UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO ESCOLA DE NUTRIÇÃO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SAÚDE E NUTRIÇÃO BIOQUÍMICA E FISIOPATOLOGIA DA NUTRIÇÃO

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  ATIVIDADE ANTIOXIDANTE, ANTIMICROBIANA E ANTI- QUORUM SENSING DE EXTRATOS FENÓLICOS DE ACEROLA

  

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

ESCOLA DE NUTRIđấO

PROGRAMA DE PốS-GRADUAđấO EM SAÚDE E NUTRIđấO BIOQUễMICA E FISIOPATOLOGIA DA NUTRIđấO

  (Malpighia emarginata) E MORANGO SILVESTRE (Rubus rosaefolius) Brígida D’Ávila Oliveira

OURO PRETO

  • – MG

    2015

BRÍGIDA D’ ÁVILA OLIVEIRA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE, ANTIMICROBIANA E ANTI-

  QUORUM SENSING DE EXTRATOS FENÓLICOS DE ACEROLA (Malpighia emarginata) E MORANGO SILVESTRE (Rubus rosaefolius)

  Dissertação de mestrado apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Saúde e Nutrição, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Saúde e Nutrição, área de concentração: Bioquímica e Fisiopatologia da Nutrição.

  Orientador: Uelinton Manoel Pinto

OURO PRETO

  • – MG

    2015

O48a Oliveira, Brígida D' Ávila.

  Atividade antioxidante, antimicrobiana e anti-quorum sensing de extratos fenólicos de acerola (Malpighia emarginata) e morango silvestre (Rubus rosaefolius) [manuscrito] / Brígida D' Ávila Oliveira. - 2015. 89f.: il.: color; grafs. Orientador: Prof. Dr. Uelinton Manoel Pinto. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Escola de Nutrição. Saúde e Nutrição.

Área de Concentração: Bioquímica e Fisiopatologia da Nutrição.

1. Antioxidantes. 2. Produtos de ação antimicrobiana. 3. Acerola . 4. Morango

  • Variedades. I. Pinto, Uelinton Manoel . II. Universidade Federal de Ouro Preto. III. Titulo. CDU: 604.4:615.331

  

Catalogação: www.sisbin.ufop.br

  Às duas pessoas mais importantes da minha vida: meus pais, Francisco e Maria de Lourdes, por confiarem em mim, pelo incentivo, apoio e orações DEDICO.

  

AGRADECIMENTOS

  À Deus por me amparar nos momentos difíceis, me dar força interior para superar as dificuldades, iluminar meu caminho nas horas incertas e ser o grande responsável por todas as conquistas em minha vida. A minha família, pelo amor verdadeiro. Ao meu orientador Uelinton M. Pinto, que apesar do pouco tempo de convivência já foi suficiente para notar o quanto é exemplo de sabedoria, paciência, competência e dedicação. Sem dúvidas um exemplo de pesquisador a ser seguido. Agradeço a disponibilidade e compreenção constante e por me permitir a participação em um projeto de pesquisa de excelência, que com certeza renderá bons frutos. Aos meus co-orientadores Jason Guy Taylor e Michele Corrêa Bertoldi pelo valioso suporte em todos os momentos, pela colaboração, apoio e sugestões nas etapas para desenvolvimento do trabalho. Às amigas de Ouro Preto Alice, Ana Maria, Ju, Raíssa (Raissinha!!!) eLuísapelos momentos de alegrias, descontração, conselhos que com certeza fizeram grande diferença neste memento. A Bruna, em especial, por sempre me ouvir e ser uma grande companheira e amiga em todos os momentos... Valeu Bubu!! As colegas de laboratório, Bábara, Michele e Ana Luiza pelo suporte às pesquisas. A Flávia e Adeline, pelo apoio técnico e troca de conhecimentos. À turma do mestrado 2013 pelo companheirismo, apoio e por todos os momentos que passamos juntos.

  Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Saúde e Nutrição por todo o aprendizado proporcionado para minha formação acadêmica.

  A Capes por me conceder a bolsa de mestrado e ao CNPq pelo financiamento do projeto.

  Obrigada a todos!

  

RESUMO

  Estudos clínicos e epidemiológicos têm associado o consumo regular de frutas e hortaliças com a redução do risco de diversas doenças crônicas não transmissíveis, sendo este efeito atribuído, em parte, à presença de compostos fenólicos. Os compostos fenólicos são metabólitos secundários das plantas, constituídos por anéis aromáticos contendo um ou mais grupos hidroxila, que apresentam diversos efeitos biológicos benéficos, incluindo a atividade antioxidante eantimicrobiana. Estudos tem mostrado que estes compostos também podem inibir a comunicação bacteriana dependente da densidade celular, denominada de quorum

  

sensing . Este trabalho teve como objetivos determinar o efeito antioxidante, antimicrobianoe

  de inibição do quorum sensing dosextratos fenólicosde acerola (Malpighia emarginata) e morango silvestre (Rubus rosaefolius). Os compostos fenólicos das polpasforamextraídos e purificados utilizando extração em fase sólida e quantificados por espectrofotometria, pelo método de Folin-Ciocalteu. A atividade antioxidante dos extratos foi determinada pelos ensaios in vitro DPPH e ABTS. A atividade antimicrobiana foi avaliada pelo teste de difusão em placas, e o efeito bacteriostático e/ou bactericida também foi avaliado por meio da determinação da concentração inibitória mínima (MIC). O extrato fenólico foi testado contra as bactérias Gram negativas Aeromonas hydrophila, Escherichia coli, Hafnia alvei,

  

Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens e Salmonella spp,e as bactérias Gram

  positivas Bacillus cereus,

  Listeria monocytogenes e Staphylococcusaureus, sendo todas de

  grande relevância por serem responsáveis por grande parte dos surtos de origem alimentar ou deterioração dos alimentos. A inibição do quórum sensing foi avaliada pelos teste qualitativo e quantitativo de inibição da produção de violaceína em Chromobacterium violaceum, pelo efeito inibitório sobre amotilidadedo tipo swarming em A. Hydrophila e Serratia marcescense pela determinação da inibição da formação de biofilme poressas mesmas bactérias. O conteúdo de compostos fenólicos encontrados foi 5848,74 mg AGE/L para acerola e no morango silvestre foi 5902,89 mg AGE/L. Os resultados encontrados para a atividade antioxidante pelo método DPPH foram 120,8 µM trolox/g de fruta para o extrato fenólico do morango silvestre e 112,02µMtrolox/g de frutapara o extrato fenólico da acerola. Já para o teste ABTS, foram encontrados 162,40 µM trolox/g de fruta para o extrato fenólico do morango silvestre e 127,18 µM trolox/g de fruta para o extrato fenólico da acerola. Ambos os ensaios confirmaram a maior atividade antioxidante do morango silvestre. Quanto aos resultados para atividade antimicrobiana, o extrato fenólico do morango silvestre inibiu todas as bactérias avaliadas, enquanto que o extrato da acerola não apresentou inibição pelo ensaio de difusão em placas. As MICs encontradas para o extrato fenólico do morango variaram entre 421,63 mg AGE/L e 1475 mg AGE/L, de acordo com cada bactéria avaliada, já para a acerola os valores variaram de 487,39 mg AGE/L a 1462,18 mg AGE/L.Os resultadosdainibição do quorum sensing revelaram que a produção deviolaceínafoi drasticamente reduzida pelo efeito deambos os extratos, além de haver inibição da motilidade e formação de biofilme nas estirpes avaliadas. Os extratos fenólicos dos frutos avaliados apresentaram atividade antioxidante, possivelmente devido aos compostos fenólicos. Além disso, a inibição do crescimento e comunicação microbianas pelos extratos também pode estar relacionada a presença dos compostos fenólicos dos frutos. Os resultados indicam que os extratos fenólicos das frutas avaliadas poderão servir de base para futuras aplicações na indústria farmacêutica e alimentícia, seja como inibidores do crescimento microbiano ou como inibidores de fenótipos regulados pelo quorum sensing, além do potencial antioxidante dos mesmos.

  

Palavras-chave: Atividade antioxidante, atividade antimicrobiana, atividade anti-quorum

sensing , morango silvestre, acerola.

  

ABSTRACT

  Epidemiological and clinical studies have shown that the regular consumption of fruits and vegetables is associated with a reduced risk of several chronic nontransmissible diseases, in part due to the presence of phenolic compounds. These substances are plant secondary metabolites that have aromatic rings with one or more hydroxyl groups. These compounds are known for their biological benefits, including antioxidant and antimicrobial activities. Studies have also shown that these compounds can inhibit the cell density dependent bacterial communication system known as quorum sensing. The objectives of this work were to determine the antioxidant capacity as well as the antimicrobial and quorum quenching activities of phenolic extracts prepared from fruits of Malpighia emarginata (a cherry like fruit) and Rubus rosaefolius (wild raspberry). The phenolic compounds from the pulps were extracted by using solid phase extraction and quantified by using the method of Folin- Ciocalteu. The phenolic extracts were evaluated to determine their antioxidant activity by ABTS and DPPH methods. The antimicrobial activity was evaluated through the plate diffusion assay as well as by determining the minimal inhibitory concentration (MIC). The extracts were tested against the Gram negative bacteria Aeromonas hydrophila, Escherichia

  

coli, Hafnia alvei, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa and Salmonella spp;

  and the Gram positive bacteria Bacillus cereus, Listeria monocytogenes and Staphylococcus

  

aureus , all of great importance due to their involvement either in foodborne diseases or in

  food spoilage. The quorum sensing inhibition of the phenolic extracts was assessed qualitatively and quantitatively by the inhibition of violacein production in Chromobacterium

  

violaceum , as well as through the inhibition of swarming motility in A. hydrophila and

Serratia marcescens and through the inhibition of biofilm formation in these bacteria. The

  results show the antioxidant activity of the phenolic extract from R. rosaefolius was 120,80 µM trolox/g of fruit and 112,02 µM trolox/g of fruit for M. emarginata. The content of phenolic compounds found were 5848.74 mg AGE / L for acerola and for wild raspberry was 5902.89 mg AGE/L. The results for the ABTS assay were 162,40 µM trolox/g for R.

  

rosaefolius and 127,18 µM trolox/g for M. emarginata. Both assays confirmed the higher

  antioxidant activity of wild strawberry. The results from the plate diffusion assay showed that the phenolic extract from R. rosaefolius presented inhibition to all tested bacteria whereas M. extracts was unable to inhibit any of the bacteria in this assay. The MIC found for

  emarginata

  the phenolic extract from R. rosaefolius varied from 421,63 mg AGE/L to 1475 mg AGE/L, while the values varied from 487,39 mg AGE/L to 1462,18 mg AGE/L for M. emarginata extracts. As for the quorum quenching activity, both extracts dramatically reduced violacein production besides having inhibition over swarming motility and biofilm formation for most of the bacteria that were tested. Overall, the phenolic extracts from both evaluated fruits presented antioxidant activities, possibly due to the phenolic compounds. Furthermore, the growth inhibition and the quorum quenching activity from the extracts can also be associated with the phenolic compounds present in these fruits. The results indicate that the phenolic extracts from the evaluated fruits could be used in future applications in the food and pharmaceutical industries either as microbial growth inhibitors or as inhibitors of quorum sensing regulated phenotypes, besides having antioxidant potential.

  

Keywords: antioxidant activity, antimicrobial activity, anti-quorum sensing activity, wild

raspberry, cherry like fruit.

  

LISTA DE TABELAS

  

  

  

  

  

  LISTA DE ILUSTRAđỏES

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

  

LISTA DE SIGLAS

  ABT: 2,2´- azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) AHL: Acil Homoserina Lactona AI-1: Autoindutor 1; AcilHomoserinaLactona AI-2: Autoindutor-2 AI-3: Autoindutor-3 AIP: Peptídeos autoindutores DMSO: Dimetilsulfóxido DPPH: 2,2-difenil-1-picril-hidrazila FRAP: Ferric Reducing Antioxidant Power LB: Luria Bertani, meio de cultura bacteriano QS: Quorum sensing

  SUMÁRIO 1. INTRODUđấO ............................................................................................................

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  2. REVISÃO DE LITERATURA....................................................................................

  3. MATERIAL E MÉTODOS..........................................................................................

  3.9.1. Difusão em Placas...................................................................................................

  3.9. Atividade Antimicrobiana in vitro...............................................................................

  3.8. Análise de Elementos Traço (Metais)..........................................................................

  3.7. Composição Centesimal...............................................................................................

  3.6. Atividade Antioxidante in vitro (DPPH).....................................................................

  3.5. Atividade Antioxidante in vitro (ABTS)......................................................................

  3.4. Compostos Fenólicos Totais........................................................................................

  3.3. Obtenção do Extrato fenólico.......................................................................................

  3.2. Preparo do Material vegetal.........................................................................................

  3.1. Material Vegetal...........................................................................................................

  2.5. Morango Silvestre (Rubus rosafolius)........................................................................

  3.10. Determinação da atividade Anti-Quorum Sensing dos Extratos in vitro...................

  2.4. Acerola (Malpighia emarginata)...............................................................................

  2.3.2. Sistema Quorum Sensing e sua Relação com Deterioração dos Alimentos...........

  2.3.1. Especificidades dos Sistemas Quorum Sensing......................................................

  2.3. Quorum sensing..........................................................................................................

  2.2.2. Propriedades Antimicrobianas de Compostos Fenólicos........................................

  2.2.1. Propriedades Antioxidantes de Polifenóis e Métodos de Análise...........................

  2.1.5. Estilbenos...............................................................................................................

  2.1.4. Lignanas ................................................................................................................

  2.1.1. Flavonoides............................................................................................................. 2.1.2. Ácidos Fenólicos..................................................................................................... 2.1.3. Álcoois Fenólicos....................................................................................................

  2.1. Compostos Fenólicos ................................................................................................

  3.9.2. Teste da Concentração Mínima Inibitória............................................................. .

  3.10.1. Estirpes Monitoras.................................................................................................

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  4.3. Atividade Antimicrobiana............................................................................................

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  4.3.2. Concentração Mínima Inibitória..............................................................................

  4.3.1. Teste de Difusão em Placas......................................................................................

  4.2. Atividade Antioxidante................................................................................................

  3.10.2. Inibição do Quorum-Sensing em C. violaceum por difusão em placas...................................................................................................................................

  4.1.4. Quantificação dos Compostos Fenólicos dos Extratos de Acerola e Morango Silvestre...............................................................................................................................

  4.1.3 Metais....................................................................................................................

  4.1.2. Composição Centesimal........................................................................................

  4.1. Caracterização dos Frutos..........................................................................................

  4. RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................................

  3.11. Análise Estatística.....................................................................................................

  3.10.5. Determinação da Inibição da Formação de Biofilme in vitro em C. violaceum, S. marcescens e A. hydrophila...........................................................................................

  hydrophila e S. marcescens.................................................................................................

  3.10.4. Efeito Anti-Quorum Sensing na Motilidade do Tipo Swarming em A.

  3.10.3. Teste Quantitativo da Inibição do Quorum Sensing em C.violaceum .........................................................................................................................

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  60 4.4. Teste de Inibição do Sistema Quorum Sensing............................................................

  60 4.4.1. Inibição do Quorum Sensing em C. violaceum (Teste de difusão em placas)........

  4.4.2 Quantificação da Inibição da Produção de Violaceína pelos Extratos do Morango

  62 Silvestre e Acerola por Espectrofotometria........................................................................

  4.4.3. Efeito dos Extratos de Acerola e Morango sobre a Motilidade do Tipo

  65 em S. marcescens e A. hidrophila IOC/FDA110-36.........................................

  Swarming

  4.4.4. Efeito dos Extratos Sobre a Formação de Biofilme em A. hidrophila

  67 IOC/FDS110-36, C. violaceum ATCC6357 e S. marcescens.............................................

  72 7. CONCLUSÃO...............................................................................................................

  8. REFERÊNCIAS............................................................................................................

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1. INTRODUđấO

  A procura por alimentos que supram as necessidades básicas energéticas e ao mesmo tempo forneçam benefícios ao organismo humano cresce a cada dia e alavanca pesquisas voltadas ao desenvolvimento de novas tecnologias que agregam valor nutricional e funcional ao alimento, sem gerar perdas na sua qualidade sensorial (COMARELLA et al. 2012).

  Embora as defesas antioxidantes endógenas sejam efetivas, podem ocorrer deficiências e formação de espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio (ROS/RNS), que interagem com o sistema celular antes de serem inativadas ou eliminadas. Todavia, há evidências relatando que em certo nível essas espécies são indispensáveis para determinadas funções fisiológicas (CERQUEIRA et al. 2007). Por outro lado, seu excesso pode causar a morte celular (SILVA, CERCHIARO e HONÓRIO, 2011).

  Frutas e hortaliças são consideradas alimentos de grande importância para uma dieta saudável (SREERAMULU e RAGHUNATH, 2010). Elas fornecem componentes importantes para desempenharem funções básicas do organismo. Dentre estes, podem-se citar: ácido ascórbico, betacaroteno, ácido fólico e outros compostos bioativos, como os compostos fenólicos. Estes alimentos também apresentam funções protetoras devido sua ação na prevençãode doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) como as cardiovasculares e o câncer, devido à presença de substâncias antioxidantes (JONVILLE et al. 2011; FALLER e FIALLO, 2009; SCALBERT, JOHNSON e SALTMARSH, 2005).

  Alguns metabólitos secundários provenientes das plantas, utilizados na defesa contra patógenos e radiação, são chamados de compostos fenólicos e estão diretamente envolvidos na atividade antioxidante de vegetais (TIVERON et al. 2012 e ROGINSKY e LISSI, 2005). Há dois grupos de compostos fenólicos, os flavonoides: flavanonas, flavonas, di- hidroflavonoides, flavonóis, flavanol, antocianinas, isoflavonas e proantocianinas e os não- flavonoides: fenóis simples, ácidos benzóico, taninos hidrolisáveis, acetofenonas e ácidos fenilacético, ácidos cinâmico, cumarinas, benzofenonas, xantonas, estilbenos, chalconas, lignanas e secoiridóides (ROSA, ALVAREZ-PARRILLA e GONZÁLEZ-AGUILAR, 2010). Estes compostos apresentam diversas atividades biológicas como atividade antimicrobiana, antioxidante e antiproliferativa, muitas dessas, atribuídas, em parte, ao seu alto potencial redox (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1989; TAPIERO et al. 2002).

  Assim como doenças crônicas não transmissíveis (DCNT), as doenças transmitidas por alimentos (DTA) tem sido motivo de grande preocupação mundial já que tiveram sua incidência aumentada em todo o mundo nos últimos 20 anos, resultantes do consumo de alimentos contaminados com micro-organismos patogênicos (WHO, 2014). A OMS estima que, anualmente, mais de um terço da população mundial adoeça devido a surtos de DTA e somente uma pequena proporção énotificada (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2014).

  Os compostos fenólicos, além de apresentarem capacidade antioxidante, podem também inibir o crescimento de micro-organismos, o que é de grande valor para indústria alimentícia. Combinado com a crescente conscientização dos consumidores sobre os riscos causados pelas substâncias químicas utilizadas como conservantes de alimentos, o mercado exige que novas pesquisas sejam realizadas sobre os antimicrobianos, com menos efeitos colaterais sobre a saúde humana (PAPADOPOULO et al. 2005). Os compostos fenólicos, por serem de origem natural, poderiam ser utilizados para este fim (SALAW et al. 2011).

  O processo de deterioração dos alimentos apresenta um alto grau de complexidade. Dentre as suas causas estão às alterações bioquímicas e as microbiológicas, sendo essasresponsáveis por grandes perdas econômicas (GRAM et al. 2002). Acredita-se que a deterioração dos alimentos, pelo menos em parte, seja regulada pelo sistema quorum sensing (QS) que é um processo de comunicação célula-a-célula encontrado em determinados grupos de bactérias, por meio da produção de moléculas sinalizadoras (autoindutores). Com a descoberta deste mecanismo, a detecção de autoindutores em produtos alimentares deteriorados acrescentou uma nova dimensão no processo de deterioração dos alimentos (BAI e RAI, 2011).

  Com o uso de agentes inibidores de quorum sensing (IQS), os micro-organismos patogênicos poderiam também ser inibidos, além daqueles deterioradores (KALIA, 2013). Atualmente, várias pesquisas têm sido desenvolvidas com o intuito de descobrir agentes antimicrobianos não tóxicos a saúde humana, que inibam o QS a partir de fontes naturais, pois acredita-se que esses compostos sejam encontrados na natureza devido a sua biodiversidade (HENTZER e GIVSKOV, 2003)

  Estudos sobre as propriedades bioativas e de inibição do quorum sensing de frutos e plantas estão sendo realizadas, no entanto, poucos relatam a real contribuição dos compostos fenólicos isolados. A flora brasileira, apesar de ser muito rica e diversificada, é pouco explorada quanto ao seu potencial biativo e anti-quorum sensing, o qual poderia contribuir na crescente busca por antimicrobianos.

  A acerola (Malpighia emarginata) é uma fruta que vem se destacando por ser uma excelente fonte natural de vitamina C (MACIEL et al. 2010). Sua cor vermelha, no estádio maduro, é devido à presença de antocianinas (LIMA et al. 2003).

  O Rubus rosaefolius, popularmente conhecido como morango silvestre, morango-do- mato, amora vermelha ou amora-do-mato, é uma planta do grupo das framboesas e amoras. Este fruto não tem sido objeto de estudos relevantes. Farmacologicamente, este gênero pode ser de grande importância com relação à fonte de substâncias ativas (MAURO et al. 2002).

  Em razão da escassez de dados bibliográficos sobre os efeitos antioxidante, antimicrobiano e anti-quorum sensing das frutas supracitadas e da importância destas informações, o objetivo deste trabalho foi avaliar as atividades antioxidante, antimicrobiana e anti-quorum sensing dos extratos fenólicos da acerola (Malpighia emarginata) e morango silvestre (Rubus rosaefolius).

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Compostos Fenólicos

  Os compostos fenólicos estão presentes em todas as plantas, principalmente em frutas e hortaliças, e estão recebendo cada vez mais atenção nos últimos anos, por apresentarem funções bioativas, principalmente relacionadas à sua elevada atividade antioxidante (IGNAT, VORF e POPA, 2011).

  Nas últimas décadas, diversos estudos vêm sendo desenvolvidos para avaliar os mecanismos através dos quais os compostos fenólicos exercem seus benefícios à saúde (DEL RIO et al. 2010). Estes efeitos estão relacionados ao sequestro de radicais livres (alcoxila, alquilperoxila, superóxido, radical hidroxila, óxido nítrico, oxidante peroxinitrito); interação entre enzimas (purinas), fatores de transcrição (NF-kB), receptores (receptores de estrogênio) que, por sua vez, contribuem para a redução do estresse oxidativo comum em doenças cardiovasculares, neurodegenerativas, câncer, dentre outras (CERQUEIRA et al. 2007 e FRAGA et al. 2010).

  As principais fontes de compostos fenólicos são frutas e derivados, bebidas, plantas e temperos (OLIVEIRA, VELENTIM e GOULART, 2009). Algumas frutas podem conter entre 200-300mg de compostos fenólicos por 100g de peso de fruta. A média diária de consumo alimentar de um ser humano é normalmente 1g/dia de compostos fenólicos, sendo mais elevada que a ingestão de outros antioxidantes. Sendo os polifenóis os antioxidantes mais presentes na dieta humana, sua ingestão é cerca de 10 vezes maior do que a de vitamina C e 100 vezes maior que a de vitamina E e carotenóides (SCALBERT e WILLIAMSON, 2000).

  Compostos fenólicos apresentam um ou mais anéis aromáticos e pelo menos dois grupos hidroxila. São metabólitos secundários de plantas envolvidos na defesa contra a radiação ultravioleta e ação de patógenos. Estes compostos classificam-se em diferentes grupos, em função do número de anéis de fenol que eles possuem e dos elementos estruturais que ligam estes anéis uns aos outros. Os grupos se dividem emflavonoides e não- flavonoides, que incluem ácidos fenólicos, alcoóis fenólicos, estilbenos e lignanas (MANACH et al. 2004; D’ ARCHIVIO, 2007).

2.1.1. Flavonoides

  A estrutura química básica dos flavonoides (C6-C3-C6) consiste de 15 carbonos distribuídos em dois anéis aromáticos (benzenos), conhecidos como anel A e B, ligados por três carbonos formando um anel heterocíclico, denominado anel C, chamado de pirano (Figura 1) (NIJVELDT et al. 2001; PEREIRA e CARDOSO, 2012). A diversidade estrutural dos flavonoides se dá pela substituição de radicais nos anéis através da hidroxilação, glicosilação, metilação, acilação, e prenilação, em casos como das proantocianidinas e flobafenos, por polimerização. Para estas substituições, as enzimas catalisadoras entram em ação (DIXON e PASENETTI, 2010).

  

Figura 1: Estrutura básica dos flavonoides.

  Fonte: Behling et al. (2004).

  Os flavonoides são subdivididos em vários outros grupos, incluindo flavonóis, flavonas, flavanonas, antocianinas e isoflavonas. Isoflavonoides diferem de outros flavonoides por teremo anel B ligado ao C-3 do anel C (PRAISAN, CALRSON e WYSS, 2010).

  De acordo com a literatura, há cerca de 9000 flavonoides diferentes já descritos a partir de fontes vegetais, porém, muitos outros continuam sendo descobertos (WILLIAMS e GRAYER, 2004). Os mecanismos exercidos pelos flavonoides para seus efeitos benéficos à saúde ainda estão pouco esclarecidos. Porém, especula-se que não seja somente apenas pela sua atividade antioxidante. Isso, devido os flavonoides serem intensamente metabolizados in

vivo , gerando mudanças do seu potencial redox (HUBER e RODRIGUEZ-AMAYA, 2008).

  Os flavonóis apresentam uma dupla ligação entre C2 e C3 (R1) (Figura 2). Este grupo representa os flavonoides com maior representatividade nos alimentose seu composto mais comum é a quercetina. As principais fontes de flavonóis são cebolas (até 1,2 g / kg de peso fresco), couve-flor, alho-poró, brócolis, mirtilos e alguns tipos de chás. Além de terem um papel protetor comum em outros flavonoides, os flavonóis ainda funcionam como sinais atrativos para insetos como as abelhas, ajudando na polinização (FERREIRA, OLIVEIRA e SANTOS, 2008; D’ ARCHIVIO et al. 2007).

  

Figura 2: Estrutura básica dos flavonóis.

  Fonte: Huber e Rodriguez-Amaya, (2008).

  As isoflavonas têm semelhanças estruturais com os hormônios estrogênios, ou seja, grupos de hidroxila nos carbonos C7 e C4, assim como a molécula de estradiol (Figura 3). Elas podem se ligar aos receptores de estrogênio, com isso passam a ser classificadas como fitoestrogênio. As isoflavonas têm como seus principais representantes a daidzeína e a genisteína. Tem fontes principais quase exclusivamente leguminosas, cuja principal representante é a soja, conhecida pelo seu papel protetor contra o câncer de mama e a osteoporose (TAPIERO et al.

  2002; D’ARCHIVIO et al. 2007).

  

Figura 3: Estrutura básica das isoflavonas.

  Fonte: Tapiero et al. (2002).

  As flavonas possuem dupla ligação entre C2 e C3, são os flavonoides menos comuns casca de frutos contém grandes quantidades de flavonas metoxiladas. Na pele de tangerina seu conteúdo é de até 6,5 g / L de óleo essencial de tangerina (D’ ARCHIVIO et al. 2007).

  

Figura 4: Estrutura básica das flavonas.

  Fonte: Tapiero et al. (2002).

  As flavanonas são caracterizadas pela presença de uma cadeia de três carbonos saturados e um átomo de oxigênio no C4 (Figura 5). Elas são geralmente glicosiladas por um dissacarídeo em C7. Estão presentes em elevadas concentrações apenas em frutas cítricas (taxifolina, naringenina e hesperitina), mas também são encontradas no tomate e algumas plantas aromáticas tais como hortelã (TAPIERO et al.

  2002; D’ ARCHIVIO et al. 2007).

  

Figura 5: Estrutura básica das flavanonas.

  Fonte: Tapiero et al. (2002).

  As antocianinas são um grupo de pigmentos vegetais solúveis em água, amplamente distribuídos no reino vegetal (Figura 6). Seu espectro de cor vai do vermelho ao azul, apresentando-se também como uma mistura de ambas as cores resultando em tons de púrpura. Várias frutas, hortaliças, folhas e flores devem a sua atrativa coloração as antocianinas (DEGÁSPARI e WASZCZYNSKYJ, 2004; CASTAÑEDA-OVANDO et al. 2009). Sua estrutura química é caracterizada por um resíduo de açúcar, geralmente na posição C3, quando hidrolisado por aquecimento em meio ácido resultam em dois produtos: os componentes glicídicos e as agliconas, também conhecidas como antocianidinas (CASTAÑEDA-OVANDO et al.

  2009; D’ ARCHIVIO et al. 2007). As antocianinas estão podem fornecer até 1500 mg antocianinas (MANACH et al. 2005). As antocianinas são encontradas em outros vegetais como o açaí, a groselha, a berinjela, o feijão-preto, a batata- doce roxa, entre outros (SILVA, 2011).

  

Figura 6: Estrutura básica das antocianinas.

  Fonte: Volp et al. (2008).

  2.1.2. Ácidos Fenólicos

  Ácidos fenólicos são compostos simples do grupo dos não-flavonoides (LAGHARI et al. 2011). Estes ácidos apresentam um anel benzênico, um grupamento carboxílico e um ou mais grupamentos de hidroxila e/ou metoxila na molécula (ANGELO e JORGE, 2007; SOARES, 2002). Estes compostos podem ser derivados do ácido benzóico (hidroxibenzóico) ou do ácido cinâmico (hidroxicinâmico) (Figura 7).

  (a) (b)

Figura 7: Estrutura química dos ácidos hidroxibenzóicos (a) e hidroxicinâmicos (b).

  Fonte: Angelo e Jorge, (2007).

  Os ácidos hidroxibenzóicos incluem os ácidos gálico, p-hidroxibenzóico, protocatecuico, vanílico e siríngico (BRAVO, 1998). São encontrados em poucas plantas comestíveis para humanos, assim eles não são atualmente considerados de grande interesse nutricional (D’ ARCHIVIO et al. 2007). No entanto, alguns estudos sobre biodisponibilidade do ácido gálico em humanos revelaram que este composto é extremamente bem absorvido, comparado a outros compostos fenólicos (MANACH et al. 2005).

  Os ácidos hidroxicinâmicos são compostos aromáticos com três carbonos que formam uma cadeia lateral (C6

  • –C3), sendo os ácidos caféico, ferúlico, p-cumárico e sináptico os mais comuns (ANGELO e JORGE, 2007; BRAVO, 1998). O ácido caféico é o ácido fenólico mais abundante, representando entre 75% e 100% do total de conteúdos ácidos hidroxicinâmicos na maioria das frutas, como os kiwis que podem conter até 1g de ácido caféico/peso kg fresco. O ácido hidroxicinâmico é encontrado em todas as partes da fruta, embora as concentrações mais elevadas estejam na parte externa do fruto maduro. A concentração é decresce durante seu amadurecimento, porém a quantidade total se eleva à medida que o fruto aumenta em tam anho (D’ ARCHIVIO et al. 2007).

  2.1.3. Álcoois Fenólicos

  O tirosol e hidroxitirosol são os principais alcoóis fenólicos (Figuras 8 e 9), estando presentes principalmente no azeite virgem (40,2 e 3,8 mg /kg, respectivamente) (D’

  ARCHIVIO et al. 2007). Estes compostos podem ser extraídos por meio da hidrolise da oleuropeína e ligstroside, glicosídeos polares presentes nas azeitonas (VISSERS, ZOCK E KATAAN, 2004). A cultivar e o estado de maturação das azeitonas constituem os dois fatores preponderantes do teor de álcoois nos azeites virgens obtidos de frutos (SERVILI et al. 2004; BELTRAN et al. 2005; PERES et al. 2009).

  

Figura 8: Estrutura química do hidrotirosol. Figura 9: Estrutura química dotirosol.

  Fonte: Bass, (2013). Fonte: Bass, (2013).

2.1.4. Lignanas

  Lignanas são compostos difenólicos distribuídos em grande parte do reino vegetal (Figura 10). Há uma grande variedade de lignanas vegetais, mas apenas parte delas pode converter por meio da microbiota intestinal as enterolignanas (lignanas absorvíveis pelo organismo humano) em enterodiol e enterolactona (MILDER et al. 2005). Com isso, várias lignanas, normalmente as encontrados em produtos de cereais integrais, podem ser convertidas em fitoestrogênios (DIXON, 2004), assim como as isoflavonas. Entre os alimentos consumidos pelo homem, a linhaça possui a maior concentração de precursores enterolignanas (KUIJSTEN et al. 2005).

  

Figura 10: Estrutura básica da lignana.

  Fonte: Souza, Nakamura e Corrêa, (2012).

2.1.5. Estibenos

  Os estibenos possuem uma dupla ligação central entre os carbonos ligados por dois grupos fenólicos (Figura 11) propensos a reações de oligomerização e acoplamento (QUIDEAU et al. 2011). Os estilbenos são o menor grupo dos polifenóis, sendo seu principal representante o resveratrol (trans-3,5,4-trihidroxiestilbeno). O trans-resveratrol se tornou popular devido a sua atividade anticâncer, relacionada a sua atividade antioxidante e ser encontrado principalmente em vinhos e uvas (PEREIRA et al. 2013; CASSIDY, HANLEY e LAMUELA-RAVENTOS, 2000).

  Vários estudos evidenciam o papel do resveratrol na prevenção e retardo de doenças cardíacas, isquemias, diabetes, câncer inflamações e infecções virais, mesmo em baixas concentrações (BAUR e SINCLAIR, 2006).

  Figura 11: Estrutura básica do estibeno.

  Fonte: Nemen e Lemos-Sena, (2010).

2.2.1. Propriedades Antioxidantes de Polifenólis e Métodos de Análise

  Estudos epidemiológicos demonstram que a alta ingestão de produtos vegetais está associada com uma baixa significativa da prevalência das doenças crônicas como aterosclerose e câncer. Esses efeitos têm sido relacionados aos compostos com poder antioxidante (SILVA et al. 2010).

  A atividade antioxidante dos compostos fenólicos refere-se tanto à capacidade em prevenir danos causados por espécies reativas de oxigênio (ERO) ou em evitar a geração dessas, por meio do sequestro de radicais livres e doação de elétrons ou átomos de hidrogênio (PERRON e BRUMAGHIM, 2009; GONZALO e ALONSO, 2002). Os radicais livres são átomos, grupo de átomos ou moléculas que apresentam um elétron desemparelhado na órbita externa tornando- os altamente reativos. O ânion superóxido (O2•-), o radical hidroxila (•OH) e o óxido nítrico (NO•) são exemplos de radicais livres (DRÖGE et al. 2005). A geração destes radicais está ligada ao metabolismo de oxigênio, sendo a mitocôndria, por meio da cadeira transportadora de elétrons, a principal geradora. Os antioxidantes têm como função prevenir ou reduzir danos causados pelas EROs (BARBOSA et al. 2010).

  Os danos mais graves originados pelas EROs são causados ao DNA e RNA. Quando a cadeia do DNA é quebrada, ela pode ser reconectada em outra posição, ocorrendo alteração na ordem de suas bases. Essa é uma etapa básica para ocorrência de mutações e acúmulo de bases danificadas podendo desenvolver câncer (BARREIROS, DAVID e DAVID, 2006).

  A atividade antioxidante de compostos fenólicos deve-se principalmente às suas propriedades redutoras e estrutura química. Estas particularidades destes fitoquímicos apresentam grande importância quanto ao seu poder de neutralização, sequestro de radicais livres e quelação de metais, agindo na etapa de iniciação e propagação do processo oxidativo. Assim, colaboram para reduzir o potencial de ocorrência de doenças crônico-degenerativas (SOUSA et al. 2007; DUARTE-ALMEIDA et al. 2006).

  Existem diversos métodos disponíveis para avaliação da atividade antioxidante in vitro das mais diversas substâncias, de forma que o analista pode escolher o melhor, de acordo com as condições de análise. Estes testes são ferramentas de uso continuo em laboratórios, pois são extremamente necessários na escolha de substâncias que futuramente se tornarão fármacos. Os métodos antioxidantes também podem auxiliar na escolha das espécies de planta para estudos químicos e farmacológicos, comprovando ou não a presença de substâncias com capacidade antioxidantes em alimentos e bebidas, podendo agregar valor comercial aos alimentos (ALVES et al. 2010). Entre estes métodos, podem ser citados o DPPH, ABTS, FRAP e ORAC como os mais utilizados, sendo que cada um apresenta suas particularidades.

  No método ABTS , quando o perfulfato de potássio é adicionado ao ácido 2,2-azino- bis (3-etilbenzotiazolin)-6-sulfônico (ABTS), faz com que este seja convertido ao seu cátion (ABTS•+). Este radical de cor azul esverdeado absorve a luz a 734 nm e é reativo para a maioria dos antioxidantes tanto de natureza hidrofílica quanto hidrofóbica, sendo esta uma de suas vantagens quando comparada a outros métodos. Neste ensaio antioxidante, o cátion radical ABTS azul esverdeado é convertido em sua forma neutra, tornando-se incolor, devido a sua captura pela substância antioxidante avaliada. A reação pode ser monitorada espectrofotometricamente (MARTYSIAK-ZUROWSKA e WERONIKA-WENTA, 2012). Uma vantagem deste método é seu uso ser permitido tanto em soluções orgânicas quanto aquosas (PRADO, 2009).

  O método DPPH se baseia na capacidade antioxidante de uma determinada substância em sequestrar o radical DPPH, transformando a sua forma reduzida chamada hidrazina. Quando uma determinada substância age como redutora, doando átomos de hidrogênio ao radical DPPH, a hidrazina é obtida e como consequência ocorre uma mudança na coloração de violeta a amarelo pálido. Este decaimento da coloração pode ser observado pelas leituras nas absorbâncias 515 a 528 nm (ALVES et al. 2010). O método apresenta vantagens quando a substância em estudo é mais solúvel em solventes orgânicos, além se ser um radical livre estável disponível comercialmente, o que facilita seu uso (LIMA, 2008).

  O método ORAC utiliza a proteína ficoeritrina (PE), fotossintética, como marcadora de fluorescência, como alvo dos radicais. Este ensaio mede a diminuição da emissão de fluorescência pela ficoeritrina, como consequência da modificação da sua conformação pela ação dos agentes oxidantes (SUCUPIRA et al. 2012; VASCONCELOS et al. 2007).

  Quanto as

vantagens do método, estão o uso da fluorescência como medida do dano oxidativo, ocorrendo

menor interferência de compostos coloridos que podem estar presentes nas amostras, o que é algo

importante quando são analisados alimentos que possuem cores fortes (LIMA, 2008).

  O FRAP baseia-se na habilidade antioxidante de um composto, em transformar o ferro

  3+ 2+

  naforma complexada com a 2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) Fe -TPTZem Fe TPTZ (ferroso-tripiridiltriazina), na presença de um antioxidante e em condições ácidas. O

  2+

  complexo Fe -TPTZ possui coloração azul podendo ser verificada na absorbância 593 nm, esta coloração é proporcional a concentração de Fe na amostra. As limitações do método estão

  3+ 2+

  relacionadas ao fato de queo redutor que é hábil para reduzir Fe a Fe às vezes pode não ser um antioxidante emuitos antioxidantes podem não ter a habilidade específica para reduzir

  3+ 2+ Fe a Fe , a exemplo a glutationa (VASCONCELOS et al. 2008).

  Os métodos antioxidantes apresentam cada um sua particularidade, o que sugere a realização detestes preliminares para verificar qual melhor se adéqua ao estudo. Com a grande diversidade de radicais e diferentes sítios de ação, torna-se difícil ditar um único e melhor método capaz de representar a real capacidade antioxidante da substância (SUCUPIRA et al. 2012).

2.2.2. Propriedades Antimicrobianas dos Compostos Fenólicos

  Além das propriedades antioxidantes, os compostos fenólicos também apresentam atividade antimicrobiana, a qual é de grande interesse para indústria de alimentos para prolongar a vida de prateleira dos produtos, pela inibição do crescimento de micro- organismos (DUNG et al. 2009). Esta propriedade também é importante para saúde e segurança dos consumidores, pois o uso de aditivos químicos pode trazer conseqüências prejudiciais a saúde do consumidor, em longo prazo. Assim, a exploração de antimicrobianos naturais para a conservação de alimentos tem recebido maior atenção (VAQUERO et al. 2010 e ARMAN, 2013 ).

  A ação antimicrobiana dos compostos fenólicos tem sido avaliada contra um grande número de micro-organismos. Os polifenóis do tipoflavonas, flavonóis e taninos têm recebido mais atenção nos últimos anos, devido aos seus amplos espectros e maior atividade antimicrobiana quando comparada a outros compostos fenólicos, e ao fato que a maioria deles serem capazes de suprimir uma série de fatores de virulência microbianos (inibição da formação de biofilme, redução de ligantes de adesão e a neutralização de toxinas bacterianas). Além disso, demonstram sinergismo com antibióticos (DAGLIA, 2012).

  Vários mecanismos podem estar relacionados com atividade antimicrobiana dos compostos fenólicos como a desestabilização da membrana citoplasmática, a permeabilização da membrana, aglomeração das células microbianas, inibição de enzimas microbianas extracelulares, ações diretas sobre o metabolismo microbiano, privação dos substratos essenciais, ou a privação dos substratos necessários para o crescimento microbiano, especialmente minerais como ferro e zinco (por meio da quelação) (CUSHINIE et al. 2007; PUUPPONEN-PIMIÄ et al. 2005). Além disso, a presença de um grupo hidroxila no composto fenólico pode fazer ligação com o sítio ativo de enzimas, formando ligações de hidrogênio com as mesmas e alterando a sua atividade (SALAW et al. 2011).

2.3. Quorum Sensing

  Durante muito tempo acreditava-se que as bactérias repondiam isoladamente aos estímulos do ambiente, processando essas informações e transformando-as em algum tipo de resposta correspondente, de forma isolada. No entanto, nas últimas décadas, foi descoberto que as bactérias também apresentam a capacidade de capturarem informações delas mesmas ou de outras bactérias e montarem respostas unificadas. As atividades realizadas por este comportamento cooperativo são mais eficazes em populações elevadas, tornado o mecanismo de expressão dependente da alta população de bactérias. Acredita-se que essa habilidade tenha sido desenvolvida pelas bactérias de forma independente e tenha grande utilidade para o comportamento em grupo (FUQUA, WINANS e GREENBERG, 1994; FUQUA, WINANS e GREENBERG, 1996; PLATT e FUQUA, 2010).

  As bactérias monitoram sua densidade populacional através da produção de moléculas sinalizadoras também conhecidas como autoindutores. Elas detectam o aumento da concentração destes autoindutores, em resposta geram uma alteração na expressão gênica, em um sistema comumente conhecido como quorum sensing (FUQUA, WINANS e GREENBERG, 1994; WATERS e BASSLER, 2005).

  O quorum sensing é muito importante para vida bacteriana, pois ele é responsável por regular diversas funções celulares como a esporulação, formação de biofilme, produção de bacteriocinas, a competência, expressão de fatores de virulência, produção de antibióticos, conjugação, pigmentação, motilidade, bioluminescência. Além disso, os autoindutores permitem que cada espécie se reconheça em seu habitat. Isso permite que as bactérias apresentem um comportamento colaborativo em atividades que seriam impossíveis de serem realizadas isoladamente (PORTELA, 2011; SMITH, FRATAMICO e NOVAK, 2004; HAMMER e BASSER, 2003). A Tabela 1 mostra os diferentes fenótipos regulados pelo e suas respectivas moléculas sinalizadoras.

  quorum sensing

  Tabela 1: Sinalizadores e fenótipos regulados pelo quorum sensing em bactérias.

  Sinalizador Fenótipos Regulados Referências Bactéria

  Protease extracelular e C4-HSL e C6-HSL GUIMARÃES, 2009; BOSGELMEZ-TINAZ, 2002

  Aeromonas hydrophila

  formação de biofilme C4-HSL Protease extracelular GUIMARÃES, 2009

  Aeromonas salmonicida Agrobacterium

  C8-HSL Conjugação GUIMARÃES, 2009

  tumefacien Desenvolvimento e

  Bacillus subtlis AIPs

  LI e TIAN 2012

  adaptação Burkholderia cepacia C8-HSL Protease e sideróforo RUMJANEK, FONSECA e XAVIER, 2004

  Antibiótico, exoenzimas, RUMJANEK, FONSECA, e XAVIER, 2004;

  Chromobacterium

  C6-HSL

  violaceum

  cianeto, violaceína GUIMARÃES, 2009

  

Escherichia coli AI-2, AI-3 Divisão celular GONZALEZ e KESHAVA, 2006; GUIMARÃES, 2004

  Antibióticos RUMJANEK, FONSECA e XAVIER, 2004;

  C6-HSL carbapenêmicos, Erwinia carotovora

  GUIMARÃES, 2009 exoenzimas

  Erwinia chrysanthemi 3-oxo-C6-HSL Pectinases RUMJANEK, FONSECA e XAVIER, 2004 3-oxo-C6-HSL Exopolissacarídeos GUIMARÃES, 2009

  Erwinia stewartii

  Continua Continuação

  Lactococcus e outras bactérias

  AIPs Produção de bacteriocina GUIMARÃES, 2009

  láticas

  Formação de corpos de frutificação

  Myxococcus xanthus AIPs

  GUIMARÃES, 2009; LI, 2012 ou esporulação Ciclo(L-Phe-L-Pro), Ciclo(L-Tyr-L-

  Pro) e DKPS

  Pseudomonas fluorescens

  Antibiótico fenazina GONZALEZ e KESHAVA, 2006; C4-HLS e C12-HLS; Fatores de virulência, exoenzimas,

  RUMJANEK, FONSECA, e

  Pseudomonas aeruginosa

  cianeto, RpoS, lecitina, piocianina,

  XAVIER, 2004; GUIMARÃRES, ramnolipídeo, pili, Xcp, formação de 2009; LI e TIAN, 2012

  Biofilme, RhIR Antibiótico carbapenem, pigmento BOSGELMEZ-TINAZ, 2003;

  Serratia liquefaciens

  C4-HLS (prodigiosina), protease GUIMARÃES, 2009 C4-HLS e C6-HSL Motilidade tipo swarming BOSGELMEZ-TINAZ, 2003

  Serratia spp. ATCC 39006

  RUMJANEK, FONSECA, e Formação de biofilme, virulência

  Staphylococcus aureus

  AIP

  XAVIER, 2004; LI e TIAN, 2012 Uma das grandes descobertas na microbiologia ocorreu na década de 70, quando descreveram pela primeira vez o quorum sensing (embora não o tenham nomeado desse termo) em duas bactérias marinhas Vibrio fischeri e Vibrio harveyi (BAI e RAI, 2002; MILLER e BASSLER, 2001). A bactéria V. fischeri é encontrada em tecidos emissores de bioluminescência de alguns peixes e lulas. Quando estes micro-organismos estão

  10

  11

  em alta densidade (10 a 10 células por ml), os genes responsáveis pela bioluminescência são ativados pelo sistema quorum sensing (MARCH e BENTLEY, 2004; VISICK et al. 2000; FUQUA, WINANS e GREENBERG, 1994). Entretanto, o termo quorum sensing só foi concebido em 1994 pelo Dr. Steven Winans para evitar confusões geradas pelos termos auto- indução e auto-regulação, além de melhor descrever o fenômeno (FUQUA, WINANS e GREENBERG, 1994; TUROVISKIY et al. 2007).

  Quando a V. fischeri está em seu ambiente natural, ela não apresenta bioluminescência devido a sua baixa densidade. Diferentemente, quando cultivadas em ambiente artificial, em alta densidade, a bioluminescência de cor azul-esverdeada se apresenta (WHITEHEAD et al. 2006). O operon Lux é o responsável pela transcrição do fenótipo de biolumenescência em V

  

ficheri . O gene luxI codifica para a enzima responsável (LuxI) pela síntese do autoindutor N-

  (3-oxohexanoíl)-homoserina lactona (3-oxo-C6-AHL). Após sintetizada, a 3-oxo-C6-AHL segue para o meio extracelular, e quando atinge seu limiar, a 3-oxo-C6-AHL retorna para o meio intracelular onde se liga ao produto da codificação do gene luxR, o fator de transcrição LuxR. O complexo 3-oxo-C6-AHL-LuxR liga-se ao operon luxICDABE, promovendo a . transcrição de todos os componentes necessários para produção de bioluminescência ( ANTUNES et al. 2007; MARCH e BENTLEY, 2004; WHITEHEAD et al. 2001).

  Apesar de ser uma área de pesquisa relativamente nova, vários autoindutores já foram descritos na literatura (JAYARAMAN e WOOD, 2008). Os autoindutores são moléculas pequenas produzidas pelas células bacterianas durante seu crescimento, o que torna sua quantidade proporcional ao número de células. Esses sinalizadores são divididos em quatro classes: auto-indutor-1 (AI-1) moléculas derivadas de ácidos graxos, utilizadas por bactérias gram-negativas no mecanismo de comunicação intra-especifica. Neste grupo, as moléculas autoindutoras são da família da N-acil homoserinas lactona (AHL) (WHITEHEAD et al. 2001; BRELLES-MARIÑO e BEDMAR, 2001); auto-indutor-2 (AI-2) ou furonosil borato diéster, é um autoindutor produzido tanto para bactérias gram-negativas quanto por gram- positivas para a comunicação intra e interespecífica (CHEN et al. 2002; SCHAUDER e BASSLER, 2001); autoindutor-3 (AI-3) que tem a estrutura ainda desconhecida, mas pode ser fim os peptídeos autoindutores (AIP) encontrados em bactérias gram-positivas que permitem a comunicação intraespecífica (SOLA, 2011).

  A comunicação entre as bactérias é essencial, o que justifica a grande semelhança entre seus sistemas. No entanto, as diferenças dos sistemas existem proporcionando a sobrevivência bacteriana em seu nicho. Com isso, o quorum sensing se torna único para cada espécie bacteriana (WATERS e BASSLER, 2005).

2.3.1. Especificidades dos Sistemas Quorum Sensing

  

As AHLs são as moléculas sinalizadoras de quorum sensing mais estudadas até o

  momento, além de serem as mais comuns entre as bactérias gram-negativas. Foram identificadas várias moléculas utilizadas como sinalizadores nesse grupo, com variações no tamanho da cadeia carbônica ou substituição da cadeia acila. Estas moléculas são derivadas de uma estrutura básica da AHL (Figura 12) (GALLOWAY, 2011; PONCE, 2007; WHITEHEAD et al. 2001). A diversificação das AHLs garante o reconhecimento específico de seus reguladores, permitindo que as espécies bacterianas reconheçam suas próprias AHLs (NASSER e REVERCHON, 2007).

  

Figura 12: Estrutura básica das AHLs: anel homoserina lactona e cadeias laterais variadas. R é o

radical podendo conter de 4 a 18 carbonos com ou sem substituição no Carbono 3 da cadeia.

  Fonte: KUMARI et al. (2009).

  Há três famílias de proteínas que sintetizam as AHLs descritas: LuxI, AinS e HdtS. As proteínas homólogas a LuxI são as principais classes de enzimas responsáveis pela síntese de AHL. Essas enzimas utilizam S-adenosil-metionina (SAM) para sintetizar o anel homoserina lactona; já a cadeia acila é produzida pelo metabolismo de lipídeos e carreada por diferentes proteínas acilcarreadoras (ACP). A reação é iniciada pela ligação de SAM seguida pela ACP- acilada, com formação da ligação amida. A molécula de holo-ACP é liberada previamente devido a lactonização e finalmente a molécula AHL é liberada (CAMPOS, 2007; NASSER e REVERCHON, 2007). Após a produção da AHL pela enzima LuxI, esse autoindutor se difunde para fora da célula, elevando sua concentração. Quando o sinal chega a um limiar crítico, a AHL se liga ao LuxR intracelular e este complexo dá inicio a transcrição gênica, a qual gera uma resposta (Figura 13) (WILIANS e BASSER, 2005; PARKER e SPERANDIO, 2008). Todos os receptores da AHL são do tipo LuxR. Estas proteínas são formadas por aproximadamente 250 aminoácidos e apresentam dois domínios funcionais: um domínio amino-terminal, responsável por se ligar a AHL e o domínio carboxi-terminal que se liga ao DNA, regulando a transcrição. As proteínas LuxR interagem com o DNA na forma dimérica e reconhecem a região especifica do gene alvo (PINTO e WINANS, 2009). Esse complexo LuxR-DNA interage com a RNA polimerase que por sua vez transcreve o gene requerido (QUIN et al 2000; KIRATISIN, TUKER e PASSADOR 2002).

  Figura 13: Sistema quorum sensing em bactérias gram-negativas.

  Fonte: Jayaraman e Wood, (2008).

  Sistemas homólogos a LuxI/LuxR foram identificados em muitas bactérias Gram- negativas, sendo que cada uma é capaz de produzir AHLs específicas. A exemplo tem-se

  

Pseudomonas aeruginosa e Serratia marcescens; estes mecanismos de sinalização controlam

  vias responsáveis pela expressão de vários fatores de virulência. No entanto, ainda existem funções controladas pelo quorum sensing não totalmente elucidadas (PARKER e SPERANDIO, 2008).

  Algumas bactérias gram-positivas utilizam os peptídeos autoindutores (AIP) como moléculas sinalizadoras do quorum sensing. Os AIP são produzidos no citoplasma como peptídeos precursores que são clivados, modificados e transportados para o meio extracelular por transportadores do tipo ABC. Os AIP interagem especificamente com os domínios externos da proteína quinase, ligados à membrana que por sua vez transmitem a informação para um regulador de resposta, em um sistema de dois componentes. Essa interação irá ativar a quinase, que resultará na fosforização da proteína reguladora, que por sua vez se liga ao DNA, alterando a transcrição gênica (Figura 14) (TAGA e BASSLER, 2003; JAYARAMAN E WOOD, 2008; BASSER, 1999).

  Semelhantemente as bactérias gram-negativas, em densidades celulares baixas, a concentração do sinal AIP é baixa no exterior da célula e não há ativação da proteína reguladora. Entretanto, em densidades celulares elevadas, há a ativação desta proteína. Nestes sistemas, estão envolvidos processos complexos como a regulação de virulência em

  

Staphylococcus aureus , competência para aquisição de DNA em Bacillus subtilis e

Streptococcus pneumoniae , esporulação em B. subtilis, transferência de plasmídeo por

  conjugação em Enterococcus faecalis, e produção de bacteriocina em bactérias lácticas (KLEEREBEZEM et al. 1997; RUMJANEK, FONSECA e XAVIER, 2004; JAYARAMAN e WOOD, 2008).

  

Figura 14: Quorum sensing em bactérias gram-positivas.

  Fonte: Jayaraman e Wood, (2008).

  As AHL e os AIP são autoindutores responsáveis pela comunicação entre bactérias de uma mesma espécie. Entretanto, há o autoindutor do tipo AI-2 que permite a comunicação entre diferentes espécies, sendo considerado um autoindutor universal. O gene LuxS codifica para a enzima responsável pela produção do AI-2 que foi identificado como um furanosil boratodiester em Vibrio harvei (NAZZARO, FRATIANNI e COPPOLA, 2013; CHAN et al. 2002; JAYRAMANE e WOOD, 2008).

2.3.2. Sistemas Quorum Sensing e sua Relação com a Deterioração dos Alimentos

  Dados sobre a ocorrência de doenças veiculadas por alimentos são úteis para direcionar recursos e priorizar intervenções. Os alimentos podem ser contaminados por muitos agentes, dentre eles estão os de origem biológica que incluem uma grande variedade de bactérias, fungos, vírus e parasitas (SCALLAN et al. 2011) o que torna a determinação do agente etiológico mais complexa. Para a indústria de alimentos, a contaminação dos alimentos além de expor o consumidor aos riscos, gera uma enorme perda econômica (PERRY, 2004).

  Atualmente o quorum sensing tem sido associado à deterioração dos alimentos, o que tem gerado grande interesse por parte da comunidade científica (TAN, YIAN e CHAN, 2014; HOUDT e MICHIELS, 2010). Esse grande interesse deriva do fato que vários autoindutores foram isolados de alimentos em processo de deterioração como brotos de feijão, camarões refrigerados e carnes armazenadas sob diferentes temperaturas e embalagens (ZHU et al. 2015; BLANAS e NYCHAS, 2014; RASCH et al. 2005). A Tabela 2 apresenta os principais sinalizadores encontrados em diferentes alimentos deteriorados.

  Tabela 2: Possível relação do quorum sensing com a deterioração dos alimentos. Bactéria Produto Fenótipo Molécula de Sinalização Pseudomonas fluorescens 395 Leite Deterioração proteolítica C4-HSL e 3OC8-HSL

  Deterioração proteolítica e lipolítica

  Serratia proteomaculans

  Leite 3-oxo-C6- HSL

  strainB5a Pseudomonas fluorescens Leite Deterioração proteolítica L-HSL

  α-amino-γ –butirolactones

  Pseudomonas phosphoreum e

  Filetes de bacalhau Atividade quitinolítica 3-hidroxi-C8-HSL Aeromonas spp.

  Erwinia carotovora Vegetais Deterioração celulolítica e proteolítica 3-oxo-C6- HSL Pectobacterium sp. A2JM

  Brotos de feijão Deterioração pectinolítica e proteolítica 3-oxo-C6- HSL

  Serratia plymuthica RVH1 Vegetais Atividade quitinase e protease 3-oxo-C6- HSL e C6-HSL Hafnia alvei e Serratia spp. Produtos embalados a vácuo Deterioração Proteolítica 3-oxohexanoil HSL Pseudomonas spp. Carne Formação de biofilme em carnes AHLs Photobacterium phosphoreum e

  Filetes de bacalhau Deterioração quitinolítica 3-hidroxi-C8-HSL Aeromonas spp.

  Fonte: Bai e Rai (2011).

  Diante da vasta gama de micro-organismos que utilizam o QS como via de comunicação, aplicações práticas do controle desse sistema, por meio de sua interferência, se tornam atrativas (RUMJANEK, FONSECA e XAVIER, 2004). Pela interrupção do QS em bactérias, seja ela por qualquer mecanismo, pode-se controlar a expressão de genes envolvidos com a patogenicidade microbiana e deterioração dos alimentos. Assim, o uso de inibidores do quorum sensing poderia ser uma alternativa na conservação dos alimentos, melhorando a segurança alimentar e a vida de prateleira dos produtos (BAI e RAI, 2012; SKANDAMIS e NYCHAS, 2012).

  O sistema QS depende de uma sequência de eventos, incluindo a produção do sinal, a detecção do mesmo e a modulação gênica. Com a interrupção de qualquer uma dessas etapas, haverá uma falha na comunicação e, desta forma, haverá interferência na patogênese de microbiana (PAN e REN, 2009).

  A inibição ou bloqueio do QS em bactérias gram negativas pode ser realizado pelo uso de vários mecanismos como: redução atividade da proteína do receptora de AHL; inibição da produção da molécula sinal; degradação de AHL e o uso de moléculas análogas a AHL (KALIA, 2013).

  A degradação dos sinais do QS pode realizada pelas viasquímica, metabólica e enzimática (KALIA e PUROHIT, 2011). Dong et al. (2000) e Lin et al. (2003) identificaram enzimas capazes de degradar as moléculas sinalizadoras de AHLs como as lactonases de AHL, que hidrolisam o anel lactona, e as acilases de AHL, que hidrolisam a ponte amida entre a cadeia de ácido graxo da AHL. A Tabela 3 mostra algumas enzimas inibidoras do QS já identificadas em vários micro-organismos.

  Embora os inibidores do quorum sensing ajudem a atenuar a virulência a reduzir a formação de biofilme e aumentem a sensibilidade bacteriana a drogas, eles são úteis como adjuvantes, uma vez que não apresentam necessariamente atividade bactericida e/ou bacteriostática (NI et al. 2008). Mesmo assim, a inibição do quorum sensing tem sido vista como uma alternativa aos antibióticos convencionais, uma vez que não há uma ação bactericida ou bacteriostática, reduzindo assim, a pressão seletiva e o desenvolvimento de resistência (VATTEMA et al. 2007). Ainda relacionando o papel dos inibidores e os antibióticos, aqueles poderiam ser utilizados como um adjuvante na administração de antibióticos, atuando primeiramente como depressores da célula bacteriana que posteriormente, com a exposição aos antibióticos, não resistiriam ocorrendo a sua morte (CADY et al. 2012).

  Tabela 3: Enzimas responsáveis pela hidrólise dos sinalizadores de quorum sensing.

  Bacteria Enzima Molécula Sinal degradada

  Lactonase AHLs

  Bacillus spp.strain 240B1 Bacillus thuringiensis

  Lactonase AHLs

  Stappia spp. estirpes de 5, 176 e 97-1 Lactonase

  AHLs Lactonase

  AHLs

  Oceanobacillus estirpes 30, 172, e 97-2 Halomonas sp. estirpe 33

  Lactonase AHLs

  Acilase / lactonase AHLs

  Tenacibaculum descolorirestirpe 20J

  Acilase / lactonase C4HSL e 3OC12-HSL

  Hyphamonas sp. DG895 Alteromonas sp. estirpe 168

  Acilase C4HSL e 3OC12-HSL

  Bacillus megaterium

  AHL-oxidase C4HSL e 3OC12HSL

  Bacillus circulans estirpe 24 Diferente de lactonase C4HSL e 3OC12HSL

  AHL-acilase

  3OC12HSL

  Bacillus pumilus S8-07

  AHL-acilase AHLs de cadeia longa

  Ralstonia sp. XJ12B Pseudomonas aeruginosaPAO1 AHL-acilase AHLs de cadeia longa

  AHL lactonase, Acilase (amidohidrolase) e Atividade de AHLs, AHLs e 3-oxo-N-

  Rhodococcus erythropolisestirpe W2 oxidoredutase AHLs

  AHL

  3OC6HSL

  Burkholderia estirpe GG4

  • – oxidoreductase AHL lactonase AHLs

  Agrobacterium tumefaciens Fonte: adaptado de Kalia, (2012).

  Novas estratégicas estão sendo desenvolvidas na busca por novos agentes antimicrobianos, tendo como alternativa principal os produtos naturais. Além do uso no tratamento de enfermidades, os agentes antimicrobianos de origem natural são de grande interesse para indústria alimentícia na prorrogação da vida de prateleira dos produtos. Com isso, os antimicrobianos podem substituir os conservantes químicos utilizados atualmente, uma vez que estes não são bem vistos pelos consumidores (MOGOSANU et al. 2015; SULTANBAWA, 2013).

  Alguns estudos comprovaram que metabólitos secundários (compostos aromáticos, derivados sulfurados, alcalóides) apresentam propriedades inibidoras da detecção de quórum (MOGOSANU et al. 2015; NAZZARO, FRATIANNNI e COPPOLA, 2013; TRUNCHADO et al. 2012; ADONIZIO et al. 2006).

  A capacidade antioxidante, anti-inflamatória e anti-cancerígena dos flavonoides já tem sido foco de pesquisas há algum tempo. A partir do conhecimento destes benefícios, flavonoides como quercetina, kaempferol, narigina e apigenina tiveram sua capacidade inibitória do quorum sensing testada, os quais apresentaram inibição para AHL e AI-2 (VIKRAM et al. 2010).

  A família das furanona halogenadas, compostos naturais derivados de algas marinhas como a Delisea pulchra, foram os primeiros inibidores do quorum sensing a serem descobertos, assim ganharam grande destaque. Há limitações quanto ao uso das furanonas devido a sua toxicidade (KALIA et al. 2013; DEFOIRDT, BOON e BOSSIER 2010).

  Os compostos naturais apresentam a capacidade de inibir o QS, devido sua estrutura ser semelhante a dos sinalizadores. Tal semelhança torna estes compostos competidores da AHL, bloqueando sua ligação mediada pelo QS (TEPLITSKI et al. 2000).

  Outra forma de inibição do QS pelos compostos naturais é pela degradação da AHL. Uroz e Heinonsalo, (2007) conseguiram inibir o sistema de comunicação de bactérias pela degradação da C6-HSL por meio de isolados fúngicos da raiz de plantas. A Tabela 4 apresenta os compostos naturais com atividade quorum sensing.

  As atividades antimicrobianas dos fitoquímicos já são bem conhecidas, e esta propriedade pode ser contribuída pela inibição do QS. Sendo assim, necessita-se de uma melhor compreensão do potencial inibidor do QS pelos fitoquímicos, pois por meio deste conhecimento, será possível identificar e desenvolver novos compostos anti-QS e estes serem utilizados na prevenção de infecções e conservação de alimentos FRATIANNI e COPPOLA, 2013; VATTEM et al. 2007).

  Tabela 4: Compostos naturais com atividade quorum sensing.

  C. violaceum CV026 Agrobacterium tumefaciens

  (folhas)

  Chamaesyce hypericifolia

  (aereas)

  Tetrazygia bicolor (folhas) Conocarpus erectus

  (folhas)

  Bucida burceras

  (folhas)

  Callistemon viminalis (folhas,

  inflorescencia)

  C. violaceum ATCC 12472

  NTL4

  folhas, cascas)

  Vaccinium macrocarpon V. angustifolium Rubus idaeus R. eubatus

  Fragaria ssp.

  Vitis spp. Origanum vulgare Rosemarinus officinalis Ocimum basilicum Thymus

  spp.

  Brassica oleracea

  C. violaceum CV026

  C. violaceum

  31532

  P. aeruginosa

  PA01

  C. violaceum ATCC 12427 Acacia nilotica (vagens verdes) C. violaceum ATCC 12472 Quercus virginiana

  Laurus nobilis (frutos, flores,

  Fonte Natural Antagonista Bactérias Inibidas Extrato de plantas

  Areca catechu (sementes) Prunus armeniaca (kernel de

  Melicope lunu-ankenda (folhas) Syzygium aromaticum

  (broto)

  E. coli [pSB401]

  E. coli [pSB1075]

  C. violaceum CV026 P. aeruginosa

  PA01

  P. aeruginosa lecA::lux

  Alho (bulbos)

  P. aeruginosa Vanilla planifolia (feijões) C. violaceum CV026 Tremella fuciformis (inteira) C. violaceum CV026 Panax notoginseng

  (flores e raízes)

  sementes)

  E. coli Proteus mirabilis Serratia marcecens marcescens

  Prunella vulgaris

  (inteira)

  Nelumbo nucifera

  (folhas)

  C. violaceum CV026 P. aeruginosa

  PA01

  Moringa oleifera

  (folhas e frutos) C. violaceum ATCC 12472

  C. violaceum

  CV026

  P. aeruginosa

  E. coli O157:H7 Continua. Continuação

  Lonicera alpigena Castanea sativa Juglans regia Ballota nigra

  R.officinalis Staphylococcus aureus Leopoldia comosa Malva sylvestris

  Cyclamen hederifolium Rosa canina R. ulmifolius

  CV026

  Phellinus igniarius

  C. violaceum Serratia marcecens

  Exudato de pêra (Pisum sativum)

  liquefaciens MG44 Metabólitos

  . faciensMG44

  S Bioativos

  Sulfurano

  P. aeruginosa

  Erucin Malabaricone C P. aeruginosa PA01

  Catquina

  C. violaceum CV026 Fonte: Adaptado de KOH et al. (2013).

2.4. Acerola (Malpighia emarginata)

  A acerola (Malpighia emarginata) é uma fruta que tem se destacado por ser uma grande fonte de vitamina C. Também é conhecida como cereja-das-antilhas, por originar-se nesta região (Norte da América do Sul e América Central) (MACIEL et al. 2010). Além da vitamina C, a acerola contém polifenóis, outro nutriente funcional benéfico para a saúde humana. Como uma fonte de vitamina C e compostos fenólicos, a acerola tem um grande potencial na indústria alimentícia, podendo ser utilizada como suplementos nutricionais ou aditivos para aumentar o valor nutricional de outros produtos (OLIVEIRA et al. 2012).

  

Figura 15:Malpighia emarginata.

  

Fonte: http://pixshark.com/acerola.htm Vários compostos fenólicos foram identificados na acerola até o momento, incluindo compostos antociânicos como a pelargonidina, a malvidina 3,5-diglicosilada e a cianidina 3- glicosilada; compostos não antociânicos, como a quercetina, o kaempferol, além de ácidos fenólicos incluindo p-cumárico, ferúlico, caféico e clorogênico, ácido clorogênico, epigalocatequina, epicatequina, procianidina B1 e rutina (VENDRAMINI e TRUGO, 2004; MEZADRI et al. 2008; HANAMURA, HAGIWARA e KAWAGISHI, 2005). Entretanto, a caracterização fenólica dos frutos varia de acordo com os fatores climáticos, cultivar e estágio de maturação (LIMA et al. 2005).

  Algumas pesquisas como a de Rufino et al. (2010) têm sido realizadas com o intuito de estudar e entender melhor as características dos compostos bioativos da acerola. Nesse trabalho, a quantificação de compostos fenólicos em extrato metanólico, através do ensaio Folin-Ciocalteu, revelou um elevado conteúdo de compostos fenólicos totais (1063 mg AGE/100g fruto seco e 10280 mg AGE/100 g fruto fresco). Este mesmo estudo também demonstrou o potencial antioxidante do extrato metanólico de acerola (Malpighia

  ), pelos métodos DPPH (IC50 670 ± 64,5 g/g de DPPH), ABTS (96,

  emarginata

  6 ± 6,1 μmol Trolox/g) e FRAP (148 ± SO /g) para frutos frescos e para frutos secos (IC50 49,2 16 μmol Fe

  2

  4 ± 2,5g/g de DPPH; 953 ± 34,1 SO /g).

  2

  4

  μmol Trolox/g; e 1996 ± 47±16 μmol Fe Os pesquisadores Delva e Goorich-Schneider, (2013) trabalharam com os extratos bruto e fenólico de acerola em diferentes estágios de amadurecimento e testaram a atividade antioxidante do extrato bruto pelos métodos DPPH e ORAC, onde foram encontraram atividades de 101±0,59 mmol TE/kg de DPPH e 53,0± 0,04 mmol TE/kg, respectivamente.

  Neste estudo, os pesquisadores fracionaram o extrato fenólico de acerola em três grupos: antocianinas, flavonoides e ácidos fenólicos e testaram suas atividades antimicrobianas contra culturas de Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Pseudomonas putida. Nenhuma das três frações fenólicas da fruta madura mostraram atividade contra esses micro-organismos, exceto os flavonoides, que mostraram atividade contra Staphylococcus aureus. Motohashi et al. (2005) também encontrou resultados semelhantes, em extratos etil-acetanóilico e benzênico, sendo que a atividade antimicrobiana foi mais elevada contra Staphylococcus epidermidis e ausência de atividade para Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa.

  Quanto ao potencial inibitório do quorum sensing, não foi encontrado nenhum trabalho relatando seu efeito, nem mesmo com frutos do mesmo gênero.

2.5. Morango Silvestre (Rubus rosaefolius)

  O morango silvestre (Rubus rosaefolius), também conhecido como morango-do-mato, amora vermelha ou amora-do-mato, é uma planta nativa do Himalaia, Ásia Oriental e Austrália, do grupo das framboesas e amoras. É facilmente reconhecida pelos espinhos no caule, pelas flores brancas e por seus frutos arredondados vermelhos e ocos (MAURO et al. 2002; SOUZA, 2000). É comum em regiões altas e frias, principalmente no Sudeste e no Sul do Brasil, nos estados de Minas Gerais, Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul (KINUPP, 2007).

   Figura 16: Rubus rosaefolius.

  

Fonte: http://www.stuartxchange.org/Sagmit.html

  Estudos quantificando e identificando compostos fenólicos do Rubus rosaefolius são raros. Em um estudo realizado por Bowen-Forbes, Zhang e Nair (2010) foram identificadas algumas antocianinas (cianidina-3-glucósido, pelargonidina-3-glucósidoe pelargonidina-3- rutinosídeo), embora a atividade antioxidante in vitro não tenha sido determinada. Embora estudos sobre o conteúdo fenólico, atividade antioxidante e antimicrobiana de morango silvestre sejam escassos na literatura, resultados obtidos para framboesas e amoras pertencentes ao gênero Rubus fornecem um indicativo de seu potencial como fonte promissora de antioxidantes.

  Sariburun et al. (2010) quantificaram compostos fenólicos totais em extratos aquosos e metanólicos de cinco cultivares de framboesa do gênero Rubus pelo ensaio do reagente Folin- Ciocalteu. Foram identificados os principais compostos fenólicos e a atividade antioxidante dos extratos pelos métodos ABTS, DPPH e CUPRAC. Os resultados de compostos fenólicos totais variaram dependendo do tipo de cultivar e do tipo de solvente extrator: 1040,9±15,9 a 1822,0±11,9 mg GAE/100 g para os extratos aquosos e 1787,3±12.5 a 2062,3±4,1 mg AGE/100 g para os extratos metanólicos. Os compostos fenólicos isolados foram cianidina-3- (2G-glicosilrutinosídeo), cianidina-3-soforosídeo, cianidina-3-rutinosídeo, cianidina-3- glicosídeo, pelargonidina-3-rutinosídeo, cianidina, peonidina, malvidina, pelargonidina e delfinidina. Para o método ABTS, os resultados de atividade antioxidante variaram entre 64.36±1,73 e 83.66±1,08

  μmol TE/g para os extratos aquosos e entre 72,92±1,85 e 117.07±0.94

  μmol TE/g para os extratos metanólicos. Para o método DPPH, os resultados variaram entre 64,14±0.98 e 89,13±0,15 μmol TE/g para os extratos aquosos e entre

  81,17±1,50 e 127.59±1,84 μmol TE/g para os extratos metanólicos. Para o outro método,

  CUPRAC, os resultados variaram entre 47.16±0,45 e 63.47±0.39 μmol TE/g para os extratos aquosos e entre 69,54±1,94 e 108,04±2,32

  μmol TE/g para os extratos metanólicos. A capacidade antimicrobiana do fruto do Rubus rosaefolius ainda é pouco estudada, sendo que apenas estudos relacionados a sua fisiologia vegetal foram reportados até o momento. Mauro et al. (2002) avaliaram a capacidade antimicrobiana, das frações aquosas e hidroalcoólicas do seu caule, folhas e raiz de morango silvestre contra E.coli, S. aureus, P.

  

aeruginosa e Candida albicans. A Concentração Inibitória Mínima (MIC) da tintura

  hidroalcoólica das folhas de Rubus rosaefolius variou entre 10 a 20%, e a MIC foi de aproximadamente 20% do extrato aquoso para S. aureus e C. albicans. A fração hidroalcoólica do extrato revelou atividade contra todas as espécies testadas, entretanto a aquosa inibiu o crescimento apenas de S. aureus e C. albicans.

  Quanto ao potencial inibitório do quorum sensing, não foram encontrados trabalhos com o Rubus rosaefolius, porém, um estudo de Quave et al. (2012) com extrato da raiz de

  

Rubus ulmifolius apresentou atividade contra biofime de S. aureus. Outro trabalho realizado

  por Damte et al. (2013) verificou a inibição do pigmento da C. violaceum (CV12472) e da motilidade de P. aeruginosa (PAO1), por extratos da folha e caule de Rubus phoenicolasius.

  Mais estudos relativos a esta fruta devem ser realizados, principalmente quantificando seus compostos fenólicos totais e analisando sua atividade antioxidante, bem como o efeito antimicrobiano e inibição do quorum sensing do fruto, pois com estudos já realizados com outros frutos do mesmo gênero ou de partes não comestíveis da planta apresentaram resultados satisfatórios, o que pode ser um indício que o seu fruto pode apresentar resultados similares, senão até mais surpreendentes.

3. MATERIAL E MÉTODOS

   As análises microbiológicas foram realizadas no laboratório de Microbiologia do

  Departamento de Alimentos da Escola de Nutrição, UFOP. A composição centesimal, quantificação dos compostos fenólicos e atividade antioxidade foram realizadas no laboratório de Bromatologia, UFOP. Já as análises de minerais foram realizadas no laboratório de caracterização molecular também da mesma instituição.

  3.1. Material Vegetal

  As frutas acerola (Malpighia emarginata) e morango silvestre (Rubus rosaefolius) foram colhidas na região de Ouro Preto

  • – MG em época de frutificação. As espécies foram depositadas na forma de exsicata no Herbário Professor José Badini, do Instituto de Ciências Exatas e Biológicas (ICEB), sendo identificadas como: (OUPR), Malpighia emarginata DC, Oliveira, B.D, 28569. Rubus rosaefolius, Oliveira, B.D, 28763.

  3.2. Preparo do Material Vegetal

  As frutas foram higienizadas com uma solução de hipoclorito de sódio a 50 ppm por 15 minutos. Posteriormente, foram removidos folhas, sementes, galhos e cascas e a polpa separada manualmente. A polpa foi homogeneizada em multiprocessador doméstico e posteriormente congelada a -20°C.

  3.3. Composição Centesimal

  As análises da composição centesimal das polpas foram analisas dos os teores de umidade, cinzas, lipídios totais, sólidos solúveis totais, proteínas, carboidratos e fibras. Para determinação de umidade foi utilizado o método baseado na perda de massa por secagem em estufa a 70°C, de acordo com métodos da AOAC, (2003) e do Instituto IAL, (2005). O teor de proteína foi determinado de acordo com o método de Kjeldahl clássico da AOAC, (2003) e

  IAL, (2005). O teor de cinzas foi determinado por incineração em mufla, de acordo com a AOAC, (2003). Os lipídios totais foram determinados pelo método de extração Soxhlet, segundo AOAC, (1995). Para quantificação das fibras alimentares foi utilizado o método enzimático gravimétrico da AOAC, (2005) e IAL, (2005). O teor de carboidratos foi calculado pela diferença percentual da soma dos teores de proteínas, lipídios totais, umidade, cinzas e fibras. Os sólidos solúveis totais foram determinados utilizando-se um Refratômetro de Abbé (Instrutherm® Mod. RTD-95), com escala graduada de Brix, de acordo com IAL, 2005. Todas as análises foram realizadas em triplicata.

  3.4. Obtenção do Extrato Fenólico

  Os compostos fenólicos foram extraídos utilizando extração em fase sólida (SPE), conforme descrito por Bertoldi, (2009), com adaptações para o material vegetal em análise. A polpa descongelada foi homogeneizada com etanol: metanol: acetona 1:1:1 (v/v/v), sendo em seguida filtrada em papel Whatman n° 1. Os solventes foram evaporados em rota-vapor a 40°C (Büchi, Switzerland) e o extrato aquoso foi purificado em minicoluna C18 Sep-Pak Vac

  3

  35cc 10g 20 cm (Waters Corporation, Milford, MA). Compostos fenólicos aderidos ao cartucho foram eluídos com metanol (fração adsorvida), enquanto a fração aquosa não aderida foi descartada. O extrato, já completamente livre do metanol foi adicionado de água destilada até atingir volume conhecido (extrato fenólico). Este extrato fenólico foi utilizado nos ensaios de atividade antioxidante e antimicrobiana.

  3.5. Compostos Fenólicos Totais

  O conteúdo de compostos fenólicos totais foi determinado pelo ensaio do reagente Folin-Ciocalteu com algumas modificações (SHAHIDI e NACZK, 1995). Esta metodologia tem como princípio a redução dos ácidos fosfomolíbdico e fosfotúngstico em solução alcalina.

  A coloração azulada produzida por esta reação é medida em espectrofotômetro.

  Uma alíquota de 100µl do extrato fenólico foi adicionada a 1ml de reagente Folin- Ciocalteu (0,25 N) diluído em água destilada. Depois de 3 minutos de repouso na ausência de luz, foram adicionados 1ml de solução de Na CO (1N), seguido de repouso por 2 horas no

  

2

  3

  escuro. A absorbância foi determinada a 760 nm por espectrofotometria. O ácido gálico foi utilizado para constituir o índice de compostos fenólicos da curva padrão de ácido gálico (0- 200 mg/l). Os resultados foram expressos em ácido gálico equivalente (mg de ácido gálico equivalente (AGE/L).

  3.7. Atividade Antioxidante in vitro (ABTS)

  A capacidade antioxidante doextrato fenólico de cada fruta foi determinada pelo

  + ensaio do cátion radical ABTS , segundo metodologia da Rufino et al. (2007). Em um tubo de ensaio foram adicionados 5 ml da solução aquosa de ABTS (7mM) e mistura permaneceu em repouso entre 12-16h antes da análise, no escuro, para geração do

  + cátion radical cromóforo ABTS . Em seguida, diluiu-se 1ml desta mistura em etanol até obter uma absorbância de 0,70 nm ± 0,05 nm a 734 nm. Um volume de 3ml da solução radical

  + ABTS foi adicionado a 30µl de amostra. A leitura absorbância da mistura foi realizada após 6 minutos. O branco utilizado para zerar o espectrofotômetro foi o etanol. Para padronização dos resultados, o trolox foi utilizado como padrão e os resultados de atividade antioxidante foram expressos em equivalente de Trolox (μM Trolox equivalente por g de polpa).

  Figura 17: Estabilização do

  radical ABTS•+ por um antioxidante e sua formação pelo persulfato de potássio. Fonte: Rufino et al.(2007).

3.7. Atividade Antioxidante in vitro (DPPH)

   A capacidade antioxidante do extrato fenólico de cada fruta foi determinada pelo

  método DPPH de acordo com Brand-Williams, Cuvelier e Berset, (1995). Esse método se baseia na transferência de elétrons de uma substância antioxidante para o radical DPPH (2,2- difenil-1-picril-hidrazil) em solução de metanol. O radical DPPH possui absorbância máxima a 515-517 nm, porém ao sofrer redução por antioxidantes passa a ter um decréscimo da sua absorbância.

  Foram adicionados em tubos de ensaio 100 µl dos extratos e 3,9 ml de solução de DPPH (100mM), dissolvidos em metanol A mistura foi homogeneizada e mantida no escuro em temperatura ambiente durante 30 minutos. Para o branco foi utilizado o DPPH. A absorbância do branco foi aferida imediatamente após a mistura, no tempo zero, e aos 30 minutos.Os resultados de atividade antioxidante foram calculados com base na curva de calibração de trolox e expressos em μmol Trolox equivalente por g de polpa de fruta. No método DPPH o agente antioxidante doa um elétron ou um hidrogênio ao nitrogênio do radical DPPH. Com isso, ocorre uma perda da cor da reação (PRADO, 2009).

  

Figura 18: Reação do Radical DPPH com um antioxidante.

  Fonte: Rufino et al. (2006).

  3.8. Análise de Elementos Traço (Minerais)

  Os terores de potássio, cálcio, ferro, cobre, zinco e cloro foram analisadospor meio da Fluorescência de raios X por Reflexão Total (TXRF). A análise foi realizada no instrumento S2-PICOFOX (Bruker AXS, Berlim, Alemanha) com um ânodo de molibdénio. As configurações de excitação foram 50 kV e 750 mA, e as amostras foram colocadas em discos de quartzo. A análise foi feita através da integração do sinal por mais de 900 segundos. Para a determinação, o sinal de gálio (Kα1 = 9,251 keV) foi quantificado através da utilização de estrôncio (Kα1 = 9,251 keV) como padrão interno ([Sr] = 10,0 mcg / ml). A quantificação foi realizada por meio do software Bruker Spectra (versão 6.1.5.0) e com base na concentração conhecida do padrão interno. O teor de minerais foi expresso em mg/g polpa de fruta.

  3.9. Atividade Antimicrobiana in vitro

  A avaliação da atividade antimicrobiana foi realizada pelo teste de difusão em placas, com o uso de orifícios inoculados com diferentes concentrações do extrato. O efeito bacteriostático e/ou bactericida foi também avaliado por meio do teste concentração mínima inibitória (MIC).

  Os extratos fenólicos foram testados contra as bactérias Gram-negativas Escherichia ATCC10536, Aeromonas hydrophila IOC/FDA110, Pseudomonas aeruginosa

  coli

  ATCC15442, Pseudomonas fluorescense NCTC10038, Salmonella spp, Hafnia alvei ATCC11604, e as bactérias Gram-positivas Staphylococcus aureus ATCC6538P, Listeria monocytogene ATCC7644 e Bacillus cereus ATCC 11778. Todas as bactérias selecionadas são de grande importância na microbiologia de alimentos.

  3.9.1. Difusão em Placas

  A atividade antimicrobiana foi realizada pelo teste de difusão em placas, segundo procedimento descrito por Salawu et al. (2011), com modificações. Um volume de 20 ml de ágar Mueller Hilton na concentração 1,5% foi inoculado com

  5

  10 UFC/ml de cada micro-organismo e vertido em placas de Petri. Após 30 minutos em repouso, foram realizados três orifícios de 5 mm no ágar, com o auxilio da ponteiras de 20µ l previamente estéreis.

  Posteriormente, um volume de 20µl do extrato fenólico, em diferentes concentrações, foi adicionado a cada um dos orifícios. As placas foram mantidas sob refrigeração “overnight” e posteriormente incubadas a 37ºC/24h ou 30ºC/24h, dependendo do micro- organismo.

  A atividade inibitória do extrato foi verificada por meio da formação de halos de inibição presentes nos orifícios, em comparação ao controle que foi feito pela adição do diluente utilizado na preparação do extrato.

  A atividade antimicrobiana foi avaliada pela média e desvio padrão das três repetições.

  3.9.2. Teste da Concentração Inibitória Mínina (MIC)

  O teste MIC foi feito para determinar a quantidade mínima de extrato capaz de inibir o crescimento dos micro-organismos selecionados. O teste foi realizado de acordo com a metodologia utilizada por Wiegand et al. (2008), com algumas modificações. Uma população

  5

  de 10 UFC de cada micro-organismo contidos em 5 microlitros foi adicionada em ágar Mueller Hinton com extrato de cada fruta, em diferentes concentrações. As placas foram encubadas durante 24 horas em estufa à temperatura para o crescimento de cada micro- organismo testado. A partir do crescimento ou não destes micro-organismos foi obtido a concentração inibitória mínima. Os resultados deste teste foram utilizados para os testes da atividade inibitória do quorum sensing, onde todas as concentrações utilizadas foram sub- MIC, pois esta atividade evidencia a inibição da comunicação e não do crescimento bacteriano.

3.10. Determinação da Atividade Anti-Quorum Sensing dos Extratos Fenólicos in vitro

  3.10.1. Estirpes

  As estirpes utilizadas neste trabalho, para avaliar o efeito inibitório dos extratos sobre fenótipos regulados pelo quorum sensing, foram Chromobacterium violaceum ATCC6357,

  Aeromonas hydrophila

  IOC/FDA110-36 e Serratia marcescens. As estirpesforamcultivadas a temperaturas de 28 a 30°C em caldo Luria-Bertani (LB), de acordo com RAVN et al. (2001).

  3.10.2. Inibição do Quorum-Sensing em C. violaceum por difusão em placas

  O teste foi realizado conforme Tan, Yin e Chan (2012, 2013) com modificações. As culturas de C. violaceum ATCC6357 foram crescidas em caldo LB por aproximadamente 18 horas (overnight). Posteriormente, uma alíquota de 1 ml dessa cultura foi inoculada em 20 ml de ágar LB fundido que foi então vertido em placa de petri. O ágar foi deixado em repouso por 30 minutos e posteriormente poços equidistantes de 5 mm de diâmetro foram feitos em cada placa, com o auxílio de ponteira estéril de 1 ml. A cada poço foram adicionados 20µl dos extratos em diferentes concentrações. As placas foram incubadas a 30°C por 24 h. Para controle positivo foi utilizado furanona (10µg/ml-39,4µM - Sigma Aldrich) e negativo foram utilizados água destilada estéril, e o antibiótico Canamicina (100µg/ml - Sigma Aldrich). A atividade de inibição do sistema quorum sensing em C. violaceum foi verificada pela formação de um halo turvo, indicativo de crescimento bacteriano, porém sem pigmentação, em fundo roxo ao redor do poço contendo extrato.

  

3.10.3. Quantificação da Inibição da Produção de Violaceína por C. violaceumpor meio

de espetrofotometria

  O teste foi realizado segundo Tan, Yin e Chan, (2012) e Tan, Yin e Chan, (2013) com modificações. A estirpe C. Violaceum ATCC6357 foi crescida por 18 horas (overnight) a

  8

  30°C e inoculada a uma densidade óptica de 0,1 a 600 nm (aproximadamente 10 UFC/ml) em tubos de ensaio contendo caldo LB previamente adicionados dos extratosde ambas as frutas nas diferentes concentrações, todas elas sub-MIC. Os tubos foram incubados por 24 horas a 28°C em incubadora-shaker, sob agitação a 150 rotações por minuto. Para quantificar a violaceína, uma alíquota de 1 ml de cultura foi retirada de cada tubo, que foi posteriormente centrifugada a 13.000 rpm durante 10 min para precipitar a violaceína. Em seguida, o sobrenadante da cultura foi descartado. O pellet foi solubilizado em 1 ml de Dimetilsulfóxido

  (DMSO), que foi agitado em um agitador tipo vórtex e após esse procedimento foi centrifugado novamente a 13.000 rpm durante 10 min para separar a violaceína de detritos celulares. A pigmentação da violaceína foi verificada pela absorbância 585 nm, medida em espectrofotômetro de microplacas Epoch (BioTek®). O controle negativo foi feito com o caldo LB sem adição dos extratos e o controle positivo para inibição do sistema quorum

  

sensing foi feito com a adição de furanona ((Z-)-4-Bromo-5(bromomethylene-2(5h)-furanone

  • Sigma Aldrich) a uma concentração de 10µg/ml. Paralelamente, foram feitos plaqueame
  • 1

  e contagem de UFC ml em concentração dos extratos testados para comprovar se as mesmas tiveram alguma influência sobre o crescimento microbiano.

  Os testes foram realizados em triplicata e o controle negativo sem adição do extrato, foi considerado como 100% para produção de violaceína. O percentual de inibição da produção de violaceína foi calculado usando a seguinte fórmula:

  % de inibição de violaceína = ((Leitura da absorbância do controle - Leitura da absorbância do teste) / Leitura da absorbância do controle)x100

  

3.10.4. Efeito Anti-Quorum Sensing na Motilidade Tipo Swarming em A. hydrophila e S.

marcescens.

  A motilidade tipo swarming foi avaliada em LB semi-sólido preparado com 0,5% de ágar, conforme descrito por Huber et al. (2003). Alíquotas de 800µl dos extratos, em suas concentrações avaliadas, foram adicionadas a 19,2 ml de ágar LB e vertidos em placas de Petri estéreis. As placas foram deixadas abertas em repouso por 10 minutos e alíquotas de 2µ l de cada micro-organismo, crescido overnight, foram inoculadas em forma de ponto (spot), no centro do ágar. Depois de inoculadas as culturas, as placas fora fechadas e incubadas. Depois do inóculo ter secado, as placas foram incubas em posição normal a temperatura de 30 °C, por 24 horas. Os resultados da motilidade tipo swarming foram observados como uma redução visual comparada ao controle. Como controle negativo, foi realizado o teste com ágar sem adição dos extratos.

  

3.10.5. Determinação da Inibição da Formação de Biofilme in vitro em C. violacem, S.

marcescens e A. hydrophila

  Para a avaliação do efeito dos extratos sobre a formação de biofilmes, alíquotas de

  8

  20 μl (2% da cultura ajustada para DO 0,1 a 600nm) das culturas, contendo cerca de 10

  • 1

  UFC/ml , foram inoculadas em 180 μl de caldo LB em microplacas de poliestireno de 96 poços. Alíquotas previamente determinadas de cada extrato foram adicionadas aos poços para se conseguir diferentes concentrações. O volume final contido em cada poço foi de 200 µl. A incubação foi a temperatura ótima de crescimento de cada micro-organismo por 72 horas. Após esse período, o meio de cultura foi removido, invertendo-se a microplaca sobre papel absorvente. Após a remoção do meio, foi adicionado as microplacas 200

  μl de cristal violeta a 0,1 %, deixando agir por 30 minutos para corar as células aderidas. Em seguida, o corante foi descartado e os poços foram lavados, por três vezes, com 200

  μl de água destilada. As placas foram secas em estufa a 40ºC, por 15 minutos. O cristal violeta retido pelas células aderidas foi dissolvido em 200

  μl de etanol (95 %) e a absorbância medida a 630 nm em leitora de microplacas (CONWAY, 2002). Os testes foram feitos em quadruplicata. Para controle positivo, foi utilizada furanona a 10µg/ml e para controle negativo caldo LB mais bactéria, sem extrato. Com a finalidade de anular qualquer efeito do pigmento do extrato, foi utilizado um outro controle, extrato mais água, nas concentrações analisadas.

3.11. Análise Estatística

  As análises foram feitas em triplicata (composição centesimal, MIC, teste de difusão e quantificação da violaceína por espectrofotometria) e quadruplicata (formação de biofilme), obtendo a média e desvio padrão. A significância dos dados foi obtida pelo teste ANOVA e pelo teste de Tukey, utilizado o software GraphPad Prism versão 6.00 para Windows. Foi considerado paranível de significância p<0,05.

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Caracterização dos Frutos

4.1.1. Composição Centesimal

  

Os dados relativos a composição centesimal da acerola e do morango silvestre estão

apresentados na Tabela 5.

  Tabela 5: Composição centesimal da polpa de morango silvestre e acerola (g/100g polpa).

  Morango Silvestre Acerola

  0,66 ± 0,001 0,94 ± 0,01

  Proteína

  0,02 ± 0,01 0,01 ± 0,01

  Lipídeos

  0,57 ± 0,12 0,13 ± 0,01

  Cinzas

  80,22 ± 0,15 95,63 ± 0,99

  Umidade

  18,53± 0,07* 3,29± 0,49*

  Carboidrato

  4,97 ± 1,08 2,11 ± 0,92

  Fibras Sólidos Solúveis Totais

  10,4 ± 0,5 4,4 ± 0,5

  (ºBrix) Valores expressos como média das triplicatas ± desvio-padrão.

  • Valor obtido por diferença (100%- somatório dos teores de proteínas, lipídios totais, umidade e cinzas).

  Analisando os resultados domorango silvestre, pode-se observar que este apresenta um alto teor de umidade (80,22 ± 0,15), carboidratos (18,53) e sólidos solúveis totais (10,4 ± 0,5) e um baixo teor de proteína (0,66 ± 0,001), cinzas (0,57 ± 0,12) e principalmente lipídeos (0,02 ± 0,01). Essas são característicascomuns às frutas comercialmente mais consumidas, portanto, como maçã, laranja, manga, abacaxi, citros e outros (SILVEIRA et al. 2011),o morango silvestre poderia ser uma opção a mais no mercado.

  Corroborando os parâmetros da composição centesimal do morango silvestre, um trabalho realizado por Hirsch et al. (2012) com três cultivares de Rubus ssp. apresentou teores deproteína, umidade, carboidratos, fibras e sólidos solúveis totais bem próximos ao do presente estudo. Entretanto, o teor de lipídeos foi maior naquele trabalho. Esta diferença pode estar relacionada ao método de análise utilizado, pois Hirsch et al. (2012) utilizaram a metodologia de Bligh e Dyer, (1959) que usa um método de extração a frio e com reagentes com diferentes propriedades ao utilizados pela AOAC, (1995). Outros fatores que também podem ter influenciado nessas diferenças são os fatores como espécie, condições climáticas, maturação e manipulação pós-colheita (MATÍNEZ-BALLESTA et al. 2008) A acerola apresentou parâmetros com teores menores quando comparadas ao morango silvestre, com exceção da proteína e umidade que apresentaram valores de 0,94 ±

  0,01 e 95,63 ± 0,99. Os outros parâmetros, apesar de estarem em menor quantidade, não desvalorizam a acerola como um fruto de interesse comercial, pois esta apresenta outros nutrientes de grande valor comercial a exemplo a vitamina C, que está associada a carotenóides e compostos fenólicos (antocianinas), que a destaca no ramo dos alimentos funcionais (FREITAS et al. 2006).

  Vendamini e Trugo, (2000) avaliaram a composição centesimal da acerola em diferentes estágios de maturação e encontraram teores de proteína e umidade semelhantes ao do presente estudo. Entretanto, o teor de cinzas foi maior e o de sólidos solúveis menor que o do presente estudo, fatores que podem ser atribuídos a diferenças no estágio de maturação dos frutos.

  Apesar da maioria dos parâmetros físico-químicos da acerola e morango silvestre terem apresentado semelhanças com os trabalhos já publicados, é comum encontrar diferenças nos resultados, pois esses parâmetros podem ser influenciados por diferentes fatores, tais como o tempo da colheita, a maturação, a variedade, clima e condições do solo, a exposição ao sol, a localização das frutas na planta e manipulação pós-colheita (AMIRA et al. 2011).

4.1.2. Elementos Traços

  A Tabela 6 mostra os resultados encontrados para os teores de minerais da acerola e morango silvestre.

  

Tabela 6: Resultados da espectroscopia por fluorescência de raios-X com reflexão total da

  acerola e morango silvestre (elementos traço encontrados na acerola e no morango silvestre, em mg/g de polpa de fruta).

  Metais Acerola Morango silvestre

  0,845 0,965

  Potássio (K)

  0,390 0,185

  Cálcio (Ca)

  0,186 0,155

  Ferro (Fe)

  0,012 NE

  Cobre (Cu)

  0,039 0,039

   Zinco (Zn)

  NE 0,563

  Cloro (Cl) NE não encontrado.

  Pode-se observar que o elemento que apresentou maior teor na acerola foi o potássioseguido de cálcio, ferro, zinco e cobre. Para o morango silvestre, o mineral mais presente também foi o potássio. Estes achados são de grande importância nutricional, pois de acordo com as recomendações da Organização Mundial da Saúde (WHO, 2002), a média diária de ingestão para o ferroe zinco para um adulto seriam 45 mg e 11 mg, respectivamente. Assim, a ingestão destes frutos poderia ser de grande contribuição para atingir média diária destes nutrientes.

  Quanto aos outros minerais, suasrecomendações são consideravelmente maiores como para potássio (4,7 g), cálcio (1200 mg), cobre (70 a 1000 µg) e cloro (1500 mg), tornando difícil atingir a meta diária com a ingestão destes frutos, entretanto com o consumo de outros alimentos, estes podem contribuir na meta diária destes minerais. Vale ressaltartambém, que não há um alimento que supra facilmente todas as recomendações para minerais.

  Os elementos minerais são distribuídos de forma grandiosa por toda natureza e exercem importantes funções no organismo humano como: participação em reações enzimáticas, formação óssea, coagulação, cicatrização e transporte de oxigênio. A importância dos minerais na saúde já é fato indiscutível, entretanto pouco se sabe sobre seu teor nos alimentos, suas interações com outros minerais e outros compostos, bem como sua biodisponibilidade. Esta deficiência de informações é considerável mesmo para alimentos básicos ou convencionais (MARTÍNEZ-BALLESTRA et al. 2009; KINUPP e BARROS, 2008), o que ressalta a importância da determinação dos minerais para as frutas em estudo.

  Não foi encontrado na literatura nenhum trabalho que avaliasse os teores de metais pelo (TXRF) para as duas frutas. Entretanto Kinupp e Barros, (2008) avaliaram os macro e micro nutriente pela metodologia de Tedesco e Gianello, (2004) de 69 espécies nativas da região metropolitana de Porto Alegre, dentre elas o Rubus rosaefolius. Eles encontraram para o Ca e K, valores maiores que o do presente trabalho. Para o Fe, o valor ficou abaixo do encontrado no presente trabalho, já osteores de Zn foram muito próximos.

  Quanto a acerola, Brunini et al. (2004) avaliaram os teores de metais dessa fruta de distintas regiões e encontraram os seguintes valores: 0,9 a 2,9 mg/g de Ca; 0,23 a 0,46 mg/g de Fe; 0,009 a 0,029 mg/g de Cu e 0,019 a 0,089 mg/g de Zn; valores que se aproximam aos encontrados no presente trabalho. Quanto ao teor de K, Brunini et al. (2004) encontraram entre 13,9 a 22,9 mg/g, teor acima do encontrado no presente estudo. Assim como o morango silvestre, a acerola é uma boa fonte de ferro. Entretanto, os teores dos outros minerais são muito baixos tornando-se difícil atingir a meta diária, mas o consumo da acerola pode auxiliar Por meio do trabalho de Brunini et al. (2004), é possível confirmar que a regionalidade está intimamente relacionada a composição dos frutos, pois houve uma grande variação nos teores de minerais de um mesmo fruto, de regiões diferentes. Martínez-Ballesta et al. (2009) relataram ainda outros fatores, incluindo propriedades genéticas das espécies, condições climáticas, características do solo e do grau de maturidade da planta no momento da colheita.

  

4.1.3. Quantificação dos Compostos Fenólicos dos Extratos da Acerola e Morango

Silvestre

  O conteúdo de compostos fenólicos encontrado no extrato fenólico da acerola foi de 5848,74 ± 4,18 mg AGE/L e no morango silvestre foi 5902,89 ± 7,42 mg AGE/L. Esse conteúdo equivale a 224,95 mg de AGE por 100 g de polpa fresca para a acerola e 177,26 mg AGE /100g) de polpa fresca para o morango.

  Atualmente, não há uma recomendação diária para compostos fenólicos. Mas estima- se que a disponibilidade nacional (quantidade média ingerida por dia pelos brasileiros) seja 48,3 mg/dia. Tendo em vista que as frutas e hortaliças são as maiores fontes desses compostos, e suas recomendações são em torno de 400g/dia (WHO, 2002) esta disponibilidade é facilmente superada (FALLER e FIALHO, 2009)

  Sousa, Vieira e Lima, (2011) encontraram para acerola o teor de 247,62 mg AGE /100g, valor bem próximo ao deste trabalho, porém Franco et al. (2009) encontraram teores mais elevados de 661,15 mg AGE/100g.

  Estudos quantificando o conteúdo fenólico de frutos do gênero Rubus, mesmo do presente estudo, encontraram valores entre 169,41 mg AGE /100g (ZIELINSKI et al. 2010) a271,7 mg AGE /100g (FERREIRA, ROSSO e MARCADANTE, 2010), também próximos aos encontrados neste estudo.

  Rufino et al. (2010) categorizaram o conteúdo de compostos fenólicos totais de frutas em baixo (<100 mg AGE/100g), médio (100

  • –500 mg AGE/100g) e alto (>500 mg AGE/100g). Como base nesta classificação, a acerola e morango silvestre apresentam um médio conteúdo de compostos fenólicos totais. Entretanto, frutos de uma mesma espécie podem se enquadrar em diferentes categorias, pois o conteúdo de compostos fenólicos pode ser influenciado por diversos fatores tais comoa maturação, espécie, práticas de cultivo, origem geográfica, estágio de crescimento, condições de colheita e processo de armazenamento das frutas (SOARES, 2008). Além de todos esses fatores, o sistema extrator utilizado e o método de extração também podem influenciar no conteúdo fenólico, pois os valores encontrados na literatura, tanto para a acerola quanto para o morango silvestre, são
para extratos brutos e não fenólicos. Este tipo de extração utilizado na literatura pode quantificar compostos que apresentam reação similar aos compostos fenólicos, entretanto não pertencem a esta classe, já que não foram realizadas etapas no processo de extração que removessem compostos não fenólicos com capacidade redutora.

  Até o momento, poucos estudos avaliaram os compostos fenólicos isolados do morango silvestre. Sariburun et al. (2010) encontraram nesta fruta a cianidina-3-(2G- glicosilrutinosídeo), cianidina-3-soforosídeo, cianidina-3-rutinosídeo, cianidina-3-glicosídeo, pelargonidina-3-rutinosídeo, cianidina, peonidina, malvidina, pelargonidina e delfinidina. Já os compostos isolados da acerola foram a pelargonidina, a malvidina 3,5-diglicosilada e a cianidina 3-glicosilada; compostos não antociânicos, como a quercetina, o kaempferol, além de ácidos fenólicos incluindo p-cumárico, ferúlico, caféico e clorogênico, ácido clorogênico, epigalocatequina, epicatequina, procianidina B1 e rutina (MEZADRI et al. 2008; HANAMURA, HAGIWARA e KAWAGISHI, 2005; VENDRAMINI e TRUGO, 2004).

  Diante da escassez de estudos relacionados a quantificação e identificação dos compostos fenólicos das frutas do presente estudo e a procura constante por alimentos com efeitos diferenciados a saúde dos consumidores, seria interessante identificar quais tipos de compostos fenólicos estão presentes nesses extratos, uma vez que estes apresentaram médio teor destes compostos quando comparados a outros estudos, ressaltando que esses extratos não superestimam valores, por serem extratos fenólicos.

4.2. Atividade Antioxidante

  A Tabela 7 apresenta os resultados encontrados para a atividade antioxidante dos extratos fenólicos das polpas de acerola e morango que foram analisadas pelos métodos do cátion-radical ABTS e do radical livre DPPH.

  Tabela 7: Atividade antioxidante pelos ensaios ABTS e DPPH.

ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

  Frutas

   ABTS (µM Trolox/g de fruta) DPPH (µM Trolox/g de fruta)

  Acerola 127,18 ± 6,6 112,02 ± 0,03 Morango 162,40 ± 5,6 120,80 ± 1,5

  Pode-se observar que o morango silvestre apresentou atividade antioxidante maior que a acerola para o método DPPH, 112,02 µM Trolox/g de fruta e 120,80 µM Trolox/g de fruta, morango apresenta um maior conteúdo de compostos fenólicos que a acerola, como mostrado previamente. Segundo Heim, Tagliaferro e Bobilya, (2002) os compostos fenólicos são os maiores agentes antioxidantes dos frutos. Estudos feitos com a acerola utilizando o ensaio DPPH encontraram valoresde 53,2 µM trolox/g de fruta (KUSKOSKI et al. 2006) a 125,66 µM Trolox/gde fruta (MEZADRI et al. 2010). No entanto, não foram encontrados estudos avaliando a capacidade antioxidante do morango silvestre (Rubus

  ). Porém, estudos com demais frutos do gênero Rubus foram encontrados, entre

  rosaefolius

  eles o de Sariburun et al. (2010), os quais avaliaram extrato dos frutos diluídos em diferentes solventes, com valores variando de 64,14 µM Trolox/g de fruta a 153,70 µM Trolox/g de fruta.

  Igualmente ao método DPPH, o morango silvestre também apresentou maior atividade antioxidante pelo ensaio ABTS que a acerola (Tabela 7). Este resultado pode estar relacionado às características do método, pois o ABTS pode aferir melhor os compostos hidrofílicos, lipofílicos e com elevada pigmentação, uma vez que o morango silvestre também apresentou maior atividade para o ABTS que para o DPPH (FLOEGEL et al. 2010). Vale ressaltar que todos os valores da literatura, tanto para o ensaio DPPH e ABTS, foram de extratos dissolvidos em reagentes orgânicos, diferentes do presente estudo que avaliou em extratos fenólicos. Assim, os valores da literatura podem contabilizar ação de compostos não fenolicos. Ou seja, apesar dos valores da literatura estarem semelhantes ao do presente estudo, seus valores reais podem ser inferiores, caso seja computado somente a atividade dos compostos fenólicos. Até o momento não há um consenso sobre qual método é o mais indicado para avaliar a atividade antioxidante, cabendo ao pesquisador fazer esta escolha, levando em consideração as características dos seus compostos em estudo (SUCUPIRA et al. 2012)

  Apesar dos ensaios antioxidantes in vitro apresentarem suas limitações quanto a real atividade antioxidante no corpo humano, pode-se perceber que a acerola e morango silvestre possuem um potencial considerável, podendo ser consumidas na prevenção de doenças crônicas não transmissíveis e radicais livres.

4.3. Atividade Antimicrobiana

  A atividade antimicrobiana foi avaliada pelo método de difusão em placas e pela concentração inibitória mínima. No teste de difusão em placas, o micro-organismo é desafiado contra uma substância biologicamente ativa em meio de cultura sólido e relaciona- da substância em estudo (OSTROSKY et al. 2008). Este teste fornece um resultado qualitativo e quantitativo, podendo ser muito útil na escolha de terapêuticos em situações clinicas (ANVISA, 2008).

4.3.1. Teste de Difusão em Placas

  13,0±0,04 12,0±0,15 10,0±0,05 - -

  11,5±0,10 9,8±0,05 - - -

  B. cereus

  10,5±0,10 10,2±0,05 - - -

  A. hydrophila

  

P. fluorescens 14,2±0,11 11,8±0,05 9,2±0,05 9,2±0,05 7,2±0,05

  13,2±0,15 8,2±0,05 5,5±0,01 - -

  H. alvei

  12,0±0,00 9,0±015 - - -

  L. monocytogenes 11,0±0,04 12,0±0,02 - - - P aeroginosas 13,0±0,16 12,5±0,02 - - - S. aureus

  Na Tabela 8 são mostrados os resultados encontrados para o teste de difusão em placas para o extrato fenólico de morango, em concentrações aleatórias. Observa-se que o extrato fenólico apresentou inibição para todas as bactérias, com destaque para a P.

  fluorescens

  5902,8 2951,4 1475,0 983,8 737,8

  

Bactérias Concentrações (mg AGE/L)

  Neste ensaio não foi encontrado sensibilidade das bactérias para o extrato da acerola. Este fato pode estar relacionado às características do método, que podem não ser compatíveis

  sensibilidade aos extratos, com destaque para o etanólico, tanto da folha quanto do fruto, apresentando halos de 7±0,5 mm a 22±0,5 mm de diâmetro.

  

aeruginosa , S. aureus, B. cereus e C. albicans. Todas as bactérias apresentaram

  Não foram encontrados estudos sobre a atividade antimicrobiana, pelo teste de difusão, para o fruto do morango silvestre (R. rosaefolius). Porém, Zeidan et al. (2013) avaliaram a atividade antimicrobiana de extratos etanólicos e metanólicos da folha e do fruto de Rubus sanguineus, uma espécie relacionada, contra estirpes patogênicas de E. coli, P.

  Medidas dos halos de inibição foram subtraídos do diâmetros dos poços e estão expresssos em mm .

  Tabela 8: Inibição do crescimento bacteriano para extrato fenólico de morango silvestre pelo teste de difusão em placas.

  que foi sensível a todas as concentrações avaliadas. Esta também se destacou quanto ao tamanho do seu halo de inibição, apresentando de 7,2±0,05 mm a 14,2±0,05 mm.

  E. coli 11,0±0,14 11,0±0,02 - - - Salmonella spp. molecular dos compostos. Melendeza e Caprilesa, (2006) avaliaram a atividade antimicrobiana de 172 espécies de plantas, dentre elas a acerola (Malpighia ermaginata) para culturas de S. aureus, E. coli, B. cereus, P. fluorescens,dentre outras etambém não encontrando sensibilidade para essa fruta.

  Alves et al. (2000) avaliando a atividade antimicrobiana de plantas do cerrado, criou uma classificação quanto aos tamanho dos halos encontrados: <9 mm, inativos; 9-12 mm, parcialmente ativa; 13-18 mm, ativa; > 18 mm, muito ativa. De acordo com esta classificação, o morango silvestre apresentou inibição parcialmente ativa a ativa para todas as bactérias. Já o extrato da acerola foi inativo. Portanto, os resultados do presente trabalho indicam que a acerola não apresenta atividade antimicrobiana como avaliada pelo teste de difusão em placas.

4.3.2. Concentração Inibitória Mínima

  Os extratos de plantas são considerados como fonte valiosa de compostos biologicamente ativos que mostram atividade antimicrobiana significativa em vários casos. A determinação da MIC é um aspecto relevante em extratos vegetais, pois há uma preocupação quanto aos aspectos toxicológicos, microbiológicos e legais pertinentes aos compostos naturais ou suas combinações (OSTROSKY et al. 2008).

  Determinar a MIC dos extratos utilizados no presente estudo é de grande relevânciapara os testes de inibição do sistema quorum sensing, pois conhecendo a MIC, pode-se padronizar valores abaixo dela (sub-MIC) para se garantir que os resultados serão devidos a atividade inibitória do sistema quorum sensing e não devido a atividade bactericida ou bacteriostática. A Tabela 9 apresenta as MICs dos extratos para as respectivas bactérias.

  Tabela 9: Concentração Inibitória Mínima (MIC) para extratos fenólicos de morango silvestre e acerola (valores expressos em AGE/L).

  

Morango

Valor em mg silvestre Valor em mg Acerola Bactérias AGE/L para valor em AGE/L para valor em diluição morango diluição do acerola do extrato

extrato

  1475 1:4 1462,18 1:4

  L. monocytogenes

  737,87 1:8 1462,18 1:4

  E. coli S. aureus 421,63 1:14 487,39 1:12

  491,90 1:12 731,00 1:8

  P. aeroginosas Salmonella spp. 737,87 1:8 1462,18 1:4

  491,90 1:14 1462,18 1:4

  A. hydrophila

  491,90 1:14 1462,18 1:4

  B. cereus H.alvei 491,90 1:14 1462,18 1:4

  491,90 1:14 1462,18 1:4

  P. fluorescens

  C. violaceum 491,90 1:14 487,39 1:12

  737,87 8 1:8 974,79 1:6

  S. marcescens

  Analisando os resultados, é possível verificar que todas as bactérias testadas apresentaram sensibilidade para a acerola e o morango. É possível também verificar que o morango obteve os menores valores de MICs, o que é desejável, uma vez que menores concentrações de extrato são necessárias para inibir esses micro-organismos.

  Estudos sobre a MIC do fruto morango silvestre ainda não foram relatados, no entanto Mauro et al. (2002) avaliaram a atividade antimicrobiana do extrato aquoso do caule, raiz e folhas do Rubus rosaefolius, os quais inibiram

  Staphylococcus aureus, P. aeruginosa, E. coli e C. albicans. Azevedo, (2011) avaliando a atividade antimicrobiana de frutos do Rubus fruticosus encontrou sensibilidade de Salmonella enteritidis para os extratos. Quanto ao

  extrato da acerola, Paz et al. (2015) observaram sensibilidade para as bactérias , L. monocytogenes, E. coli e Salmonella spp.

  P. aeruginosa

  Comparando os valores com a literatura pode-se perceber que o extrato do morango silvestre foi mais ativo, pois este apresentou inibição em concentrações bem menores, 0,2 a 0,4 g de fruta/ml de extrato, enquanto na literatura (AZEVEDO, 2011) os valores foram 0,25 g de fruta/ml a 0,70 g de fruta/ml. Já a acerola não foi tão efetiva, apresentando inibição em concentrações maiores, 0,2 g fruta/ml a 0,6 g/ml, e a literatura (PAZ et al. 2015) relatou inibição entre 0,01 g fruta/ml a 0,4g fruta/ml.

  As diferenças referentes à determinação da MIC de extratos de plantas podem ser atribuídas a vários fatores. Alguns deles são as técnicas aplicadas, o micro-organismo utilizado no teste, à origem da planta, a época da coleta, se os extratos foram preparados a partir de plantas frescas ou secas e a quantidade de extrato testada (OSTROSKY et al. 2008). A exemplo destes fatores foi a sensibilidade encontrada pelos micro-organismos aos extratos da acerola pelo teste MIC e a ausência de sensibilidade desses mesmos pelo teste de difusão em placas. Um fator também determinante nos testes antimicrobianos, de forma geral, é o tipo de compostos presentes na planta, pois é muito improvável que uma única molécula ativa seja responsável pela atividade antimicrobiana. Pesquisas mostram que as investigações estão focadas na sinergia entre os compostos (AZEVEDO et al. 2011; FENNEL et al. 2004). Outro fator que pode ter influenciado nestes resultados é a forma como os testes são realiazados, uma vez que para o MIC o extrato é diluído no ágar, com isso o extrato tem um maior contado com a bactéria. Assim, não existe método padronizado para expressar os resultados de testes antimicrobianos de produtos naturais.

  A escolha do antimicrobiano que melhor se adéque ao produto deve ser realizada com cautela, baseando-se na compatibilidade química e sensorial do alimento em estudo, na sua efetividade contra micro-organismos indesejáveis, segurança, viabilidade no mercado, dentre outras características (MACHADO, BORGES e BRUNO 2011).

4.4. Teste de Inibição do Sistema Quorum Sensing

4.4.1. Inibição do Quorum Sensing em C. violaceum (Teste de difusão em placas)

  As Figuras 19 e 20 apresentam os resultados para o teste da inibição do sistema em C. violaceum, utilizando o extrato fenólico do morango silvestre e

  quorum sensing

  acerola, respectivamente. A inibição é percebida quando há a formação de um halo turvo, porém claro ao redor do poço, em um fundo roxo, resultante da inibição da produção do pigmento violaceína.

  Figura 19: Ensaio qualitativo da inibição do quorum sensing em C. violaceum com extrato fenólico do morango silvestre. A esquerda encontra-se a placa com todos os resultados. Placa 1: A-G) Resultados discriminados por poços. A) Canamicina (100 µg/ml)

  • – Controle da inibição do crescimento, B) Controle negativo - Água destilada estéril, C) 5902,8 mg AGE/L, D) 236,11 mg AGE/L, E) 118,05 mg AGE/L, F) 78,70 mg AGE/L e G) 59,02 mg AGE/L de extrato. Placa 2: A-E) Resultados discriminados por poços. A) 5902,8 mg AGE/L, B) 2951,4 mg AGE/L, C) 1475,7 mg AGE/L, D) 983,8 mg AGE/L, E) Controle negativo- Água destilada.

  

Figura 20: Ensaio qualitativo da inibição do quorum sensing em C. violaceum com extrato fenólico

da acerola. A esquerda encontra-se a placa com todos os resultados. A-G) Resultados discriminados

por poços. A) Canamicina (100 µg/ml)

  • – Controle da inibição do cresc crescimento, B) Controle

    negativo - Água destilada estéril, C) 5848,74 mg AGE/L, D) 233,94 mg AGE/L, E) 116,97 mg AGE/L, F) 77,98 mg AGE/L e G) 58,48 mg AGE/L de extrato.

Observando os resultados, é possível perceber que o extrato do morango silvestre foi capaz de inibir a produção do pigmento violaceína na maior concentração avaliada, pois houve formação de um halo turvo ao redor do poço (Figura 19,1D e 2A). Este halo foi percebido até a concentração 1475,7 mg AGE/L (19, 2B).

  Diferentemente, o extrato da acerola (Figura 20) não foi capaz de inibir a produção de violaceína pelo teste de difusão. Apesar do resultado do teste indicar um indício para possíveis interferências no sistema quorum sensing, ele não é um teste definitivo para comprovar essa inibição. Assim, pode ser possível que esta metodologia não seja compatível com as características do extrato da acerola.

  Contrariamente aos extratos, os poços contendo o antibiótico canamicina (Figura 20 e 21) apresentaram um halo translúcido, indicando o efeito inibitório sobre o crescimento bacteriano proveniente do antibiótico.

  Zhu, He e Chu, (2011) avaliaram a inibição da produção de violaceína por compostos naturais obtidos de cogumelos e encontraram halo claro não transparente, indicando que o halo em torno do poço foi causado pela inibição da produção de violaceína e não pela morte bacteriana, como foi visto nos poços contendo antibiótico. Outros compostos de origem natural como alho, cravo, gerânio, lavanda, alecrim e eucalipto também foram testados quanto a sua capacidade inibitória da produção de violaceina, os quais apresentaram resultados eficazes (BODINI et al. 2009; KHAN et al. 2009; SZABÓ et al. 2009).

4.4.2. Quantificação da Inibição da Produção de Violaceína pelos Extratos do Morango Silvestre e Acerola por Espectrofotometria

  O extrato fenólico do morango silvestre, em todas as concentrações testadas, apresentou reduções significativas no percentual de inibição da produção de violaceína,

  • 1

  quando comparado ao após 24 horas controle (p≤0,05) (Figura 21). As contagens de UFC ml de incubação, na presença dos extratos em suas diferentes concentrações ou dos controles, não apresentaram diferença significativa, comprovando que os mesmos tiveram apenas propriedades de inibição do quorum sensing nessas concentrações (Figura 21).

  V iol ac eín a Concentração do extrato mg AGE/L % Inibição de Violaceína Contagem UFC/mL a b c c d b

  10

   I nib ição

  1 %

  L og UF C m l -

  90 100 Controle Furanona 118,60 78,70 59,02 29,51

  80

  70

  60

  50

  40

  30

  20

  10

  

Figura 21: Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de morango

silvestre em diferentes concentrações e avaliação do crescimento microbiano (Log UFC ml-1) após 24

horas de incubação na presença dos extratos. O controle consistiu do meio LB adicionado de 200 µl de

água destilada estéril. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem (p<0,05).

  9

  8

  7

  6

  5

  4

  3

  2

  1

  , após 24 horas de incubação na presença dos extratos em suas diferentes concentrações ou dos controles, não apresentaram diferença estatisticamente significativa, comprovando que os mesmos tiveram apenas propriedades de inibição do quorum sensing.

  O extrato fenólico da acerola, nas concentrações testadas, apresentou reduções significativas no percentual de inibição da produção de violaceína, comparado ao controle (p<0,05) (Figura 22). As contagens de UFC ml

  Os resultados demonstraram que em todas as concentrações do extrato fenólico do morango silvestre houve inibição da produção de violaceína, quando comparadas ao controle, com destaque para a concentração de 118,60 mg AGE/L, a qual inibiu 88,6% da produção, sendo maior que a furanona, a qual inibiu 68,6%. O extrato na concentração de 78,70 mg AGE/L inibiu 68,8%, igualmente a furanona (p>0,05). Já o extrato nas concentrações 59,02 mg AGE/L e 29,51 mg AGE/L, apresentou inibição menor que a da furanona.

  • 1

  100 a 11 a a

  90

  10

  80

  9 na

  70

  8

  60 ac

  1 l - iol

  7

  50 m

   V C

  40

  6 de

  F U ão

  30 b

  5 bc og ib

  20 L c

  4 In

  10 %

  3 Controle Furanona 233,95 116,97 77,98 58,49

  2

  • 10

  Concentração do extrato mg AGE/L

  • 20

  1 % Inibição de Violaceína

  

Figura 22: Percentual de inibição da produção de violaceína pelo extrato fenólico de acerola em

diferentes concentrações, e avaliação do crescimento microbiano (Log UFC ml-1) após 24 horas de

incubação na presença dos extratos. O controle consistiu do meio LB adicionado de 200 µl de água

destilada estéril. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem estatisticamente (p>0,05).

  Os resultados demonstraram que até a concentração 77,98 mg AGE/L houve inibição produção de violaceína, comparada ao controle. As concentrações 233,95 mg AGE/L e 116,97 mg AGE/L inibiram a produção de violaceína com valores próximos ao da furanona. Os resultados evidenciam que ambas as frutas apresentam relevante potencial de inibição do sistema quorum sensing em C. violaceum. A inibição máxima chegou a 88,66%, e extratos diluídos em até 75 vezes, no caso da acerola, e 200 vezes, no caso do morango silvestre, apresentaram atividade inibitória. Novamente, o extrato proveniente do morango silvestre apresentou maior atividade de inibição. Corroborando com os resultados deste trabalho, outros pesquisadores encontraram atividade inibitória do sistema quorum-sensing por compostos naturais em diversas plantas. Chenia, (2013) avaliou a inibição da produção de violaceína por extratos dos frutos kigelia (Kigelia africana) dissolvidos em hexano, diclorometano, acetato de etilo e metanol, encontrando resultados satisfatórios para inibição, a qual chegou a >90%. Olivero-Verbel et al. (2014) estudaram a capacidade inibitória do QS por óleos essenciais extraídos da Lippia planta com propriedades medicinais, a qual apresentou inibição da produção da

  alba,

  violaceína.Vettem et al. (2007) avaliaram o efeito inibitório dos extratos de frutas, ervas e especiarias sobre o QS, dentre as frutas encontra-se a Rubus eubatus e Rubus ideaus, frutos no mesmo gênero que o morango silvestre. Os resultados mostraram inibições de 20% a 60%

  Não foram encontrados na literatura estudos relatando a interferência da acerola (Malpighia emarginata) e morango silvestre (Rubus roasefolius) na inibição da produção de violaceína. De maneira geral, estudos sobre frutos com atividade inibitória do quorum sensing são pouco encontrados. Apesar disso, pesquisadores estão cada vez mais buscando produtos à base de plantas medicinais entre outras, com o intuito de encontrar novos agentes terapêuticos e antipatogênicos que possuam a habilidade de controlar o sistema quorum sensing. É estimado que 10% da flora terrestre apresentem algum tipo de atividade, porém apenas 1% foi validada (AL-HUSSAINI e MAHASNEH, 2009). Um estudo com 10 plantas com reconhecimento medicinal na China mostrou que oito apresentaram atividade inibitória do

  quorum sensing em C. violaceum (KOH e THAM, 2011).

  A acerola, que até então não tinha apresentado resultado positivo para inibição da violaceína pelo método de difusão, torna-se também uma possível opção para o mercado na busca por compostos naturais inibidores do quorum sensing, apesar da sua inibição ter sido menor que a do morango silvestre. Uma possível justificativa para este evento seria o maior contato do extrato com as bactérias, por eles estarem em caldo, não em ágar como no teste anterior (de difusão em placas). Quanto ao morango, suas perspectivas quanto a interferência no sistema quorum sensing foram verificadas em ambos os experimentos.

4.4.3 Efeito dos extratos de Acerola e Morango Silvestre sobre a Motilidade do Tipo

  Swarming em S. marcescens e A. Hydrophila IOC/FDA110-36

  A motilidade tipo swarming foi avaliada em duas estirpes de importância comprovada na área de alimentos, sendo bactérias comumente isoladas de produtos refrigerados (PINTO et al. 2007). Os resultados estão apresentados nas Figuras 23 e 24. Como pode ser observado, o extrato fenólico de acerola não inibiu a motilidade do tipo swarming em S. marcescens, já o extrato fenólico de morango silvestre inibiu este tipo de fenótipo, além detambém inibir a produção de prodigiosina, um pigmento de cor avermelhada também regulado pelo quorum sensing (PACKIAVATHY et al. 2014).

  

Figura 23: Efeito dos extratos sobre a motilidade tipo swarming em S. marcescens. A) Controle S.

marcescens em agar LB, B) Agar LB adicionado de extrato fenólico de acerola na concentração de

233,95 mg AGE/L, C) Agar LB adicionado de extrato fenólico de morango silvestre na concentração

de 236,11 mg AGE/L.

  Na Figura 24 estão apresentados os resultados para motilidade em A. hydrophila

  IOC/FDA110-36. Observa-se que tanto os extratos de acerola quanto de morango foram capazes de inibir a motilidade, sendo essa inibição maior para o extrato fenólico de morango silvestre, o que corrobora resultados anteriores que mostram a maior efetividade do extrato dessa fruta em inibir tanto o crescimento de vários micro-organismos quanto fenótipos regulados pelo quorum sensing.

  

Figura 24: Efeito dos extratos sobre a motilidade tipo swarming em A. hydrophila IOC/FDA110-36.

  

A) Controle A. hydrophila IOC/FDA110-36 em agar LB, B) Agar LB adicionado de extrato fenólico

de acerola concentração de 233,94 mg AGE/L, C) Agar LB adicionado de extrato fenólico de morango

silvestre na concentração de 236,11 mg AGE/L.

  Bakkiyaraj, Sivasankar e Pandian, (2012) avaliaram a inibição da motilidade do tipo

  

swarming para S. marcescens utilizando compostos bioativos extraídos de corais e

  encontraram resultados semelhantes ao do morango silvestre. Houve inibição da motilidade e também incapacidade da S. marcescens em produzir prodigiosina após exposição aos compostos. Packiavathy et al. (2012) avaliaram a atividade inibitória do eugenol, metabólito secundário obtido, por exemplo, do extrato de cominho, na motilidade de Proteus mirabilis,

P. aeruginosa PAO1 e S. marcescens, onde foi observado uma visível inibição da motilidade.

  O sistema quorum sensing regula a motilidade em bactérias pelos AI-1 e AI-2, atuando na integração de sinais celulares e aumento da viscosidade pela produção de biosurfactantes. Na motilidade tipo swarming, as células se movimentam em grupos, de forma paralela ao seu eixo horizontal, aumentando o contato celular e colonização da superfície. Além de outras, S. marcences e A. hydrophila são exemplos de bactérias que apresentam este fenótipo (DANIELS, VANDERLEYDEN e MICHIELS, 2004).

  Neste estudo, os extratos da acerola e morango silvestre foram capazes de inibir a motilidade em A. hydrophila IOC/FDA110-36, em concetrações sub-MIC. Dessa forma, estes extratos podem ter a capacidade de controlar a virulência dependente do quorum sensing, sem inibir a viabilidade celular, desta forma não exercendo pressão seletiva para resistência, como no caso dos antibióticos tradicionais (RASKO e SPERANDIO, 2010). A inibição do quorum pelos extratos pode estar relacionada a semelhança estrutural de algumas moléculas

  sensing

  presentes nos mesmos com as moléculas autoindutoras (PACKIAVATHY et al. 2012; WANG et al. 2006).

  

4.4.4. Efeito dos Extratos Sobre a Formação de Biofilme em A. hidrophila IOC/FDA110-

36, C. violaceum ATCC6357 e S. marcescens

  A Figura 25 apresenta os resultados da ação do extrato fenólico do morango silvestre sobre a formação do biofilme. É possível observar que todas as concentrações do extrato foram capazes de inibir a formação do biofilme para todas as estirpes estudadas, quando comparadas ao controle (p≤0,05), o qual foi normalizado para 100% de formação. Vale ressaltar que a inibição da formação do biofilme em S. marcescens não apresentou diferenças estatísticas en tre as concentrações (p≥0,05)

  

Figura 25: Formação do biofilme na presença do extrato fenólico de morango silvestre. A) A.

hydrophila IOC/FDA110 B) C. violaceum ATCC6357 C) S. marcescens. Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem estatisticamente (p>0,05).

  O efeito do extrato fenólico da acerola em diferentes concentrações, para diferentes estirpes, é apresentado na Figura 26. Assim como o morango silvestre, todas as concentrações do extrato apresentaram inibição da formação do biofilme, para todas as estirpes, quando comparadas ao controle (p<0,05). Entre as concentrações, apenas a concentração 233,96 mg AGE/L e 29,24 mg AGE/L, para A. hydrophila IOC/FDA110, foram diferentes estatisticamente.

  

Figura 26: Formação do biofilme na presença do extrato fenólico de acerola. A) A. hydrophila

IOC/FDA110 B) C. violaceum ATCC6357 C) S. marcescens.

  Médias seguidas pelas mesmas letras não diferem estatisticamente (p>0,05).

  Diante desses resultados, é possível verificar que ambos os extratos de morango silvestre (Rubus rosaefolius) e acerola (Malpighia emarginata) apresentam forte potencial como inibidores da formação de biofilme, por terem apresentado resultados satisfatórios em todas as concentrações avaliadas nesse estudo. Já tem sido bem relatado que as AHLs tem um papel essencial na formação de biofilmes ( LAZAR, 2011; TARVER, 2009; GESKE et al. 2005). Sugere-se que a inibição encontrada neste trabalho seja relacionada a algum tipo de interferência na molécula autoindutora, seja ela pela inibição da sua formação, sua degradação ou bloqueio de sua atividade através da competição pela ligação ao seu receptor (KALIA, 2013). Outro fator que pode ser o responsável pelos resultados apresentados seria a desestabilização da membrana celular, provocada pelos compostos presentes nos extratos que apesar de estarem em concentrações sub-MIC, podem ocasionar não a morte celular, mas pequenos danos que poderão ser refletidos na inibição do QS et al. 2014). Estudos semelhantes também encontraram inibição da formação de biofilme por compostos naturais. Abraham et al. (2011) avaliaram o potencial anti-biofilme do extrato metanólico de Capparis spinosa (alcaparras), onde foi encontrado considerável inibição da biomassa do biofilme para E. coli, P. aeruginosas PAO1, P. mirabilis e S.marcescens. Ponnusamy, Paul e Kweon, (2009) testaram um composto orgânico encontrado na baunilha, a vanilina, contra biofilmes formados por A. hydrophila e encontraram inibição significativa deste biofilme. Outro estudo avaliou a inibição por carvacrol, composto obtido do orégano, em fenótipos dependentes do quorum sensing, dentre eles a formação de biofilme por C.

  

violaceum, S. entérica, sorovar, typhimurium e S. aureus, sendo comprovada a inibição desse

fenótipo et al. 2014).

  O biofilme é uma fina camada de micro-organismos densamente empacotados, encapsuladas dentro de uma matriz aquosa de proteínas, ácidos nucleicos e polissacarídeos, podendo ser encontrado em várioslocais (TARVER, 2009). Biofilmes podem causar infecções crônicas devido a sua tolerância aos antibióticos e produtos químicos usados para desinfecção, tornando motivos de preocupação para hospitais, clinicas e indústrias. Além disso, células em biofilmes são capazes de resistir a fagocitose e outros componentes do sistema de defesa do corpo. O quorum sensing participa na regulação para formação e manutenção dos biofilmes, permitindo que as células tenham maior sobrevivência mesmo em condições desfavoráveis como: alterações de temperatura, dessecação, raios ultravioleta e outros (HOIBY et al. 2010; TARVER, 2009). Já foram encontrados muitos compostos naturais que são capazes de interagir estimulando ou inibindo o quorum sensing (SOLA, 2012; LAZAR, 2011). Entre eles estão o ácido penicilico, patulina, ajoeno do alho e o ácido p-cumárico. Atualmente, as frutas do grupo das berries tem sido os mais novos alvos de estudos na busca por compostos anti-

  

quorum sensing , devido a sua grande concentração de compostos fenólicos (PRIHA et al.

  2014). O morango silvestre (Rubus rosafolius), utilizado nesse estudo, encontra-se neste grupo. Pesquisadores estão buscando para a nova geração de terapêuticos inibidores do biofilme, mecanismos de ação atuando em diferentes níveis. Entre estes mecanismos estãodiminuição da disseminação de AHL e assimdiminuição da sua concentração no meio externo, através do uso de enzimas (lactonases) e inibição da recepção do sinal, utilizando moléculas competidoras que podem ser de origem natural, (LAZAR, 2011) como já foi relatado o uso de algumas. Alguns estudos avaliaram a atividade anti-quorum sensing de compostos fenólicos isolados, e foi verificado para estes compostos, satisfatória atividade inibitória. Dentre eles estão o ácido p-cumárico, naringenina, kaempferol, quercetina, petunidina, malvidina,

  2015;VANDEPUTTE et al. 2010; VIKRAM et al. 2010; BODINI et al. 2009). Outro estudo com um exudato contendo cianidina-3-galactósido, cianidina-3-glucósido, cianidina-3- arabinósido, peonidina-3-galactósido, 3-peonidina-glucoside, peonidina-3-arabinósido e proantocianidinas foi testado contra fenótipos de varias estirpes de Vibrio harveyi, as quais tiveram sua emissão de bioluminescência inibida em até 57% (FELDMAN et al. 2009). A maioria desses compostos é comum aos extratos de morango silvestre e acerola. Assim, pode- se inferir que parte dos resultados contra o sistema quorum sensing poderia ser devida a estes compostos. Portanto, os frutos deste estudo podem ser considerados promissores inibidores da formação de biofilme, apresentando resultados tão bons quanto, senão melhores que os encontrados na literatura. A partir destes resultados, novos estudos devem ser realizados na tentativa de identificar e purificar os compostos que efetivamente apresentem atividade de inibição do sistema, além de estudos que busquem compreender os mecanismos envolvidos na inibição e formas práticas de aplicação desses conhecimentos.

7. CONCLUSÃO

  A partir dos resultados apresentados, pode-se concluir que o extrato fenólico do morango silvestre (Rubus rosaefolius) possui grande potencial bioativo, devido a elevada concentração de compostos fenólicos, com capacidade antioxidante e antimicrobiana. Não menos importante, a acerola (Malpighia ermaginata) também apresenta considerável conteúdo de compostos fenólicos e atividade antioxidante, entretanto sua inibição microbiana foi consideravelmente inferior. Porém, o consumo dessas frutas, bem como de outros alimentos ricos em compostos fenólicos e antioxidantes, é aconselhado, pois estes podem contribuir na redução do risco de doenças não transmissíveis.

  Quanto a capacidade anti-quorum sensing, novamente o extrato fenólico de morango silvestre silvestre se sobressaiu, apresentando inibição do sistema em todos os testes e com resultados mais satisfatórios, quando comparados a acerola.

  Deste modo, torna-se importante investir em estudos sobre frutos nacionais, pois por meio deste trabalho foi possível verificar que frutos nativos também apresentam interessante potencial bioativo, podendo estes serem utilizados nas indústrias alimentícias e farmacêuticas futuramente, na substituição ou como agentes adjuvantes aos atuaisjá empregados.

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