina para a determinação das atividades semelhantes a caspase, tripsina e quimotrisina, respectivamente, do proteassoma na fração citosólica das formas epimastigotas de T. cruzi.

  Foram utilizados 50µg de proteínas totais que foram obtidas após centrifugação a 100000xg por 2 horas e 13µM dos substratos fluorogênicos. O tampão utilizado foi Tris-HCl 50mM pH 8,0 e MgCl 10mM, na presença ou ausência do

  2

  inibidor MG132. O ensaio foi realizado num volume final de 240 µL com incubação de 30 minutos a 37°C cuja interrupção foi feita pela adição de 2 mL de etanol. A seguir a reação foi incubada em gelo por no mínimo 1 hora, e o material posteriormente centrifugado durante 10 minutos a 2500 rpm em centrífuga. As leituras fluorimétricas foram realizadas nos comprimentos de onda 380 nm (excitação) e 440 nm (emissão) e os resultados, expressos em unidades de fluorescência por µg de proteína.

  Resultados

4- Resultados

  

Resultados

4.1- Localização Cromossômica dos genes beta-1, -2 e -5

  Para a localização cromossômica dos genes Beta-1, -2 e -5 utilizamos a técnica de eletroforese em gel de campo alternado (PFGE) como descrito em Material e Métodos. As figuras 7A, 8A e 9A mostram o perfil cromossômico das amostras de T.

  

cruzi coradas com brometo de etídio. Observamos um perfil heterogêneo de bandas

  cromossômicas entre as diferentes cepas do parasito, variando de 800 a 3000 Kb. Os cromossomas foram transferidos do gel de agarose para a membrana de náilon, conforme descrito em Material e Métodos. A hibridização dos cromossomas com as sondas dos genes Beta-1, -2 e -5 (figuras 7B, 8B e 9B) mostrou heterogeneidade de tamanho e número dos cromossomas entre as diferentes populações do T. cruzi que contém estes genes.

  A hibridização dos cromossomas com a sonda do gene Beta-1 (Fig. 7B), mostrou que este gene está localizado em bandas cromossomais entre 1640 e 1100 Kb, uma vez que observamos uma forte intensidade de hibridização da sonda nesta região. Algumas cepas apresentaram fraco perfil de hibridização (17LER, Yuyu e Colombiana), mas mesmo assim podemos visualizar bandas nesta região. Na amostra 17WTS observamos claramente a presença do gene Beta-1 nas bandas cromossomais de 1640, 1120 e 1100 Kb.

  O perfil de hibridização com a sonda Beta-2 (Fig. 8B) não esta muito bem definido, pois várias bandas cromossomais foram reconhecidas pela sonda, porém com baixa intensidade. Este experimento está sendo repetido com uma seqüência mais específica, diferente daquela inicialmente usada como sonda. Em relacão ao gene Beta- 5 (Fig. 9B), observamos que este gene está localizado principalmente em duas bandas cromossomais de 1640 e 1100 Kb em todas amostras do T. cruzi analisadas, com maior ou menor intensidade. Concluindo, observamos vários perfis de hibridização com as sondas dos genes Beta-1, -2 e -5, que não estão associados com o fenótipo de resistência do T. cruzi à drogas.

  Resultados

  A B

  Z1 Z2 Z1 Z2 ZB Z1 Z2 Z1 Z2 ZB S S U

U R L

R L

  ão T T E Y E Y E L E L M S R R M S R R dr

  W L W L U

U O O O

Z Z O E O L Z Z E O L

  Pa Y C N JA

  17

  17 B B Y C N B JA R C 1900

  17

  17 B B B R C 1640 1100 1120 915 945 815 1110 1120 1640 820 1100 Kb 1640 a 785 610 790 Figura 7: Localização cromossomal do gene beta-1 em cepas de T. cruzi com diferentes zimodemas e fenótipos de resistência a drogas. (A) Bandas cromossomais das cepas de T.

foram separadas por PFGE e coradas com brometo de etídeo. (B) Southern blots dos

cruzi

  32 cromossomos com uma sonda específica para o gene β1 marcado com P. O marcador de peso molecular foi obtido dos cromossomas de Saccharomyces cerevisae.

  A B

  ZB ZB Z1 Z2 Z1 Z2 Z1 Z2 Z1 Z2 S S U

  U R L R L T T ão E Y E Y

  L E L E M M

S R R S R R

dr W L U W L U O O O O

  Z Z E O L Z Z E O L B B Y C N B JA R B B Y C N B JA R 1640 1900 Pa

  17

  17 C 1640

  17

  17 C 1100 1120 785 945 610 610 450 555 375

  Figura 8: Localização cromossomal do gene beta-2 em cepas de T. cruzi com diferentes zimodemas e fenótipos de resistência a drogas. Em A, bandas cromossomais das cepas de T. cruzi foram separadas por PFGE e coradas com brometo de etídeo. Em B, Southern blots dos

  32 cromossomos com uma sonda específica para o gene β2 marcado com P. O marcador de peso molecular foi obtido dos cromossomas de Saccharomyces cerevisae.

  

Resultados

  B A

  ZB Z1 Z2 Z1 Z2 ZB Z1 Z2 Z1 Z2 S

  S R U L R U L T ão

  T E L E E E Y M L M

S R R S R Y R

dr W L W L O O

  O Z Z U E O L Z Z O E O L U C N JA C N Pa

  17

  17

  17 B B B JA R C 1900 1640 1640 Y 1100 1120 785 945 555 610 1100 225 295 375 450

  

Figura 9: Localização cromossomal do gene beta-5 em cepas de T. cruzi com diferentes

zimodemas e fenótipos de resistência a drogas. Em A, bandas cromossomais das cepas de T.

cruzi foram separadas por PFGE e coradas com brometo de etídeo. Em B, Southern blots dos

  32

cromossomos com uma sonda específica para o gene β5 marcado com P. O marcador de peso

molecular foi obtido dos cromossomas de Saccharomyces cerevisae.

  4.2- Determinação do número de cópias dos genes beta-1, -2 e -5.

  A técnica Southern blot foi utilizada para estimar o número de cópias dos genes beta-1, -2 e -5 no genoma do T. cruzi. Para isso, cerca de 5 µg de DNA genômico foram digeridos com enzimas de restrição e submetidos à eletroforese em gel de agarose 0,8%. As enzimas de restrição utilizadas nas digestões foram selecionadas com base no mapa de restrição teórico dos genes, utilizando o programa Gene Runner e/ou a base de dados contida no site da Baylor College of Medicine (BCM search launcher).

  Para o gene beta-1, utilizamos a enzima BamHI por apresentar sítio interno na seqüência e XbaI, que não apresenta sítio. O resultado de digestão do DNA com a enzima BamHI (Fig. 10B), mostrou que todas as cepas do T. cruzi analisadas apresentam um mesmo padrão de bandas, ou seja, a sonda reconhece bandas de 1.48, 1.61, 2.47, 2.7 e 3.6 Kb. Para a outra enzima analisada, XbaI, a sonda reconheceu três bandas de 1,47, 1,6 e 3,4 Kb, em todas as cepas em estudo. Desses resultados podemos concluir que há pelo menos 2 cópias do gene beta-1 por genoma haplóide do parasita.

  

Resultados

  A B

  XbaI BamHI XbaI BamHI

  S S S S R R R R T T T T E E E E

S R S R S R S R

W L W L W L W L Z Z L ol Z Z L ol Z Z L ol Z Z L ol

  17

  17 B B C C

  17

  17 B B C C

  17

  17 B B C C

  17

  17 B B C C 3,60 2,70 3,40 1,35 1,48 1,61 2,47 1,47 1,60 0,60 0,87 1,07

Figura 10- Análises de Southern Blot do gene beta-1 (855 pb) nas cepas do T. cruzi

sensiveis e resistentes ao BZ. Em A, o DNAg dos parasitos digeridos com as enzimas BamHI

(corta uma vez o gene na posição 766pb) e XBaI (que não corta o gene) foram separados em gel

de agarose a 0,7% em seguida foram transferidos para membrana de náilon. Em B, os genes

beta-1 da membrana de náilon foram hibridizadas com sondas não radioativas e exposta a filme

X-OMAT-XAR-5 (Kodak) representado na figura.

  Para o gene beta-2, utilizamos a enzima XhoI por apresentar sítio interno na seqüência e XbaI, que não apresenta sitio. A Figura 11B mostra que todas as cepas analisadas apresentam um mesmo padrão de bandas, ou seja, a sonda reconhece bandas com: 1,46, 1,68, 2,86 e 3,75Kb devido à presença de um sítio interno para a enzima XhoI. Para a outra enzima analisada, XbaI houve a presença de três bandas com 1,41, 1,55 e 3,19 Kb respectivamente, em todas as cepas em estudo. Semelhante ao gene beta-1, o gene beta- 2 também apresentou pelo menos 2 cópias por genoma haplóide do parasito.

  

Resultados

  A B

  XhoI XbaI XhoI XbaI

  S S S S R R R R T T T T E E E E S R S R S R S R W L W L W L W L Z Z L ol Z Z L ol Z Z L ol Z Z L ol

  17

  17 B B C C

  17

  17 B C C

  17

  17

  17 B B C C B

3,75

2,86

3,19 0,60 0,87 1,07 1,35

1,46

1,68

1,41 1,55

Figura 11- Análises de Southern Blot do gene beta-2 (906 pb) nas cepas do T. cruzi

sensíveis e resistentes ao BZ. Em A, o DNAg dos parasitos digeridos com as enzimas XhoI

(corta uma vez o gene na posição 229pb) e XBaI (que não corta o gene) foram separados em gel

de agarose a 0,7% em seguida foram transferidos para membrana de náilon. Em B, os genes

beta-2 da membrana de náilon foram hibridizadas com sondas não radioativas e exposta a filme

X-OMAT-XAR-5 (Kodak) representado na figura.

  Para o gene beta-5, utilizamos a enzima BamHI por apresentar sítio interno na seqüência e EcoRI, que não apresenta sitio. Na Figura 12B podemos notar que a sonda Beta-5 reconhece bandas com:

  0,33, 0,73, 1,07, 1,43, 1,59 e 3,03 Kb devido à presença de um sítio interno para a enzima BamHI. Para a enzima EcoRI houve a presença de três bandas com 1,55, 1,67 e 3,07 Kb respectivamente, em todas as cepas em estudo. Desses resultados podemos concluir que também há pelo menos 2 cópias do gene Beta-5 por genoma haplóide do parasito.

  

Resultados

  A B

  BamHI EcoRI EcoRI BamHI

  S S S S R R R R T T T T E E E E S R S R S R S R W L W L W L W L Z Z L ol Z Z L ol Z Z L ol Z Z L ol

  17

  17 B B C C

  17

  17 B B C C

  17

  17 B B C C

  17

  17 B B C C

3,07

3,03 1,07 0,87 1,35

1,55

1,67

1,07 1,59 1,43 0,73 0,60 0,33

  

Figura 12- Análises de Southern Blot do gene beta-5 (933 pb) nas cepas do T. cruzi

sensiveis e resistentes ao BZ. Em A, o DNAg dos parasitos digeridos com as enzimas BamHI

(corta uma vez o gene na posição 148pb) e EcoRI (que não corta o gene) foram separados em

gel de agarose a 0,7% em seguida foram transferidos para membrana de náilon. Em B, os genes

beta-5 da membrana de náilon foram hibridizadas com sondas não radioativas e exposta a filme

X-OMAT-XAR-5 (Kodak) representado na figura.

  4.3- Northern Blot

  A expressão dos genes que codificam para as subunidades Beta-1, -2 e -5 foram verificados utilizando a técnica de Northern blot. Com esses experimentos tivemos por objetivo estimar o tamanho dos transcritos codificados pelos genes, além de analisar se havia diferenças de expressão entre cepas sensíveis e resistentes ao BZ. Para isso, 15 µg de RNA total foram submetidos à eletroforese em gel de agarose formaldeído 1,2%, e posteriormente, transferidos por capilaridade em membrana de

  32

  náilon. As membranas foram hibridizadas com sonda radioativa ( P) e autoradiografadas em filmes Kodak (X-OMAT_XAR-5), conforme descrito em Material e Métodos.

  

Resultados

  O resultado apresentado na Figura 13A mostra que para o gene beta-1, além da mensagem com 1,09 Kb (esperado) também detectamos duas outras mensagens, fracas com 1,96 e 1,35 Kb, respectivamente. Na Figura 13B, mostramos a normalização da membrana utilizando como sonda o gene do rRNA 24S que reconhece uma banda de 1,84 Kb. Podemos notar que todas as amostras analisadas apresentam quantidades equivalentes de RNA. A razão entre o gene beta-1 e o rRNA 24S, considerado constitutivo em T. cruzi, sugere que não há aumento real de transcrição entre as diferentes cepas deste parasito, utilizadas neste trabalho.

  Para o gene beta-2, identificamos dois transcritos com 1,15 e 2,06 Kb , como poder ser observado na Figura 14A. Também podemos notar a presença de quantidades equivalentes de RNA entre as amostras estudadas e níveis equivalentes de RNA para o gene beta-2 nas cepas em estudo (figura 14B e 14C, respectivamente).

  A figura 15A mostra a presença de duas mensagens para o gene beta-5, com 1.17 e 2,03 Kb, respectivamente. Como mostram as figuras 15B e 15C, não observamos para o gene beta-5 variações nos níveis de RNA entre as diferentes cepas estudadas.

  Esses resultados sugerem que as bandas maiores e mais fracas, detectadas em todos os genes estudados podem representar transcritos policistrônicos, uma vez que apresentam o dobro do tamanho esperado e que o transcrito completo para os genes beta-1, -2 e -5 apresentam 1,09, 1,15 e 1,17 Kb, respectivamente.

  S R T E S R

  C

  W L Z Z L ol B B

  17

  A Beta-1

  1,96 1,35 COL

  A s CL

  1,09 BZR p a

1,09 e

C 17WTS 17LER BZS

  B 0,2 0,4 0,6 0,8 Razão transcrito/rRNA 24S 1 1,2

  1,84

  B

  

Figura 13- Níveis de mRNA do gene beta-1 em cepas de T. cruzi. 15 µg de RNA total foram

separados em gel de agarose/formaldeído 1,2% e transferidos para membrana de náilon . Em A,

encontram-se representados os transcritos marcados com sondas específicas para o gene beta-1.

  

Em B, temos a normalização utilizando genes constitutivos rRNA 24S. Em C, temos um gráfico

que representa a razão da intensidade entre o transcrito principal e o rRNA 24S.

  Resultados S R T E S R W L Z

  Z L ol B B

  C

  17

  2,06 Beta-2

  A COL CL

  1,15 C e p a s 17WTS 17LER BZS BZR 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,84

  B Razão transcrito/rRNA 24S

  Figura 14- Nível de mRNA do gene beta-2 em cepas de T. cruzi. 15 µg de RNA total foram separados em gel de agarose/formaldeído 1,2% e transferidos para membrana de náilon . Em A, encontram-se representados os transcritos marcados com sondas específicas para o gene beta-2.

  Em B, temos a normalização utilizando genes constitutivos rRNA 24S. Em C, temos um gráfico que representa a razão da intensidade entre o transcrito principal e o rRNA 24S.

  S R T E S R W L Z Z L ol B B

  C

  17

  2,03 Beta-5

  A COL CL

  1,17 a p s e C 17WTS 17LER BZS BZR 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,84

  B Razão transcrito/rRNA 24S

  Figura 15- Nível de mRNA do gene beta-5 em cepas de T. cruzi. 15 µg de RNA total foram separados em gel de agarose/formaldeído 1,2% e transferidos para membrana de náilon . Em A, encontram-se representados os transcritos marcados com sondas específicas para o gene beta-5.

  Em B, temos a normalização utilizando genes constitutivos rRNA 24S. Em C, temos um gráfico que representa a razão da intensidade entre o transcrito principal e o rRNA 24S.

  4.4- Detecção de conjugados proteína-ubiquitina.

  Em eucariontes superiores uma das funções da ubiquitina é a de modificações de substratos protéicos, formando conjugados proteína-ubiquitina. Nesta reação, diversas moléculas de ubiquitina são adicionadas a um substrato protéico num

  

Resultados

  processo denominado ubiquitinação. Desta forma, também foi de interesse neste trabalho verificar o perfil de proteínas poliubiquitinadas em diferentes cepas de T. cruzi.

  Para isso extratos totais de cepas de T. cruzi na forma epimastigota obtidos como descrito em Material e Métodos (item 3.14), foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) a 10%, transferidos para membranas de PVDF e incubados com anticorpos policlonal anti-ubiquitina de coelho seguido de anticorpo secundário anti-IgG de coelho conjugado com fosfatase alcalina conforme descrito em Material e Métodos.

  Os resultados apresentados na Figura 16B mostram o mesmo perfil de ubiquitinação em todas as cepas analisadas, além disso, nenhum acúmulo de bandas protéicas conjugadas a ubiquitina foi observado.

  A 148 250 PM BZS BZR CL BZS CL 17WTS 17LER COL BZR COL 17WTS 17LER B 42

  60 22

  

de proteínas) após eletroforese em gel de acrilamida a 10% foram coradas com Azul de

Comassie. PM- padrão de peso molecular (Invitrogen). Em B, as bandas protéicas foram

transferidas para membrana de nitrocelulose e a seguir incubadas com anticorpos anti-ubiquitina

de coelho e posteriormente revelados como descrito em Materiais e Métodos.

  4.5- Detecção do proteassoma 20S

  Como mencionado na introdução, o proteassoma 20S apresenta dois tipos de subunidades: subunidades α e subunidades β. Essas subunidades formam quatro anéis heptaméricos (α1-7, β1-7, β1-7, α1-7) superpostos formando o complexo proteolítico

  20S. Neste trabalho detectamos os níveis de subunidades alfa e, conseqüentemente, do

  

Resultados

  proteassoma 20S no padrão de cepas de T. cruzi estudados. Para a detecção das subunidades estruturais, utilizamos à técnica de Western Blot e amostras de proteínas totais extraídas das formas epimastigotas do T. cruzi estudadas.

  A figura 17B mostra o padrão de expressão do proteassoma 20S. Podemos observar que todas as cepas sensíveis ao benzonidazol (17WTS, BZS e CL) apresentam uma maior expressão do proteassoma 20S em relação às cepas resistentes. 250 148 PM BZS BZR CL COL 17WTS 17LER A 17WTS 17LER BZS BZR CL COL B

  60 42 22

  

sensíveis e resistentes ao benzonidazol. Em A, cerca de 10 µg de proteínas totais de cepas de

foram coradas com Azul de comassie. PM- padrão de peso molecular (Invitrogen). Em

  T. cruzi

  

B, as bandas protéicas foram transferidas para membrana de nitrocelulose e a seguir incubada

com anticorpos anti-subunidades α de ratos e, posteriormente, revelada como descrito em

Material e Métodos.

  4.6- Atividades enzimáticas do proteassoma 20S

  O proteassoma 20S apresenta três subunidades beta com funções peptidásicas: Beta-1 (atividade peptidásica semelhante à caspase), Beta-2 (atividade peptidásica semelhante à tripsina) e Beta-5 (atividade peptidásica semelhante à quimotripsina).

  Para a medida da atividade enzimática semelhante à caspase utilizamos o substrato fluorogênico: Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-7-amido-4-metilcumarina. As medidas de proteólise foram realizadas na presença e na ausência do inibidor aldeído peptídeo

  

Resultados

  CBZ-leucinil-leucinil-leucinil (MG132) que inibe parcialmente a atividade caspase- símile do proteassoma 20S.

  A atividade caspase-símile do padrão de cepas estudadas encontra-se representado no gráfico 1.

  

Atividade Caspase-símile

  6

  5

  4 s a p e

  • MG132
    • MG132

  2

  1 5000 10000 15000 20000 25000 Unidades arbitrárias de fluorescência/mg de proteínas

  

Gráfico 1- Atividade caspase-símile de uma fração enriquecida do T. cruzi no estágio

epimastigota, na presença e ausência do inibidor específico MG132 em 6 cepas de T. cruzi,

utilizando como substrato YVAD-MCA (Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-7-amido-4-metilcumarina). 1-

  17WTS, 2- 17LER, 3- BZS, 4- BZR, 5- Cl and 6- Colombiana.

  Para a medida da atividade proteolítica do Proteassoma 20S semelhante à tripsina-símile foi utilizado como controle o inibidor específico MG132 que não inibe a atividade tripsina do proteassoma e o substrato fluorogênico GGR-MCA (Cbz- Gly- Gly-Arg-7-amido-4-metilcumarina). Os resultados encontram-se representados no gráfico 2.

  A medida da atividade semelhante à quimotripsina foi realizada utilizando o substrato fluorogênico LLVY-MCA (Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-7- amido-4-metilcumarina) e o inibidor MG132 que apresenta uma inibição total sobre essa atividade. Os resultados encontram-se representados no gráfico 3.

  Resultados

10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000

  • MG132
    • MG132

  Unidades arbitrárias de fluorescência/mg de proteínas

  1

  2

  3

  4

  5

  e p a s Atividade Tripsina-símile

  

Gráfico 2- Atividade tripsina-símile de uma fração enriquecida do T. cruzi no estágio

epimastigota, na presença e ausência do inibidor específico MG132 em 6 cepas de T. cruzi,

utilizando como substrato GGR-MCA (Cbz- Gly-Gly-Arg-7-amido-4-metilcumarina). 1-

  17WTS, 2- 17LER, 3- BZS, 4- BZR, 5- Cl and 6- Colombiana.

  • MG132 -MG132

  Unidade s arbitrárias de fluore scência/mg de prote ínas

5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000

1 2 3 4 5 6 C e p a s

Atividade Quimotripsina-símile

  

Gráfico 3- Atividade quimotripsina-símile de uma fração enriquecida do T. cruzi no estágio

epimastigota, na presença e ausência do inibidor específico MG132 em 6 cepas de T. cruzi,

utilizando como substrato LLVY-MCA (Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-7- amido-4-metilcumarina).

  1- 17WTS, 2- 17LER, 3- BZS, 4- BZR, 5- Cl and 6- Colombiana.

  Discussão

5- Discussão

  

Discussão

  O conjunto de genes expressos por um dado organismo, tecido ou célula, confere especificidade funcional e determina as características que refletem o seu proteoma e conseqüentemente o fenótipo característico. Métodos para identificar, isolar e caracterizar esses genes expressos são fundamentais para o estudo sistemático e para um melhor entendimento dos processos biológicos essenciais (Schena, et al., 1995).

  Recentemente, apesar dos grandes progressos no estudo sistemático do genoma do T. cruzi, ainda permanece por ser compreendido os mecanismos moleculares envolvidos na regulação da expressão gênica estágio-específica e quais moléculas regulam as transições epimastigota-tripomastigota-amastigota observadas durante o ciclo evolutivo deste parasito.

  A comparação dos padrões de expressão gênica entre cepas sensíveis e resistentes à drogas em T. cruzi, constitui indubitavelmente numa estratégia importante para auxiliar o entendimento do processo de resistência à drogas. Paralelamente, existe a possibilidade de se encontrar marcadores moleculares de resistência, os quais poderão ser utilizados para o diagnóstico precoce desta parasitose, orientando assim uma intervenção terapêutica mais apropriada. A análise de genes relacionados à resistência, poderá também desencadear na descoberta de novas moléculas alvo para uma terapêutica mais seletiva.

  Na última década, diversos grupos independentes têm demonstrado o envolvimento da via proteolítica dependente de ubiquitina e do proteassoma em vários processos biológicos essenciais para a sobrevida de uma célula, como no ciclo celular e metabolismo, na apoptose, nos mecanismos de transdução de sinal e na resposta imune. Esta via proteolítica é capaz de catalisar a degradação irreversível de proteínas implicando em um novo sistema regulatório. A descoberta da ubiquitina e do proteassoma tem revelado um novo conceito, uma vez que os dados experimentais sugerem que a degradação de uma proteína no tempo/espaço específica parece ser tão importante quanto a sua biossíntese (HERSHKO, A., 1996; HOCHSTRASSER, M.; 1996; JENTSCH & SCHLENKER; 1995; CIECHANOVER, A., 1994; TANAKA, K; 1998a, TANAKA, K; 1998b).

  Algumas modificações que ocorrem durante o ciclo de vida deste parasito podem estar condicionadas à presença dos proteassomas, uma vez que, uma característica marcante, é o profundo remodelamento morfológico e molecular que os

  

Discussão

  parasitos sofrem durante o seu desenvolvimento tanto no hospedeiro vertebrado como no invertebrado.

  Um bom exemplo desta função do proteassoma foi demonstrada por Gonzáles et al,. (1996) analisando a necessidade deste complexo enzimático na transformação de tripomastigotas em amastigotas. Resultados similares da importância dos proteassomas no remodelamento morfológico de parasitos também foram descritos em T. brucei, (MUTOMBA et al., 1997), Plamodium sp (GANTT et al., 1998) Leishmania (ROBERTSON 1999), Toxoplama gondii (SHAW et al., 2000), Entamoeba invadens e Entamoeba histolytica (Makioka et al., 2002).

  Devido ao envolvimento do proteassoma em processos bioquímicos fundamentais e a disponibilidade do genoma do T. cruzi (El-Sayde et al., 2005), entendemos que caracterização em nível molecular e bioquímico de genes envolvidos nesta importante via de proteólise intracelular certamente irá colaborar no entendimento da biologia celular deste parasito.

  As drogas benzonidazol e nifurtimox utilizadas no tratamento etiológico da doença de Chagas são insatisfatórias devido a muitas razões, tais como: vários efeitos colaterais, baixa eficiência de cura durante a fase crônica da doença, resistência de cepas de T. cruzi naturalmente resistentes a esses quimioterápicos e a resistência cruzada entre ambas as drogas (Filardi e Brener, 1987; Urbina e Docampo, 2003). Infelizmente, os mecanismos de resistência a drogas usados por estes parasitos é um campo ainda pouco entendido.

  O T. cruzi apresenta três estágios evolutivos: tripomastigota (infectiva), epimastigota (replicativa) e amastigota (replicativa). A hipótese de trabalho do nosso grupo é que o proteassoma pode participar dos processos de resistência a quimioterápicos de formas replicativas de T. cruzi, uma vez que em células tumorais (em constante replicação) existem vários relatos sobre a participação dessa protease na resistência a drogas. Células em constante replicação apresentam uma grande quantidade de componentes da via proteassoma-ubiquitina, e geralmente uma baixa resposta aos tratamentos convencionais. O uso de inibidores dessa via diminui a capacidade proliferativa das células e conseqüentemente induz a apoptose, além disso, melhora a resposta aos tratamentos quimioterápicos (Vlahakis & Badley, 2006)

  

Discussão

  Vários trabalhos demonstram que inibidores do proteassoma aumentam a sensibilidade de células tumorais a um grande número de drogas terapêuticas convencionais. Isso ocorre devido a uma regulação negativa em vias inatas, induzíveis e de resistência adquirida. Como exemplo podemos citar a via NF-kB, na qual inibidores do proteassoma bloqueiam a proliferação celular, intensificando a apoptose de células cancerígenas por meio de outros agentes (Wang C.Y. et al., 1996). Além disso, inibidores do proteassoma podem sensibilizar células tumorais a agentes danosos de DNA por meio da inibição da transcrição de genes envolvidos nas vias de reparo do DNA (Mistsiades N. et al., 2003 e Mimnaugh E.G. et al., 2000).

  A amplificação e super-expressão da glicoproteína-P (P-gP) tem sido sugerida como um possível mecanismo de resistência a drogas em alguns parasistos protozoários (Ullman, 1995). A P-gp é uma proteína transportadora localizada na superfície das células. Essa proteína funciona como uma bomba de efluxo de toxinas intracelulares. A grande expressão de P-gp na superfície de células cancerígenas tem um importante papel na quimioresistência a agentes anticarcinogênicos (Ambudkar SV, et al., 2003). A inibição do proteassoma leva a um acúmulo de P-gp imaturo que é incapaz de transportar drogas para fora das células de maneira eficaz (Loo T.W. et al., 1999). Além disso, o gene para P-gP, MDR1, tem mostrado ser um alvo do fator de transcrição, NF-kB (Bentires-Alj M. et al., 2003). Assim, embora não tenham sido testados diretamente, os inibidores do proteassoma podem afetar a quimioresistência pela interferência na transcrição e maturação pós-traducional da P-gp. É bom ressaltar, que estudos realizados por Murta et al. (2001) mostraram que o fenótipo de resistência a drogas de T. cruzi não está associado com a amplificação ou superexpressão dos genes P-gP.

  No presente trabalho, nós investigamos a localização cromossômica, o número de cópias e o nível de transcrição dos genes β1, -2 e -5 do proteassoma 20S. Além disso, nós analisamos tanto os níveis como a atividade proteolítica dessas subunidades catalíticas e o perfil de proteínas poliubiquitinadas em um padrão de cepas sensíveis e resistentes ao benzonidazol. Esse padrão inclui as cepas 17 que apresentam sensibilidade e resistência ao benzonidazol induzida “in vitro”(Nirdé P. et al., 1995), as cepas BZ que apresentam sensibilidade e resistência ao BZ selecionada “in vivo”

  

Discussão

  (Murta e Romanha, 1998) e finalmente, cepas naturalmente sensíveis e resistentes a essa droga (CL e Colombiana, respectivamente) (Stothard, et al., 1999).

  Nossos resultados mostram que os genes β1,-2 e -5 estão presentes em várias bandas cromossômicas (Figuras 7, 8 e 9). Inicialmente, acreditávamos que o reconhecimento de múltiplos cromossomos pelas sondas gene específicas estaria relacionado com a baixa estringência da reação de hibridização. Novos experimentos foram realizados utilizando 60° e 68°C como temperatura de hibridização. Nestas condições obtivemos um mesmo padrão de marcação cromossômica (resultados não mostrados). Além disso, também testamos sondas não radioativas, e obtivemos um mesmo padrão de hibridização (resultados não mostrados). Esses dados são importantes porque abrem perspectivas da utilização de sondas marcadas com fosfatase alcalina em experimentos de hibridização, dado as complicações do uso de radioisótopos.

  A hibridização dos cromossomas com a sonda do gene Beta-1 (figura 7B), mostrou que este gene esta localizado em bandas cromossomais entre 1640 e 1100 Kb, uma vez que observamos uma forte intensidade de hibridizacao da sonda nesta região.

  Também foi observado uma múltipla marcação cromossômica quando utilizamos sondas para o gene β2 (figura 8B). A faixa de tamanho dessas bandas cromossômicas foi de 610 a 1900 Kb. Essa múltipla marcação pode ser explicada pelas 3 entradas listadas no banco de dados do T. cruzi para esse gene. Duas dessas, são idênticas (Tc00.1047053510287.30 e Tc00.1047053503891.100), entretanto, a terceira (Tc00.1047053508461.430) apresenta uma similaridade de 25% com o gene β7 (Tc00.1047053510689.30). Esse valor de similaridade é suficiente para proporcionar uma reação cruzada entre os genes β2 e β7, o que pode justificar a múltipla marcação de bandas cromossômicas detectadas, mesmo quando a temperatura de hibridização foi de 65°C. Futuros experimentos utilizando uma sonda mais específica para o gene β2 são necessários para confirmar a localização desse gene.

  O resultado apresentado na figura 9 indica que o gene β5 está localizado em no mínimo 2 bandas cromossômica com tamanhos de 1100 e 1640 Kb. Apesar de não ser conclusiva a localização desses genes, vale a pena ressaltar que a hibridização dos cromossomas com as sondas dos genes Beta-1, -2 e -5 mostrou heterogeneidade de tamanho e número dos cromossomas entre as diferentes populações do T. cruzi que contém estes genes. Entretanto, os vários perfis de hibridização gerados com as sondas

  

Discussão

  específicas destes genes, não estão associados com o fenótipo de resistência do T. cruzi a drogas.

  Essa distribuição dos genes do proteassoma em múltiplos cromossomos é semelhante ao observado para os genes de rRNA e mini-exon (Zingales B. et al., 2003). Recentemente, Atwood et al., (2005) mostraram que proteínas do complexo proteassoma-ubiquitina representam a segunda maior classe de proteínas funcionais em

  

T. cruzi , portanto, a distribuição de genes de proteassoma em múltiplos cromossomos

  pode estar relacionada a eventos de duplicação gênica, contribuindo para um aumento real na taxa de transcrição e, conseqüentemente, uma maior tradução de subunidades desse complexo. Nossos resultados são os primeiros dados de localização cromossômica de genes que codificam as subunidades catalíticas do proteassoma 20S em T. cruzi.

  As análises de Southern blot indicam no mínimo duas cópias dos genes β1,-2 e -5 por genoma haplóide das cepas sensíveis e resistentes ao benzonidazol (Figura 10, 11 e 12). Normalmente, os genes do proteassoma são de cópia única em protozoários. No T. cruzi o gene que codifica a subunidade α6 da cepa CL Brener apresenta uma única cópia por genoma (Bartholomeu D. C et al., 2001). Em T. brucei o gene que codifica a proteína ativadora do proteassoma com peso molecular de 26 kDa (PA26) mostrou uma única cópia por genoma haplóide (Yi Yao et al., 1999). Em Giardia

  

lamblia as análise de Southern blot indicam que o gene que codifica a subunidade α3 do

proteassoma 20S apresenta apenas uma única cópia (Emmerlich V. et al, 2001). No P.

  o gene que codifica a subunidade 4 ATPase do proteassoma também

  falciparum apresentou uma única cópia por genoma haplóide (Certad G. et al., 1999).

  O fato de detectarmos no mínimo duas cópias dos genes que codificam as subunidades catalíticas do proteassoma, sugere eventos de duplicação gênica na família dos genes beta. Em eucariotas superiores, eventos de duplicação gênica resultaram na formação de subunidades beta catalíticas induzíveis por citocinas, que estão presentes nos imunoproteassomas (Wei et al., 2006). Vale a pena ressaltar que os imunoproteassomas são os responsáveis pela formação dos peptídeos que irão ser apresentados ao complexo maior de histocompatibilidade de classe I (MHC-I) (KesMil et al., 2003). A observação de cópias extras desses genes sugere a presença de subunidades induzíveis em T. cruzi. Além disso, a ORF predita à partir da entrada

  • 75

  Tc00.1047053508461.430 mostra 10 de similaridade com beta-2 induzível de

  

Discussão

  e Drosophila melanogaster (Beinke S. et al., 2004, Groettrup M.

  Caenorhabtes elegans

  et al., 2001, Hasselgren P.O. 1999 e Price S. R. et al., 1996). Experimentos adicionais serão necessários para comprovar essa hipótese.

  Análises de Northern blot mostraram a presença de um transcrito principal de 1,09 Kb para o gene β1, 1.15 Kb para o gene β2 e 1,17 Kb para o β5 usando sondas específicas para cada gene (Figura 13, 14 e 15, respectivamente). O tamanho destes transcritos esta de acordo com o tamanho esperado, e estão presentes em todas as cepas do T. cruzi analizadas. Além disso, observamos a presença de outros transcritos para estes genes, entretanto com baixa intensidade de hibridização. A existência de mais de um transcrito para os genes estudados pode ser devido a diferentes níveis de maturação do mRNA.

  Usualmente, a transcrição em eucariontes é monocistrônica. O fato de termos detectados transcritos com o dobro de tamanho em comparação ao transcrito principal sugere a possibilidade de transcritos policistrônicos para essas subunidades ou que o transcrito primário será extensivamente processado para gerar o mRNA maduro (Nilsen, 1992; El-Sayed et al., 2005). Durante este processo, uma seqüência nucleotídica líder de 39 nucleotídeos, conhecida como “splice líder” (SL) ou miniexon, é transferida para a extremidade 5’ de cada mRNA individual. Pelo fato de envolver dois “exons” presentes em duas moléculas de RNAs diferentes, esta reação foi denominada “trans-splicing” e descoberta a partir da observação de que todo mRNA nuclear nos tripanossomas começa com a seqüência SL (Perry et al., 1991).

  A determinação do perfil de ubiquitinação no padrão de cepas estudadas, também foi objetivo de nosso trabalho. A ubiquitina é encontrada em todas as células eucarióticas na sua forma livre ou covalentemente ligada a proteínas celulares. Esta proteína apresenta diversas funções, sendo uma delas a marcação seletiva de proteínas que serão, posteriormente, degradadas pelo proteassoma 26S (Hersko et al., 1998).

  O método mais utilizado para a detecção de conjugados ubiquitinados é por Western blotting utilizando anticorpo mono ou policlonal contra a ubiquitina livre ou contra um conjugado proteína-ubiquitina específico (Mimaugh et al., 1999). Neste trabalho, foram utilizados anticorpos policlonais anti-ubiquitina. Como mostra a Figura 16, todas as cepas do T. cruzi avaliadas apresentaram um mesmo padrão de ubiquitinação, não sendo detectado nenhum acúmulo de conjugados poliubiquitinados.

  

Discussão

  Considerando que estes são os substratos naturais para o proteassoma 26S (Tanaka, 1998), sugerimos a existência de uma fina regulação entre o processo de poliubiquitinação e proteólise mediada pelo proteassoma 26S. Há um consenso que para a remoção específica de uma proteína em um tempo definido, tanto a etapa de conjugação como o de degradação, parecem ser altamente reguladas (Zhang et al., 1998; Ciechanover e Schwartz, 1998). Para confirmar os resultados obtidos até o momento, será necessário a realização de géis 2D seguidos de imunoblotting, usando anticorpos anti-ubiquitina.

  O próximo objetivo foi verificar se haveria relação entre níveis de proteassoma e o fenótipo de resistência e susceptibilidade a drogas. Considerando que o processo de biogênese do proteassoma requer quantidades equivalentes de todas as suas subunidades constituintes, o uso de anticorpos anti-subunidade α reflete o conjunto de proteassomas funcionais presentes na célula. Podemos observar na figura 17 uma maior quantidade de proteassoma nas cepas sensíveis em relação às resistentes.

  Uma das qualidades que distingue o proteassoma das demais enzimas proteolíticas é a sua múltipla atividade peptidásica, localizada em sítios catalíticos independentes (protease compartimentalizada). Isso parece ser muito vantajoso para a célula, uma vez que favorece a degradação rápida e seletiva de vários tipos de proteínas celulares. Para caracterizar estas atividades nos proteassomas, a estratégia utilizada é a medida da proteólise sobre substratos fluorogênicos específicos para a identificação de sítios catalíticos semelhantes à caspase, tripsina e quimiotripsina (Tanaka, 1998).

  Nossos resultados (Gráficos 1, 2 e 3) mostram uma atividade peptidásica principal semelhante a tripsina em todas as cepas estudadas, corroborando com os dados da literatura (revisado por Paugam A. et al., 2003). Entretanto, as cepas sensíveis e resistentes “in vitro” (17WTS e 17LER) apresentaram uma atividade quimiotripsina- símile na mesma ordem de magnitude da atividade tripsina-símile (Gráfico 2 e 3). As cepas com sensibilidade e resistência ao benzonidazol induzida “in vitro” apresentaram atividades peptidásicas semelhantes à: caspase, tripsina e quimotripsina dez vezes maiores que as encontradas nas cepas com sensibilidade e resistência selecionada “in vivo”.

  O perfil de atividades proteolíticas dos tripanosomatídeos difere do proteassoma 20S de outros eucariotos (Hua S. et al., 1996). É conhecido, que a

  

Discussão

  atividade principal do proteassoma 20S de eucariotas superiores é semelhante à quimotripsina, enquanto que em tripanosomatídeos a atividade tripsina-símile é a principal. O fato de termos encontrado uma alta atividade semelhante à quimotripsina nas cepas 17, independente do fenótipo de resistência sugere uma característica intrínseca desta cepa, que será futuramente estudada pelo nosso grupo de pesquisa.

  A análise de Western Blot (Figura 17) e atividade peptidásica (Gráfico 1, 2 e 3) não apresentaram correlações entre o nível e atividade do proteassoma 20S, sugerindo que possíveis modificações pós-traducionais, principalmente fosforilação e glicosilação no proteassoma estariam induzindo uma regulação das suas propriedades cinéticas.

  Diversos grupos independentes têm mostrado que muitas subunidades do proteassoma apresentam sítios potenciais de fosforilações (Bose S. et al., 1999; Fernandez Murray P. et. al., 2002; Iwafune Y. et al., 2002; Ludemann R., et al., 1993; Pereira M.E. et al., 1990). Até o momento foi identificado que as subunidades α2, α3, α 4, α5, α6, α7 e β6 são fosforiladas. Esse perfil de fosforilação foi demonstrado desde o proteassoma de leveduras até tecidos de mamíferos (Umeda M. et al., 1997; Wehren A. et al., 1996; Fernadez Murray P. et al., 2002; Iwafune Y. et al., 2002).

  Zong C. e colaboradores (2006) caracterizaram o perfil de fosforilação de subunidades individuais do proteassoma 20S em músculo cardíaco de camundongo. Um perfil de fosforilação foi determinado por eletroforese em gel bidimensional e análises de immunoblotting com anticorpos específicos. Esse grupo mostrou que a fosforilação das subunidades β1, -2 e -5 modulam positivamente a atividade proteolítica do proteassoma 20S. Considerando os resultados obtidos neste trabalho, onde não detectamos um aumento da atividade enzimática relacionada ao aumento dos níveis do proteassoma 20S, não podemos descartar a hipótese de que níveis diferentes de fosforilação destas subunidades resultaram em uma cinética enzimática diferenciada entre o padrão de cepas do T. cruzi estudadas.

  É importante ressaltar que a fosforilação do proteassoma com a proteína quinase A (PKA) aumenta a atividade proteolítica do proteassoma 20S obtidos de músculo cardíaco de camundongo. Além disso, essa fosforilação inibe a associação do proteassoma 20S com a proteína fosfatase 2A (PP2A), aumentando ainda mais a atividade proteolítica deste complexo enzimático (Zong C.et al., 2006).

  

Discussão

  A hslV e hslU (heat shock protein), também conhecidas como ClpQ e Clpy, respectivamente, são expressas em muitas bactérias em resposta ao estresse. A hslV é uma protease e hslU uma ATPase. Esses dois complexos formam uma estrutura semelhante a um barril, que degrada proteínas de meia vida curta ou desnaturadas. O mecanismo de degradação é essencialmente o mesmo observado para os proteassomas de eucariotos, ou seja, catalisado por um resíduo de treonina ativo no sítio catalítico, cuja atividade é bloqueada por inibidores clássicos do proteassoma (Bogyo et al., 1997 e Souza et al., 2002). Até o momento Plasmodium e tripanosomatídeos são os únicos eucariontes que contém cópias de hslV em seu genoma (Gille C, et al., 2003; Couvreur

  B, et al., 2002). No genoma do T. cruzi, encontram-se anotadas duas entradas para hslV (Tc00.1047053510719.260 e Tc00.1047053506275.20), sugerindo que essa protease possa regular processos biológicos do parasito.

  Mordmüller et al. (2006) demonstraram que enquanto o proteassoma é expresso constitutivamente em P. falciparum a protease hslV apresenta uma expressão estágio específica, com um pico de concentração na forma merozoíta. Apesar desse grupo não mostrar que essa protease hidrolisa substratos comuns ao proteassoma, como os utilizados neste trabalho, nós não podemos descartar a possibilidade desta protease estar presente nas frações enriquecidas, destinadas à medida da atividade catalítica do proteassoma 20S obtido da forma epimastigota do T. cruzi(Gráficos 1, 2 e 3).

  Quando comparamos cepas sensíveis e resistentes ao benzonidazol, não observamos diferenças nas atividades peptidásicas do proteassoma, porém, detectamos diferenças nos níveis dessa protease. Esses resultados em conjunto sugerem que para a compreensão do papel do proteassoma para o fenótipo de resistência ao benzonidazol, é necessário avaliar a atividade proteolítica endógena dessa protease no padrão de cepas estudado. Além disso, entendemos que tanto a determinação dos níveis como das atividades do proteassoma, obtido das formas tripomastigota e amastigota são essenciais para avaliar o papel dos proteassomas no fenótipo de resistência ao benzonidazol. Esses experimentos serão futuramente realizados.

  Essas diferenças nas atividades peptidásicas e a participação do proteassoma no remodelamento morfológico do parasito estão sendo analisadas pelo nosso Laboratório, como uma estratégia para um melhor entendimento do papel desse

  

Discussão

  complexo proteolítico nos mecanismos de resistência e susceptibilidade às drogas em T.

  cruzi (Hangai, N.S., projeto de mestrado 2007).

  Conclusão

6- Conclusões

  

Conclusão

  Os principais resultados deste trabalho foram:

  • Os genes Beta-1, -2 e -5 apresentam uma múltipla marcação cromossomal no padrão de cepas com diferentes zimodemas e fenótipos de resistência e susceptibilidade ao benzonidazol;
  • Esses genes apresentam no mínimo duas cópias por genoma haplóide no padrão de cepas com fenótipo de resistência e susceptibilidade a drogas;
  • Um transcrito principal com 1090, 1150 e 1170pb foi observado para os genes beta-1, -2 e -5, respectivamente, nas cepas estudadas. Não foi observada a variação nos níveis desses mRNAs quando comparamos cepas com resistência “in vitro”, “in vivo” e naturalmente sensíveis e resistentes ao benzonidazol;
  • Não foi observado acúmulo de conjugados poliubiquitinados, mostrando uma fina regulação entre a poliubiquitinação e degradação de proteínas intracelulares no padrão de cepas de T. cruzi estudadas;
  • Foi detectada uma maior quantidade do proteassoma 20S nas cepas sensíveis em relação às cepas resistentes ao benzonidazol;
  • A atividade peptidásica principal do proteassoma das cepas estudadas foi semelhante à tripsina, entretanto, as cepas 17 também apresentaram uma alta atividade peptidásica semelhante a quimotripsina;
  • As cepas com sensibilidade e resistência ao benzonidazol induzida “in vitro” apresentaram atividades peptidásicas semelhante a caspase, tripsina e quimotripsina 10 vezes maiores quando comparada as cepas com sensibilidade e resistência selecionada “in vivo”.

  Apesar de não termos resultados mostrando a influência da fosforilação e glicosilação do proteassoma 20S sobre a cinética enzimática, os resultados obtidos até o momento, sugerem que estas modificações pós-traducionais modulam diferencialmente a atividade peptidásica do proteassoma 20S obtidos da forma epimastigota em um padrão de cepas do T. cruzi sensível e resistente ao benzonidazol.

  Perspectivas

7- Perspectivas Diante dos resultados já obtidos, abrem-se as seguintes perspectivas:

  cruzi estudadas.

  Perspectivas

  • Experimentos utilizando uma sonda mais específica para o gene β2 para confirmar a localização desse gene;
  • Realização de géis 2D seguido de imunoblotting para confirmar a ausência de acúmulo de conjugados poliubiquitinados no padrão de cepas estudado;
  • Determinação dos níveis do proteassoma 20S a partir das formas tripomastigota e amastigota, bem como da atividade proteolítica e peptidásica;
  • Determinação de modificações pós-traducionais e do efeito da fosforilação e glicosilação de subunidades do proteassoma sobre a cinética enzimática; • Caracterização do complexo proteolítico hsIV no padrão de cepas do T.

  Referências Bibliográficas

8- Referências Bibliográficas

  

Referências Bibliográficas

  Ambudkar S.V., Kimchi Sarfaty C., Sauna Z.E., Gottesman M.M. (2003) P-gP: from genomics to mechanism. Oncogene. 22(47):7468-85. Review. Aymerich, S. and Goldenberg, S. (1989) The karyotype of T. cruzi Dm28c: Comparison with other T. cruzi strains and trypanosomatids. Exp. Parasitol. 69: 107-115. Baumeister, W., Walz, J. Zühl, F. ande SEEMÜLER (1998). The proteasome: Paradigm of a self-compartmentalizing protease. Cell 92: 367-380. Bentires-Alj M., Barbu V., Fillet M., Chariot A., (2003). NF-kappaB transcription factor induces drug resistance through MDR1 expression in cancer cells. Oncogene.

  22(1):90-7. Berger A.J, Fairlamb A.H. (1992). Interactions between immunity and chemotherapy in the treatment of the trypanosomiases and leishmaniases.Parasitology. 105 Suppl:S71-

  8. Review. Bogyo M, McMaster JS, Gaczynska M, Tortorella D, Goldberg AL, Ploegh H. (2004).

  Covalent modification of the active site threonine of proteasomal beta subunits and the Escherichia coli homolog HslV by a new class of inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. (13):6629-34. Bosen S. Mason G.G. Rivett A. J. (1999). Phosphorylation of proteasomes in mammalian cells. Mol Biol Rep. 26(1-2):11-4. Review. Briones M. R., Souto P.R., Stolf S., Zingales B. (1999). The evolution of two T. cruzi subgroups inferred from rRNA genes can be correlated with the interchange of

  American mammalian faunas in the Cenozoic and has implications to pathogenicity and host specificity. Mol. Biochem. Parasitol. 104(2):219-32. Brisse S. et al. (1998) A phylogenetic analysis of the Trypanosoma cruzi genome project CL Brener reference strain by multilocus enzyme electrophoresis and multiprimer random amplified polymorphic DNA fingerprinting. Mol Biochem Parasitol. 92(2):253-63. Brisse S. et al. (2003). Evidence for genetic exchange and hybridization in Trypanosoma cruzi based on nucleotide sequences and molecular karyotype.

  Infect Genet Evol. 2(3):173-83. Brisse S., Barnabé C., Tibayrenc M. (2000). Identification of six T. cruzi phylogenetic lineages by random amplified polymorphic DNA and multilocus enzyme electrophoresis. Int. J. Parasitol. 1: 35-44

  

Referências Bibliográficas

  Buckner F, Wilson A, Whitr T, Van Voorhis W. Induction of resistance to azole drugs in Trypanosoma cruzi (1998). Antimicrob Agents Chemoter; 42:3245-50. Cabral HR, Glocker TM, Novals IT, krainbuhl VA (1999). The esophagus in patients with Chagas disease in Cordoba. Histologicoimmunohistochemical, and evacuation time. Rev Fac Cienc Med Uni Nac Cordoba. 56: 27-33. Cano, M.I., Grueber, A., Vasques, M. et al. (1995) Molecular karyotype of CL Brener chosen for the T. cruzi genome project. Mol. Biochem. Parasitol. 71: 273-278. Certad G., Abrahem A, Georges E. (199). Cloning and partial characterization of the proteasome S4 ATPase from Plasmodium falciparum. Exp. Parasitol. 93(3):123-31. Certad, G. et. al., (1999). Cloning and partial characterization of the proteasome S4 ATPase from Plasmodium falciparum. Exp. Parasitol. 93: 123-131. Chen P., Hochstrasser M. (1996). Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86(6):961-72. Ciechanover, A. (1994). The ubiquitin-proteasome pathway. Cell 79: 13-21. Ciechanover A., and Schwartz A.L. (1998). The ubiquitin-proteasome pathway: the complexity and myriad functions of proteins death. Proc Natl Acad Sci U S A.

  95(6):2727-30. Clark C. G (1994). O. J. Pung. Mol. Biochem. Parasitol. 66, 175. Couvreur B., Wattiez R., Bollen A., Falmagne P., Le Ray D., Dujardin J. C. (2002).

  Eubacterial HslV and HslU subunits homologs in primordial eukaryotes. Mol Biol Evol. 19(12):2110-7. Coux, O., Tanaka, K. and Goudberg, A.L. Structure and functions of 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem. 65: 801-847, 1996. De Diego, J. et al. (2001). The ubiquitin-proteasome pathway plays na essential role in proteolysis during Trypanosoma cruzi remodeling. Biochemisty. 40:1053-1062. El-Sayed N.M. et al., (2005). Comparative genomics of trypanosomatid parasitic protozoa. Science. 309(5733): 404-9. Emmerlich V., Scholze H., Gillin F.D., Bakker-Grunwald T. (2001). Characterization of a proteasome alpha-chain from Giardia lamblia.Parasitol Res. 87(2):112-5. Engel J, Garcia C, Hsieh I, Doyle P, Mckerrow J (2000). Upregulation of the secretory pathway in cisteine protease inhibitor-resistant Trypanosoma cruzi. J Cell Sci;

  113:1345-54.

  

Referências Bibliográficas

  Fenandez Murray P., Pardo P.S., Zelada A.M., Passeron S. (2002). In vivo and in vitro phosphorylation of Candida albicans 20S proteasome. Arch Biochem Biophys.

  404(1):116-25. Filardi, L.S. and Brenner, Z. (1987). Susceptibility and natural resistance of T. cruzi strains to drugs used clinically in Chagas’ disease. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 81:

  755-759. Finley, D. (1991). Ubiquitinação. Annu. Rev. Cell. Biol. 7: 25-69. Gantt, S. M., Myung, M.M., briones, M.R.S., Wei Dong Li, Corey, E. J., Omura, S.,

  Nussenzweig, V. and Sinnis, P. (1998). Proteasome Inhibitors block developmental of Plasmodium spp. Antimicrobial Agents and Chemoterapy. 42: 2731-2738. Gaunt M.W. et al., (2003). Mechanism of genetic exchange in American trypanosomes.

  Nature. 421(6926):936-9. Gille C., Goede A., Schloetelburg C, Preissner R., Kloetzel P.M., Gobel U. B., Frommel

  C. (2003). A comprehensive view on proteasomal sequences: implications for the evolution of the proteasome.J Mol Biol. 326(5):1437-48. Gonzáles J., Ramalho-Pinto F.J., Frevert U., Ghiso J., Tomlinson S., Scharfstein J.,

  Corey, E.J. and Nussenzweig, V. (1996). Proteasome Activity is required for stage- specific transformation of a protozoan parasite. J. Exp. Med. 184: 1909-1918. Guimond, C., Trudel, N., Brochu, C., Marquis, N., Fadili, A.E., Peytavi, R., Briand, G.,

  Richard, D., Messier, N., Papadopoulou, B., Cordeil, J., Bergeron, M., Legaré, D., Ouellette, M., 2003. Modulation of gene expression in Leishmania drug resistant mutants as determined by targeted DNA microarray. Nucleic Acids Research. 31: 5886-5896. Hendil, K.B.; Kristensen, P. and Uerkvitz, W (1995). Human proteasomes analysed with monoclonal antibodies. J. Biochem. 305 (1): 245-252.

  Henrikson, J., Pettersson, U. and Solari, A. (1993). T. cruzi: correlation between Karyotype variability and isoenzyme classification. Wxp. Parasitol. 77: 334-348. Henriksson, J., Aslund, L., Macina, R.A. et al. (1990). Chromosomal localization of seven cloned antigen genes provides evidence of diploidy and further demonstration of karyotype variability in T. cruzi. Mol. Biochem. Parasitol. 42, 213-224.

  

Referências Bibliográficas

  Henriksson, J., Porcel, B., Rydaker, M. et al. (1995). Chromosome specific markers reveal conservd linkage groups in spite of extensive chromosomal size variation in T.

  cruzi . Mol. Biochem. Parasitol. 73: 63-74.

  Hershko, A. The ubiquitin pathway for protein degradation. (1996). Trends Biochem.

  Sci. 21: 445-449. Hilt W., Wolf D. H. (1995) Proteasomes of the yeast S. cerevisae: genes, structure and functions. Mol. Biol. Rep. 21: 3-10.

  Hochstrasser, M. Ubiquitin- dependent protein degradation. (1996). Annu. Rev. Genet.

  30, 405-439.

  Hua S., To W.Y, Nguyen TT, Wong M.L., Wang C.C. (1996). Purification and characterization of proteasomes from Trypanosoma brucei. Mol Biochem Parasitol.

  78(1-2):33-46. Jentsh, S and Schlenker, S. (1995). Seletive protein degradation: a journey’s end within the proteasome. Cell, 82(6): 881-884.

  Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of Bacteriophage. Nature. 227: 680-685. Lomo PO, Coetzer TH, Lonsdale–Eccles JD (1997). Characterization of a multicatalytic proteinase complex (20S proteasome) from Trypanosome brucei brucei.

  Immunopharmacology, 36 (2-3): 285-93. Loo T. W. and Clarke D. M. (1999). The human multidrug resistance P-glycoprotein is inactive when its maturation is inhibited: potential for a role in cancer chemotherapy.

  FASEB J. 13(13):1724-32. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. (1951). Protein measurement with the folin phenol reagent. J Biol Chem; 193:265-75.

  Ludemann R., Lerea K.M., Etlinger J.D. (1993). Copurification of casein kinase II with 20 S proteasomes and phosphorylation of a 30-kDa proteasome subunit.J. Biol. Chem.

  268(23):17413-7. Machado C. A. and Ayala F. J. (2001). Nucleotide sequences provide evidence of genetic exchange among distantly related lineages of Trypanosoma cruzi.

  Proc Natl Acad Sci U S A.98(13):7396-401.

  

Referências Bibliográficas

  Makioca, A. et al., 2002. Effect of proteasome inhibitors on the growth, encistation, and excystation of Entamoeba histolytica and Entamoeba invadens. Parasitol. Res. 88: 454-459. Mcdaniel J.P and Dvorak J. A. (1993). Identification, isolation, and characterization of naturally-occurring T. cruzi variants. Mol. Biochem. Parasitol. 57(2):213-22. Mimmaugh E. g., Bonvini, P. and Neckers, L. (1999). The measurement of ubiquitina and ubiquitinated proteins. Electrophoresis. 20: 418-428. Mimmaugh E.G., Yummbam M.K., Li Q., Bonvini P, Hwang S.G., et al. (2000)

  Prevenation of cisplatin-DNA adduct repair and potentiation of cisplatin-induced apoptosis in ovarian carcinoma cells by proteasome inhibitors. Biochem. Pharmacol. 60: 1343-54. Mistsiades N, Mistsiades C. S. , Richardson P.G., Poulaki V., Tai Y-T, et al. (2003).

  The proteasome inhibitor PS341 potentiaates sensitivity of multiple myeloma cells to conventional chemotherapeutic agents: therapeutic applications. Blood 101: 2377-80. Mordmÿller B., Fendel R., Kreidenweiss A. Gille C, Hurwitz R., Metzger W. C., Kun

  J.F., Lamkemyer T., Nordhein A., Kremsner P.G. (2006). Plasmodia express two threonine-peptidase complexes during asexual development. Mol Biochem Parasitol. 148(1):79-85. Epub 2006 Mar 29. Murta S.M, dos Santos W. G., Anacleto C., Nirde P., Moreira E. S., Romanha A. J.

  (2001). Drug resistance in T. cruzi is not associated with amplification or overexpression of P-glycoprotein (PGP) genes. Mol Biochem Parasitol. 117(2):223-8. Murta SMF, Gazzineli RT, Brener Z, Romanha AJ (1998). Molecular characterization of susceptible and naturally resistent strains of Trypanosoma cruzi to benzonidazol and nifurtimox. Mol Biol Parasitol. 93:203-214. Murta SMF, Romanha A.J., (1998). In vivo selection of a population of Trypanosoma cruzi and clones resistant to benzonidazole. Parasitology; 116:165-71. Mutomba MC, To WY, Hyun WC, Wang CC. Inhibition of proteasome activity blocks cell cycle progression at specific phase boundaries in African trypanosomes.

  (1997)Mol. Biochem. Parasitol. 90(2):491-504. Neal R, Van Bueren J. Comparative studies fo drug susceptibility of five strains of in vitro and in vivo (1988). Trans R Soc Trop Med Hyg; 82:709-

  Trypanosoma cruzi 14.

  

Referências Bibliográficas

  Neal, R. A., Van Bueren, J., 1988. Comparative studies of drug susceptibility of five strains of Trypanosoma cruzi “in vitro” and “in vivo”. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg.

  82: 709-714. Nilsen T. W. (1992). Trans-splicing in protozoa and helmints. Infect. Agents Dis. 7: 212-218.

  Nirdé P, Larroque C, Barnabé C (1995). Drug-resistant epimastigota of Trypanosoma

  

cruzi and persitence of this phenotype after differentiation into amastigotes. C R

Acad Sci Paris.

  Nkengu-Njinkeng, J. (2002). Antitrypanosomal activities of proteasome inhibitors.

  Antimicrob. Agents Chemoter. 46: 2038-2040. Nozaki T, Engel J, Dvorak J (1996). Cellular and molecular biological analyses of nifurtimox resistance in Trypanosoma cruzi. Am J Med Hyg; 55(1):111-7.

  Paugam A. et. al., (2003). Characterization and role of protozoan parasite proteasomes.Rev. Parasitology. Pereira M.E., and Wilk S. (1990) Phosphorylation of the multicatalytic proteinase complex from bovine pituitaries by a copurifying cAMP-dependent protein kinase.

  Arch Biochem Biophys. 283(1):68-74. Perry K., Agabian N. (1991). mRNA processing in the Trypanosomatidae.Experientia.

  47(2):118-28. Review. Porceile P.E., Santos M.R.M, Souza R.T., Verbisck N.V., Brandão A., Urmenyi T.,

  Silva R., Rondinelli E., Lorenzi H., Levin M.J., Degrave W., Silveira J.F. (2003). A refined molecular karyotype for the reference strain of the T. cruzi genome project by assignment of chromosome markers. Gene. 308: 53-65. Rassi, A and Lunquetti, A. O (1992). Therapy of Chagas Disease. In Chagas disease (American Trypanosomiasis): its Impact on transfusion and clinical medicine (ed.

  Wendel,S., Brenner, Z., Camargo, M. E., Rassi, A.) 237-247. Ribeiro-Rodrigues, R., Dos Santos, W., Oliveira, A. B., Snieckus, V., Zani, C e

  Romanha, A. J. (1995) Grouth inhibitory effect of nafthofuran and nafthofuranquinone derivatives on Trypanosoma cruzi epimastigotes. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 5: 1509-1512. Robertson, C. D. (1999). The leishmania mexicana proteasome. Mol. Biochem.

  Parasitol. 103: 49-60

  

Referências Bibliográficas

  Robertson, C.D (1999). The Leishmania mexicana proteasome. Mol. Biochem.

  Parasitol., 103: 49-60. Sambrook, J; Maniatis, T.; Fritsch, E.F. Molecular cloning: a laboratory manual. 2

  nd ed.

  Cold Harbor laboratory Press, 1989. Scott, V. R. e Matthews, T.R. (1987). The efficacy of an n-substituted imidazole, RS-

  49676, against a T. cruzi infection in mice. American Journal of Tropcial Medicine and Hygiene. 37: 308-313 Seemuller E., Lupas A., Bawmeister W. (1996). Autocatalytic processing of the 20S proteasome. Nature. 382(6590):468-71. Seemuller, E., Lupas, A., Stock, D., Lowe, J., Huber, R., Baumeister, W (1995).

  Proteasome from Termoplasma acidophillum: A threonine proteinase. Sciense 268: 579-581. Shapiro T. A. and Englund P.T. (1995). The structure and replication of kinetoplast DNA. Annu. Rev. Microbiol. 49:117-43. Sharp P.A. (1987). Trans splicing: variation on a familiar theme? Cell. 50(2):147-8. Schenna, M.; Shalon, D.; Davis, R.W. and Brown, P. O. (1995). Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray.

  Science: 270: 467-470. Shaw, M.K.; HE, C.Y.; Roods, D.S. and Tilney, L.G. (2000). Proteasome inhibitors block intracellular growth and replication of Toxoplasma gondii. Parasitology 121:

  35-47. Sholze H., Frey S., Cejka Z. and Bakker-grunwald T. (1996). Evidence for the existence of both proteasomes and a novel high molecular weight peptidase in Entamoeba

  histolytica.

  J. Biol. Chem. 271: 6212-6216. Smith, P.K., Krohn, R. II., Hermanson, G. T., Malia, H.K., Gartner, F.H., Provenzano,

  M.D., Fujimoto, E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J., Klenk, D.C. (1985). Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Bioch. 150: 76-85. Stothard J, Frame I, Miles M. (1999). Genetic diversity and genetic exchange in Trypanosoma cruzi: dual drug-resistant "progeny" from episomal transformants. Mem Inst Oswaldo Cruz. 94 Suppl 1:189-93. Tanaka, K (1998). Proteasomes: Structure and Biology. J. Biochem. 123: 195-204.

  

Referências Bibliográficas

  Towbin, H.; Staehelin, T.; Gordon, J. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc.

  Natl. Acad. Sci. USA. 76: 4350-4354. Ullman B. (1995). Multidrug resistance and P-glycoproteins in parasitic protozoa.

  J Bioenerg Biomembr. 27(1):77-84. Review. Ullu, E. and Nilsen, T. (1995). Molecular biology of protozoan and helminth parasites.

  In: Biochemistry and Molecular Biology of Parasites. Academic Press LTD. New York.PP 1-17. Umeda M., Banabe Y., Uchimya H. (1997). Phosphorylation of the C2 subunit of the proteasome in rice (Oryza sativa L.). FEBS Lett. 403(3):313-7. Urbina J.A. and Docampo R. (2003). Specific chemotherapy of Chagas disease: controversies and advances. Trends Parasitol. 11: 495-501. Wagner, W. and So, M. (1990) Genomic variation of T. cruzi: Involvement of multicopy genes. Infect. Immun. 58: 3217-3224. Wang C. Y., Mayo M.W. Baldwin A. S. Jr. (1996). TNF- and cancer therapy-induced apoptosis: potentiation by inhibition of NF-kappaB.

  Science. 274(5288):784-7. Wei SH, Ming-Lum A, Liu Y, Wallach D, Ong CJ, Chung SW, Moore KW, Mui AL

  (2006). Proteasome-mediated proteolysis of the interleukin-10 receptor is important for signal downregulation. J Interferon Cytokine Res. 26(5):281-90. Wheren A., Meyer H. E., Sobek A., Kloetzel P.M., Dahlmann B. (1996).Phosphoamino acids in proteasome subunits. Biol. Chem. 377: 497-503. WHO, The World Health Report, 2000 & 2002 (World Health Organization, Geneva, 2002). Wilkinson, D. (1995). Roles of ubiquitylation in proteolysis and cellular regulation.

  Annu. Rev. Nutrition, 15: 161-169. Yao Y., Huang L., et al., (1999). Structural and functional characterizations of the proteasome-activating protein PA26 from T. brucei.J Biol Chem. 274(48):33921-30.

  Yong V, Schmitz V, Vannier-Sato M, et al. (2000). Altered expression of cruzipain and a cathepsin B-like target in Trypanosoma cruzi cell line displaying resistance to synthetic inhibitors of cysteine-proteinases. Mol Biochem Parasitol; 109:47-59.

  

Referências Bibliográficas

  Ywafune Y., Kawasaki H, Hirano H. (2002). Electrophoretic analysis of phosphorylation of the yeast 20S proteasome. Electrophoresis. 23(2):329-38. Vlahakis SR, Badley AD.(2006). Influence of proteasome inhibitors on apoptosis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 9:42-7. Zhang Z., Clawson A., Realini C., Jensen C. C., Knowlton J.R., Hill C.P., Rechsteiner

  M. (1998). Identification of an activation region in the proteasome activator REGalpha. Proc. Natl. Acad. Sci. 95(6): 2807-11. Zhang Z., Clawson, A., Realini, C., Jensem, C. C., Knowlton, J.R., Hill C.P.,

  Rechsteiner M (1998). Identification of an activation region in the proteasome activator REGalpha. Proc. Natl. Acad. Sci. 95 (6): 2807-11. Zingales B. et al., (1997). Trypanosoma cruzi genome project: biological characteristics and molecular typing of clone CL Brener.Acta Trop. 69(2):159-73. Zong C., Gomes A. V., Drews O., Li x., Young G. W., Berthane B. et al. (2006).

  Regulation of murine cardiac 20S proteasomes: role of associating partners. Circ Res. 99(4):372-80. Zou C.B. et al. (2000). Cloning and functional expression of Rpn1, a regulatory-particle non-ATPase subunit 1, of proteasome from T. cruzi. Mol. Biochem. Parasitol.

  110(2):323-31.

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