Efeitos da curcumina durante o de ratos submetidos à isquemia cerebra global

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ FACULDADE DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA ELAINE CRISTINA PEREIRA LUCETTI EFEITOS NEUROPROTETORES DA CURCUMINA DURANTE O DESENVOLVIMENTO DE RATOS SUBMETIDOS À ISQUEMIA CEREBRAL GLOBAL FORTALEZA-CE 2015 ELAINE CRISTINA PEREIRA LUCETTI EFEITOS NEUROPROTETORES DA CURCUMINA DURANTE O DESENVOLVIMENTO DE RATOS SUBMETIDOS À ISQUEMIA CEREBRAL GLOBAL Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Farmacologia. Orientador (a):Profª. Dra. Glauce Socorro de Barros Viana FORTALEZA –CE 2015 ELAINE CRISTINA PEREIRA LUCETTI EFEITOS NEUROPROTETORES DA CURCUMINA DURANTE O DESENVOLVIMENTO DE RATOS SUBMETIDOS À ISQUEMIA CEREBRAL GLOBAL Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Farmacologia da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Ceará, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Farmacologia. Aprovada em: / _/ _ BANCA EXAMINADORA Profa. PhD. Glauce Socorro de Barros Viana (Orientadora) Universidade Federal do Ceará –UFC _ Profa. Dra. Iana Bantim Felício Calou Universidade Federal do Piauí –UFPI _ Profa. PhD. Elaine Cristina Gavioli Universidade Federal do Rio Grande do Norte –UFRN _ Prof. Dr. Pedro Braga Neto Universidade Estadual do Ceará -UECE _ Prof. Dr. Iri Sandro Pampolha Lima Universidade Federal do Cariri -UFCA Dedicatória À Deus, que é minha força e fortaleza, e perfeitamente desembaraça o meu caminho. À meu esposo Daniel Luna Lucetti, amor da minha vida ,meu maior incentivador e exemplo. Ao meu filho Bernardo, presente de Deus que alegra meus dias. Aos meus pais, Eurico e Ozana, por todo amor e apoio. Aos meus irmãos, Mônica e Cláudio Henrique, pela torcida. Amo vocês! AGRADECIMENTOS À minha estimada e admirada orientadora, Profª. Dra. Glauce Socorro de Barros Viana, agradeço pela disponibilidade de tempo, paciência, compreensão, atenção, dedicação e amizade, bem como, pelo incrível aprendizado e pela força do seu exemplo. Ao meu esposo Daniel Luna Lucetti. Obrigada por aguentar a minha TPD (tensão prédoutorado).Sem ele eu nem estaria aqui. Aos Professores Iri Sandro Lima, Iana Calou, Elaine Gavioli e Pedro Braga Neto por terem prontamente aceitado participar da minha banca. Às queridas Kelly Rose e Vilani, que mesmo de longe, me deram todo apoio necessário à realização de alguns experimentos e pela amizade sincera. Às Professoras Silvânia Vasconcelos e Nylane Alencar pelas valiosas considerações na Banca de Qualificação, que contribuíram bastante para a finalização deste trabalho. Aos meus alunos de iniciação científica da Estácio/FMJ: Thayga, Viviane, Andrezza, Louise, Odilo, Arthur, Ana Elisa e Rafael. Agradeço pela dedicação, amizade e compromisso na realização da parte experimental. Aos colegas da Neurofarmacologia, Eduardo, Arnaldo, que mesmo estando longe muitas vezes me ajudaram por e-mail ou telefone. Aos técnicos do laboratório de Biofisiologia da Estácio/FMJ: Auri, Janice, Samuel, Fran, Ivna e Xênia pela contribuição no trabalho e amizade. Às amigas Natália Bitu, Monalisa e Ana Luiza pela amizade sincera e apoio nos momentos mais difíceis. À todos da Faculdade de Medicina de Juazeiro do Norte (Estácio-FMJ),pelo apoio e parceria fundamentais para realização desta pesquisa. Aos funcionários do departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC. À todos que de uma forma ou outra contribuíram para a conclusão deste trabalho. Não se apavore, nem desanime, pois o Senhor, o seu Deus, estará com você por onde você andar.”Josué 1:9 RESUMO EFEITOS NEUROPROTETORES DA CURCUMINA DURANTE O DESENVOLVIMENTO DE RATOS SUBMETIDOS À ISQUEMIA CEREBRAL GLOBAL Introdução/objetivos: O acidente vascular cerebral isquêmico precipita uma cascata de eventos que envolvem excitotoxicidade, inflamação, estresse oxidativo e morte celular. A curcumina tem demonstrado efeitos neuroprotetores, com propriedades antioxidantes e antiinflamatórias. Sendo assim, objetivou-se estudar estes efeitos da curcumina em modelo experimental de isquemia cerebral global em ratos em desenvolvimento. Métodos: O tratamento de ratas Wistar foi iniciado 24h após o nascimento dos filhotes, durante 21 dias, com curcumina (25, 50 ou 100 mg/kg/dia, v.o.)ou água+Cremophor 1% 10 ml/kg).No 21º dia de vida os ratos foram anestesiados com Ketamina (75 mg/kg, i.p.)e Xilazina 2% 10 m/kg, i.p.)e submetidos à isquemia cerebral global durante 15 min, reperfusão pelo mesmo tempo, seguida de corte da carótida esquerda. 24 h após iniciou-se o tratamento dos filhotes com curcumina durante 3 ou 7 dias consecutivos. Animais tratados durante 7 dias realizaram os testes comportamentais, campo aberto e labirinto aquático, para avaliar a atividade locomotora e memória espacial, respectivamente. Grupos de animais com 3 ou 7 dias após a isquemia foram eutanasiados e o corpo estriado, córtex e hipocampo foram dissecados. O corpo estriado foi utilizado na preparação de homogenatos para dosagem de monoaminas e metabólitos (DA, DOPAC, NE) em HPLC. Homogenatos de hipocampo e córtex foram preparados para dosar os níveis de nitrito e malondialdeído (MDA).Fatias de hipocampo foram separadas para a coloração com o Fluoro-Jade B e imunohistoquímica (iNOS, COX-2, TNF-Resultados: A isquemia cerebral reduziu a atividade locomotora em ratos e o tratamento com curcumina reverteu este efeito; assim como o que ocorreu com a memória espacial que foi reduzida pela isquemia. A lesão no corpo estriado refletiu em redução nos níveis de monoaminas e estes valores foram aumentados com uso da curcumina 3 e 7 dias após a cirurgia e de maneira dose-dependente no 3º dia. Os níveis de MDA e nitrito foram significativamente aumentados em córtex e hipocampo, 3 e 7 dias após a isquemia cerebral global, quando comparados aos grupos falso operados. O tratamento com curcumina protegeu estas áreas de maneira significativa somente no 3º dia pós-isquemia, nas doses de 50 e 100 mg/kg. No 7º dia, os melhores resultados foram obtidos com a dose de 25 mg/kg. Além disso, houve uma diminuição nas células imunocoradas para iNOS, COX-2 e TNF-nos grupos tratados com curcumina em comparação com o grupo isquemiado. Assim como redução de células Fluoro-Jade B positivas. Conclusão: O tratamento prévio das mães durante o período de lactação bem como o tratamento subcrônico dos filhotes com a curcumina exerceu propriedades neuroprotetoras contra os danos causados pela isquemia cerebral global mais reperfusão. Estes efeitos refletiram na melhora da atividade locomotora e memória. Esta atividade foi observada através de ações antiinflamatórias e antioxidantes da curcumina, principalmente 3 dias após o evento isquêmico. Estas ações foram confirmadas com a inibição da COX-2, iNOS, redução de citocinas pró-inflamatórias, como TNF-Além disso, neurônios foram preservados no hipocampo, o que pôde ser visto através da coloração com Fluoro-jade B, visualizada através de fluorescência verde. Palavras-chave: Curcuma longa, Curcumina, Isquemia Cerebral Global, Neuroproteção, Neuroinflamação. ABSTRACT CURCUMIN NEUROPROTECTIVE EFFECTS DURING THE DEVELOPMENT SUBMITTED TO GLOBAL CEREBRAL ISCHEMIA RAT Introduction/Objectives: The ischemic stroke precipitates a cascade of events that involve excitotoxicity, inflammation, oxidative stress and cell death. Curcumin has demonstrated neuroprotective effects, with antioxidant and antiinflammatory properties. Therefore, we aimed to study these effects of curcumin on experimental model of global cerebral ischemia in rats under development. Methods: Wistar female rats treatment began 24 hours after the birth of pups, during 21 days, with curcumin (25, 50 or 100 mg/kg/day, p.o.)or water +1% Cremophor (10 ml/kg).In 21 day old rats were anesthetized with Ketamine (75 mg/kg, i.p.)and xylazine (10 m/kg, i.p.)and subjected to the global cerebral ischemia for 15 min, reperfusion at the same time, followed the left carotid cut. 24 h after surgery, pups started treating for 3 or 7 consecutive days. The animals treated for 7 days underwent behavioral tests, open field and water maze, to assess the locomotor activity and spatial memory, respectively. Groups of animals with 3 or 7 days after ischemia were sacrificed and the striatum, cortex and hippocampus were dissected. The striatum was used in homogenates preparation to monoamine and metabolites (DA, DOPAC, NS) dosing on HPLC. Homogenates from the hippocampus and cortex were prepared to test the antioxidant activity, 3 and 7 days post-ischemia, to nitrite and malondialdehyde (MDA) dosing. Hippocampal slices were separated for staining with Fluoro-Jade B and immunohistochemistry (iNOS, COX-2, TNF-Results: Cerebral ischemia reduced the locomotor activity in rats and the treatment with curcumin reversed this effect; just like what happened with the special memory that was recovered after curcumin treatment in the three doses used. The striatum lesion reflected in a reduction in the levels of monoamines and these values were increased with the use of curcumin 3 and 7 days after surgery dose-dependent manner on day 3. MDA and nitrite levels were significantly increased in cortex and hippocampus, 3 and 7 days after global cerebral ischemia, when compared to the false-operated groups. The treatment with curcumin significantly protected these areas only at 3 days post-ischemia, in the doses of 50 and 100 mg/kg. On the 7th day, the best results were obtained with the dose of 25 mg/kg. Furthermore, there was a decrease in immunostained cells for iNOS, COX-2 and TNF-in treated groups with curcumin compared with ischemic group. As reduction Fluoro-Jade B positive cells. Conclusion: The previous treatment of the dams during the lactation period and the subchronic treatment of puppies with curcumin exerted neuroprotective properties against damage caused by global cerebral ischemia/reperfusion. These effects reflected improved in locomotor activity and memory. This activity was observed through anti-inflammatory and antioxidant actions of curcumin, especially three days after the ischemic event. These actions were confirmed with inhibition of COX-2, iNOS and TNF-In addition, neurons were preserved in the hippocampus, which could be seen by staining with Fluoro-Jade B, viewed through green fluorescence. Key-words: Curcuma longa, Curcumin, Global Cerebral Ischemia, Neuroprotection Neuroinflammation. LISTA DE FIGURAS Figura 1 -Esquema mostrando as artérias cerebrais médias, a artéria carótida interna e a artéria basilar que formam o polígono de Willis.23 Figura 2 –Estrutura química da curcumina.29 Figura 3 –Potenciais terapêuticos da curcumina.31 Figura 4 -Esquema do protocolo experimental para a avaliação dos efeitos comportamentais, neuroquímicos e imunohistoquímicos da administração de curcumina ou veículo durante 3 ou 7 dias após a isquemia cerebral global.36 Figura 5 -Esquema do protocolo experimental para a avaliação dos efeitos comportamentais, neuroquímicos e imunohistoquímicos da administração de curcumina ou veículo durante 3 ou 7 dias após a isquemia cerebral global.45 Figura 6 -Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg) sobre a atividade locomotora de ratos 7 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global no teste do campo aberto.47 Figura 7 -Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg, vo) sobre a retenção da memória espacial de ratos submetidos à isquemia cerebral global no teste do labirinto aquático.49 Figura 8 -Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg, vo) sobre as concentrações de dopamina em corpo estriado de ratos 3 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global através de HPLC.51 Figura 9 -Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg, vo) sobre as concentrações de DOPAC em corpo estriado de ratos 3 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global através de HPLC.51 Figura 10 -Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg, vo) sobre as concentrações de dopamina em corpo estriado de ratos 7 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global através de HPLC.53 Figura 11 -Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg, vo) sobre as concentrações de DOPAC em corpo estriado de ratos 7 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global através de HPLC.53 Figura 12 -Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg, vo) sobre as concentrações de norepinefrina em corpo estriado de ratos 3 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global através de HPLC.55 Figura 13 -Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg, vo) sobre as concentrações de norepinefrina em corpo estriado de ratos 7 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global através de HPLC.55 Figura 14 -Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg, vo) sobre os níveis de malondialdeído (MDA),utilizado como índice de peroxidação lipídica, no córtex cerebral de ratos 3 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global.58 Figura 15 -Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg, vo) sobre os níveis de malondialdeído (MDA),utilizado como índice de peroxidação lipídica, no córtex cerebral de ratos 7 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global.58 Figura 16 -Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg, vo) sobre os níveis de malondialdeído (MDA),utilizado como índice de peroxidação lipídica, no hipocampo de ratos 3 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global.60 Figura 17 -Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg, vo) sobre os níveis de malondialdeído (MDA),utilizado como índice de peroxidação lipídica, no hipocampo de ratos 7 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global.60 Figura 18 -Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg, vo) sobre a concentração de nitrito no córtex cerebral de ratos 3 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global.63 Figura 19 -Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg, vo) sobre a concentração de nitrito no córtex cerebral de ratos 7 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global.63 Figura 20 -Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg, vo) sobre a concentração de nitrito no hipocampo de ratos 3 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global.65 Figura 21 -Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg, vo) sobre a concentração de nitrito no hipocampo de ratos 7 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global.65 Figura 22 –Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para Fluoro-jade B na área CA1 hipocampal 3 dias após a isquemia em ratos tratados com água +veículo (ISQ),curcumina 50 mg/kg (ISQ+C50) e curcumina 100 mg/kg (ISQ+C100).Escala 200 μm e aumento de 400x.68 Figura 23 –Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para Fluoro-jade B na área CA3 hipocampal 3 dias após a isquemia em ratos tratados com água +veículo (ISQ),curcumina 50 mg/kg (ISQ+C50) e curcumina 100 mg/kg (ISQ+C100).Escala 200 μm e aumento de 400x.68 Figura 24 –Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para Fluoro-jade B na área do giro denteado (GD) hipocampal 3 dias após a isquemia em ratos tratados com água +veículo (ISQ),curcumina 50 mg/kg (ISQ+C50) e curcumina 100 mg/kg (ISQ+C100).Escala 200 μm e aumento de 400x.69 Figura 25 –Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para Fluoro-jade B na área do córtex (CT) 3 dias após a isquemia em ratos tratados com água +veículo (ISQ),curcumina 50 mg/kg (ISQ+C50) e curcumina 100 mg/kg (ISQ+C100).Escala 200 μm e aumento de 400x.69 Figura 26 –Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para Fluoro-jade B na área CA1 hipocampal 7 dias após a isquemia em ratos tratados com água +veículo (ISQ),curcumina 50 mg/kg (ISQ+C50) e curcumina 100 mg/kg (ISQ+C100).Escala 200 μm e aumento de 400x.70 Figura 27 –Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para Fluoro-jade B na área CA3 hipocampal 7 dias após a isquemia em ratos tratados com água +veículo (ISQ),curcumina 50 mg/kg (ISQ+C50) e curcumina 100 mg/kg (ISQ+C100).Escala 200 μm e aumento de 400x.70 Figura 28 –Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para Fluoro-jade B na área do córtex (CT) 7 dias após a isquemia em ratos tratados com água +veículo (ISQ),curcumina 50 mg/kg (ISQ+C50) e curcumina 100 mg/kg (ISQ+C100).Escala 200 μm e aumento de 400x.71 Figura 29 –Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para iNOS na área do giro denteado (GD) hipocampal 3 dias após a isquemia em ratos tratados com água +veículo (ISQ),curcumina 25 mg/kg (ISQ+C25) e curcumina 50 mg/kg (ISQ+C50).Escala 200 μm e aumento de 400x.73 Figura 30 –Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para iNOS na área do córtex (CT) 3 dias após a isquemia em ratos tratados com água +veículo (ISQ),curcumina 25 mg/kg (ISQ+C25) e curcumina 50 mg/kg (ISQ+C50).Escala 200 μm e aumento de 400x.73 Figura 31 –Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para iNOS na área CA1 hipocampal 7 dias após a isquemia em ratos tratados com água +veículo (ISQ) e curcumina 50 mg/kg (ISQ+C50).Escala 200 μm e aumento de 400x.74 Figura 32 –Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para iNOS na área CA3 hipocampal 7 dias após a isquemia em ratos tratados com água +veículo (ISQ) e curcumina 50 mg/kg (ISQ+C50).Escala 200 μm e aumento de 400x.74 Figura 33 –Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para COX-2 na área CA1 hipocampal 3 dias após a isquemia em ratos tratados com água +veículo (ISQ),curcumina 25 mg/kg (ISQ+C25) e curcumina 50 mg/kg (ISQ+C50).Escala 200 μm e aumento de 400x.76 Figura 34 –Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para COX-2 na área CA3 hipocampal 3 dias após a isquemia em ratos tratados com água +veículo (ISQ),curcumina 25 mg/kg (ISQ+C25) e curcumina 50 mg/kg (ISQ+C50).Escala 200 μm e aumento de 400x.76 Figura 35 –Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para COX-2 na área do giro denteado (GD) hipocampal 3 dias após a isquemia em ratos tratados com água +veículo (ISQ),curcumina 25 mg/kg (ISQ+C25) e curcumina 50 mg/kg (ISQ+C50).Escala 200 μm e aumento de 400x.77 Figura 36 –Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para COX-2 na área do córtex (CT) 3 dias após a isquemia em ratos tratados com água +veículo (ISQ),curcumina 25 mg/kg (ISQ+C25) e curcumina 50 mg/kg (ISQ+C50).Escala 200 μm e aumento de 400x.77 Figura 37 –Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para COX-2 na área CA1 hipocampal 7 dias após a isquemia em ratos tratados com água +veículo (ISQ),curcumina 25 mg/kg (ISQ+C25) e curcumina 50 mg/kg (ISQ+C50).Escala 200 μm e aumento de 400x.78 Figura 38 –Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para COX-2 na área do córtex (CT) 7 dias após a isquemia em ratos tratados com água +veículo (ISQ),curcumina 25 mg/kg (ISQ+C25) e curcumina 50 mg/kg (ISQ+C50).Escala 200 μm e aumento de 400x.78 Figura 39 –Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para TNF-α na área CA1 hipocampal 3 dias após a isquemia em ratos tratados com água +veículo (ISQ),curcumina 25 mg/kg (ISQ+C25) e curcumina 50 mg/kg (ISQ+C50).Escala 200 μm e aumento de 400x.80 Figura 40 –Fotomicrografias representativas de neurônios imunorreativos para TNF-α na área do córtex (CT) 3 dias após a isquemia em ratos tratados com água +veículo (ISQ),curcumina 25 mg/kg (ISQ+C25) e curcumina 50 mg/kg (ISQ+C50).Escala 200 μm e aumento de 400x.80 LISTA DE TABELAS Tabela 1 –Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg, vo) sobre a retenção da memória espacial de ratos submetidos à isquemia cerebral global no teste do labirinto aquático. Os valores representam a média ±EPM do tempo para encontrar a plataforma em 54 s. Para análise estatística foi utilizado ANOVA de uma via seguido por Newman Keuls como teste post hoc. Valores significativos com p<0,05. a e b quando comparados ao falso operado (FO) e (ISQ),respectivamente.49 Tabela 2 –Concentração de DA e DOPAC em corpo estriado de ratos 3 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global e a relação entre DOPAC e DA.52 Tabela 3 –Concentração de DOPAC em corpo estriado de ratos 7 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global e a relação entre DOPAC e DA.54 Tabela 4 –Concentração de NE em corpo estriado de ratos 3 e 7 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global.56 Tabela 5 -Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg, vo) sobre os níveis de malondialdeído (MDA),utilizado como índice de peroxidação lipídica, no córtex cerebral de ratos 3 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global.59 Tabela 6 -Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg, vo) sobre os níveis de malondialdeído (MDA),utilizado como índice de peroxidação lipídica, no córtex cerebral de ratos 7 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global.59 Tabela 7 -Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg, vo) sobre os níveis de malondialdeído (MDA),utilizado como índice de peroxidação lipídica, no hipocampo de ratos 3 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global.61 Tabela 8 -Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg, vo) sobre os níveis de malondialdeído (MDA),utilizado como índice de peroxidação lipídica, no hipocampo de ratos 7 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global.61 Tabela 9 -Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg, vo) sobre os níveis de nitrito no córtex cerebral de ratos 3 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global.64 Tabela 10 -Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg, vo) sobre os níveis de nitrito no córtex cerebral de ratos 7 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global.64 Tabela 11 -Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg, vo) sobre os níveis de nitrito no hipocampo de ratos 3 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global.66 Tabela 12 -Efeitos da curcumina (25, 50 e 100mg/kg, vo) sobre os níveis de nitrito no hipocampo de ratos 7 dias após serem submetidos à isquemia cerebral global.66 LISTA DE QUADROS Quadro 1 –Modelos de isquemia cerebral .22 Quadro 2 –Principais materiais e equipamentos.37 LISTA DE ABREVIATURAS 2-OV Oclusão dos 2 vasos 4-OV Oclusão dos 4 vasos ACM Artéria cerebral média AMPA Ácido amino-3-hidroxi-5-metil-isoxasole-propiônico ANOVA Análise de variância ALE Atividade locomotora espontânea AVC Acidente vascular cerebral AVCI Acidente vascular cerebral isquêmico CA Corno Amon CEPA Comissão de Ética em Pesquisa Animal CONCEA Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal COX-2 ciclooxigenase-2 CT Córtex cerebral DA Dopamina DAB Diaminobenzidina DMSO Dimetilsulfóxido DOPAC Ácido 3,4-diidroxifenilacético EPM Erro padrão da média EROs Espécies reativas de oxigênio FO Falso-operado FDA Food and Drug Administration GD Giro denteado GFAP Proteína ácida fibrilar glial HO-1 Hheme oxigenase-1 HPLC High Performance Liquid Chromatography ICG Isquemia cerebral global ICT Isquemia cerebral transitória ISQ Isquemiados IL-1β Interleucina-1 beta LCR Líquido cefalorraquidiano MDA Malondialdeído NE Norepinefrina NEED N-naftil-etilenodiamina NF-kb Fator nuclear kappa b NMDA N-Metil-D-Aspartato NO Óxido nítrico NOS Óxido nítrico sintase iNOS Óxido nítrico sintase induzida Nrf2 Fator de transcrição nuclear 2, relacionado ao eritroide rt-PA Ativador do plasminogênio tissular recombinante SNC Sistema nervoso central TBARS Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico TNF-α Fator de necrose tumoral-alfa SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .20 1.1 DOENÇAS CEREBROVASCULARES E SUA INCIDÊNCIA .20 1.2 MODELOS EXPERIMENTAIS DE ISQUEMIA CEREBRAL .21 1.2.1 Isquemia cerebral global .Erro! Indicador não definido. 1.3 MECANISMOS DE DANO NEURONAL INDUZIDOS POR ISQUEMIA E REPERFUSÃO24 1.3.1 Excitotoxicidade e estresse oxidativo.24 1.3.2 Neuroinflamação .26 1.3.3 Morte neuronal .27 1.4 CURCUMINA .28 1.5 RELEVÂNCIA E JUSTIFICATIVA .33 2 OBJETIVOS .35 2.1 GERAL .35 2.2 ESPECÍFICOS .35 3 METODOLOGIA .36 3.1 ANIMAIS .36 3.2 DROGAS E REAGENTES.36 3.3 MATERIAIS E EQUIPAMENTOS UTILIZADOS .37 3.4 PROTOCOLO EXPERIMENTAL .37 3.4.1 MODELO EXPERIMENTAL DE ISQUEMIA CEREBRAL GLOBAL .39 3.4.2 TESTES COMPORTAMENTAIS .39 3.4.2.1 Teste do campo aberto.39 3.4.2.2 Teste do labirinto aquático .40 3.4.3 AVALIAÇÃO DE NEUROTRANSMISSORES, MARCADORES DO ESTRESSE OXIDATIVO E MEDIADORES INFLAMATÓRIOS .41 3.4.3.1 Dissecção das áreas cerebrais .41 3.4.3.2 Determinação dos níveis de monoaminas e metabólitos através de HPLC .41 3.4.3.3 Determinação da peroxidação lipídica através da dosagem de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) 42 3.4.3.4 Determinação do conteúdo de nitrito .43 3.4.3.5 Avaliação da morte celular através do Fluoro-jade B .43 3.4.3.6 Avaliação da expressão da iNOS, COX-2 e TNF-α. 44 3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA .45 4 RESULTADOS .46 4.1 TESTES COMPORTAMENTAIS .46 4.1.1 EFEITOS DA CURCUMINA SOBRE A ATIVIDADE LOCOMOTORA ATRAVÉS DO TESTE DO CAMPO ABERTO EM RATOS JOVENS 7 DIAS APÓS SEREM SUBMETIDOS À ISQUEMIA CEREBRAL GLOBAL .46 4.1.2 EFEITOS DA CURCUMINA SOBRE O APRENDIZADO E A MEMÓRIA ESPACIAL NO TESTE DO LABIRINTO AQUÁTICO EM RATOS JOVENS 7 DIAS APÓS SEREM SUBMETIDOS À ISQUEMIA CEREBRAL GLOBAL 48 4.2 RESULTADOS: DOSAGEM DE MONOAMINAS ATRAVÉS DE HPLC .50 4.2.1 EFEITOS DA CURCUMINA SOBRE OS NÍVEIS DE DOPAMINA (DA),SEU METABÓLITO ÁCIDO 3,4-DIIDROXIFENILACÉTICO (DOPAC) E NOREPINEFRINA (NE) NO CORPO ESTRIADO DE RATOS JOVENS, 3 E 7 DIAS APÓS SEREM SUBMETIDOS À ISQUEMIA CEREBRAL GLOBAL .50 4.3 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE .57 4.3.1 EFEITOS DA CURCUMINA SOBRE A PEROXIDAÇÃO LIPÍDICA (TBARS) NO CÓRTEX CEREBRAL E HIPOCAMPO DE RATOS JOVENS, 3 E 7 DIAS APÓS SEREM SUBMETIDOS À ISQUEMIA CEREBRAL GLOBAL .57 4.3.2 EFEITOS DA CURCUMINA SOBRE A CONCENTRAÇÃO DE NITRITO NO CÓRTEX CEREBRAL E HIPOCAMPO DE RATOS JOVENS, 3 E 7 DIAS APÓS SEREM SUBMETIDOS À ISQUEMIA CEREBRAL GLOBAL .62 4.4 ANÁLISE HISTOLÓGICA E IMUNOHISTOQUÍMICA .67 4.4.1 EFEITOS DA CURCUMINA SOBRE A INTEGRIDADE NEURONAL DAS REGIÕES HIPOCAMPAIS CA1, CA3 E GIRO DENTEADO (GD);CÓRTEX (CT) TEMPORAL DE RATOS JOVENS SUBMETIDOS À ISQUEMIA CEREBRAL GLOBAL 3 E 7 DIAS APÓS A ISQUEMIA ATRAVÉS DA COLORAÇÃO COM FLUORO-JADE B.67 4.4.2 EFEITOS DA CURCUMINA NA IMUNOMARCAÇÃO PARA A ENZIMA ÓXIDO NÍTRICO SINTASE INDUZIDA (INOS) NAS ÁREAS CA1, CA3 E GD DO HIPOCAMPO, E CT DE RATOS JOVENS SUBMETIDOS À ISQUEMIA CEREBRAL GLOBAL 3 E 7 DIAS APÓS A ISQUEMIA. 72 4.4.3 EFEITOS DA CURCUMINA NA IMUNOMARCAÇÃO PARA ENZIMA CICLOOXIGENASE –2 (COX-2) NAS ÁREAS CA1, CA3 E GD DO HIPOCAMPO E CT DE RATOS JOVENS SUBMETIDOS À ISQUEMIA CEREBRAL GLOBAL 3 E 7 DIAS APÓS A ISQUEMIA .75 4.4.4 EFEITOS DA CURCUMINA NA IMUNOMARCAÇÃO PARA FATOR DE NECROSE TUMORAL ALFA (TNF-Α) NAS ÁREAS CA1 DO HIPOCAMPO E CT DE RATOS JOVENS SUBMETIDOS À ISQUEMIA CEREBRAL GLOBAL 3 DIAS APÓS A ISQUEMIA .79 5 DISCUSSÃO.81 REFERÊNCIAS .96 20 1 INTRODUÇÃO 1.1 Doenças cerebrovasculares e sua incidência A doença cerebrovascular pode ser de origem hipóxica/isquêmica, ocasionada por depleção do suprimento sanguíneo e, consequentemente, da oxigenação do tecido cerebral; ou de origem hemorrágica, ocasionada pelo rompimento de vasos no Sistema Nervoso Central (SNC).Acidente vascular cerebral (AVC) é um termo utilizado quando há sintomatologia aguda, ocasionando déficit neurológico que persiste por pelo menos 24 horas, podendo levar à lesão neuronal aguda que culmina normalmente em morte celular (COTRAN, 2010).O AVC do tipo isquêmico representa cerca de 80% de todos os casos registrados no mundo, sendo caracterizado pela oclusão das principais artérias que levam sangue ao encéfalo, as artérias carótidas e artérias vertebrais, devido a um trombo ou êmbolo, sendo sua mortalidade menor (15 a 20%)quando comparado ao AVC hemorrágico (BROUNS; DE DEYN, 2009).Em escala mundial, é a segunda principal causa de morte e primeira causa de incapacidade e ainda uma das principais causas de internações, causando na grande maioria dos pacientes algum tipo de deficiência, seja parcial ou completa. É um quadro que ocorre predominantemente em adultos de 55 a 65 anos, sendo o pico de incidência na faixa de 70 a 80 anos de idade, mas também pode acometer pessoas com idade inferior a 55 e 45 anos, correspondendo respectivamente a 10 e 4% dos casos (PONTES et al.,2008; WHO, 2012; ZÉTOLA et al.,2001).O AVC perinatal é definido como evento cerebrovascular que ocorre entre 28 semanas de gestação até 28 dias de vida pós-natal. Já o AVC na infância é considerado aquele que ocorre entre 30 dias de vida e 18 anos de idade, sendo o tipo isquêmico o mais comum também nesta faixa etária. Estudos epidemiológicos apontam os lactentes com um índice mais alto de mortalidade (LYNCH et al.,2002; NELSON et al.,2004).Pesquisadores têm avaliado as taxas de mortalidade por AVC no Brasil e observaram que, entre os anos de 2000 e 2009, houve uma tendência de queda em todas as faixas etárias estudadas com valores semelhantes aos países em desenvolvimento. Apesar deste resultado, os valores continuam elevados se comparados com os demais países da América Latina. A incidência de AVC está relacionada aos fatores de risco como a hipertensão arterial, diabetes, 21 obesidade, fumo, entre outros, enquanto a letalidade avalia a eficácia do tratamento instituído. O controle dos fatores de risco, a prevenção primária e secundária das doenças circulatórias e a melhoria das condições socioeconômicas da população podem levar a uma queda da mortalidade (GARRITANO et al.,2012).Em estudo realizado por DE PAULO et al. 2009) foram investigados 191 doentes com diagnóstico de acidente vascular cerebral isquêmico (AVCI) internados na Enfermaria de Neurologia do Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo. Destes, 59 (30,9%)tinham idade inferior a 45 anos, e o principal território arterial acometido foi o carotídeo, presente em 40 (67,8%)pacientes, demonstrando tendência a aumento de incidência de AVC em pacientes mais jovens. Os sintomas neurológicos que acometem o paciente após o AVC podem refletir a localização e a extensão da lesão, porém não diferem claramente quanto ao tipo de acidente vascular. Os déficits apresentados incluem deficiência nas funções motoras, sensitivas, mentais, perceptivas e da linguagem e dependem da disponibilidade de fluxo colateral (LEITE et al, 2009).Diante destes fatos, a fisiopatologia desta condição tem sido bastante estudada em animais através de modelos experimentais já estabelecidos. 1.2 Modelos experimentais de isquemia cerebral O pesquisador SEYMOUR LEVINE (1960) foi o primeiro a propor um modelo de isquemia cerebral através da combinação de hipóxia e oclusão unilateral da artéria carótida. Daí por diante muitos modelos tem sido estabelecidos para o estudo dos eventos isquêmicos acompanhados ou não de reperfusão. A isquemia cerebral global e a isquemia cerebral focal representam os dois principais tipos de lesão isquêmica aguda. Sendo a primeira um quadro de localização generalizada, como a que ocorre na parada cardíaca, choque e hipotensão severa. E a segunda situação representa uma privação de oxigênio localizada devido oclusão arterial trombótica, como no caso de aterosclerose ou oclusão secundária às lesões arterioscleróticas encontradas na hipertensão (COTRAN et al.,2010).Os pesquisadores VANNUCCI; VANNUCCI (1997) desenvolveram um modelo experimental de dano cerebral hipóxico/isquêmico em ratos recém-nascidos. Animais com 7 dias de vida foram submetidos à isquemia através da ligação unilateral da artéria carótida 22 comum seguida de hipóxia sistêmica produzida pela inalação de oxigênio 8%.Este modelo tem sido amplamente utilizado como modelo de dano isquêmico perinatal. O Quadro 1 traz os principais modelos de isquemia cerebral de acordo com a localização. Pode tratar-se de um evento com reperfusão (transitório) ou sem reperfusão (permanente) BRAEUNINGER; KLEINSCHNITZ, 2009).Quadro 1 –Modelos de isquemia cerebral Isquemia Etiologia Cerebral Modelos reperfusão Intravascular Global Permanente ou com Transitória ou permanente Extravascular Transitória ou permanente Parada cardíaca Ligação das principais artérias irrigadoras do cérebro carótidas e vertebrais).Intravascular Focal Transitória ou permanente Oclusão da artéria cerebral média Extravascular Transitória ou permanente Oclusão cirúrgica da artéria cerebral média Multifocal Intravascular Transitória ou permanente Embolização com coágulos de sangue ou microesferas Fonte: Adaptado de Braeuniner e Kleinschnitz (2009).O encéfalo é vascularizado através de dois sistemas: vértebro-basilar (artérias vertebrais) e carotídeo (artérias carótidas internas).Estas são artérias especializadas pela irrigação do encéfalo. Na base do crânio, estas artérias formam um polígono anastomótico, o Polígono de Willis (Figura 1),de onde saem as principais artérias para vascularização cerebral. 23 Figura 1 -Esquema mostrando as artérias cerebrais médias, a artéria carótida interna e a artéria basilar que formam o polígono de Willis. Fonte: NETTER, 2000. 1.2.1 Isquemia cerebral global As consequências clínicas deste evento hipóxico/isquêmico dependem da extensão da privação de oxigênio. Podendo haver desde apenas uma alteração aguda e transitória da consciência, sem lesão tecidual irreversível, até morte neuronal generalizada, podendo o paciente permanecer em coma profundo. As células piramidais da área CA1 do hipocampo, as células de Purkinje do cerebelo e os neurônios piramidais no neocórtex são as células mais atingidas após isquemia global de curta duração, 12 a 24 h após o insulto. Alterações que ocorrem 24 h até duas semanas após a isquemia, alterações subagudas, incluem necrose tecidual, presença de macrófagos e aumento das células gliais. Neurônios da região CA1 hipocampal são os mais sensíveis à despolarização da membrana induzida pela isquemia com 24 duração de 3 a 5 min, enquanto que os neurônios estriatais são mais resistentes, resistindo até 15 a 20 min (FONNUM, 1984; KOEHLER; ELEFF; TRAYSTMAN, 1996).Os três modelos de isquemia global mais utilizados são: oclusão dos 4 vasos (4-OV) e oclusão dos 2 vasos (2-OV) combinados com hipotensão nos ratos, e a oclusão dos 2 vasos em esquilos da Mongólia. Segue abaixo as diferenças entre eles: 1) Oclusão dos 4 vasos (4-OV) em ratos. É obtida através da coagulação permanente das artérias vertebrais e a ligação temporária de ambas as artérias carótidas, que reduz o fluxo de forma eficaz (PULSINELLI; BRIERLY, 1979; PULSINELLI; BUCHAN, 1988).2) Oclusão dos 2 vasos (2-OV) em ratos. Ocorre somente a ligação de ambas as artérias carótidas, acompanhada da redução da pressão sanguínea em torno 50 mmHg, e tem efeitos levemente mais profundos que a 4-OV (SMITH et al.,1984a).3) Oclusão dos 2 vasos (2-OV) em esquilos da Mongólia. Também é induzida pelo ligamento temporário das artérias carótidas, sem redução da pressão sanguínea, porque não existem artérias de comunicação posterior nestes animais, produzindo uma profunda isquemia cerebral (KIRINO et al.,1985).O modelo utilizado neste trabalho foi o da oclusão bilateral das artérias carótidas comuns durante 15 min acompanhada de reperfusão por um período de 15 min e corte da carótida esquerda, sendo uma modificação do modelo proposto por ULRICH et al.,1998).O quadro isquêmico gerado neste modelo leva a dano neuronal e afeta principalmente as regiões do hipocampo, córtex e estriado, levando a alterações comportamentais como impedimento da atividade locomotora e memória espacial prejudicada, além de alterações histológicas e estresse oxidativo (SINGH; CHOPRA, 2013).1.3 Mecanismos de dano neuronal induzidos por isquemia e reperfusão 1.3.1 Excitotoxicidade e estresse oxidativo Em situações em que as reservas de energia encontram-se diminuídas, como o caso da isquemia cerebral global, a elevação dos níveis de glutamato no compartimento extracelular 25 após despolarização da membrana juntamente com sua captação prejudicada, resulta em aumento nas concentrações de cálcio intracelular. Este evento seria o ponto de partida para uma série de processos intracelulares complexos, resultante da ativação de enzimas catabólicas, tais como as fosfolipases (que conduzem ao rompimento da membrana celular, clivagem do ácido araquidônico e formação de radicais livres) e endonucleases (que conduzem à fragmentação do DNA genômico e disfunção mitocondrial) VANNUCCI; HAGBERG, 2004).Várias linhas de evidências levam a acreditar que a liberação de catecolaminas podem explicar a vulnerabilidade seletiva de neurônios estriatais após evento isquêmico (WEINBERGER; COHEN; NIEVES-ROSA, 1983; WEINBERGER; NIEVES-ROSA; COHEN,1985).Apesar de que os mecanismos de um possível dano neuronal mediado pela dopamina não estejam bem claros, subprodutos do seu metabolismo, como peróxido de hidrogênio, íon superóxido e radicais de hidrogênio tem sido apontados como as causas para estes danos (KAHN et al.,1995).O estresse oxidativo, que se desenvolve após a isquemia/reperfusão, causa desequilíbrio entre os mecanismos antioxidantes endógenos e as espécies reativas de oxigênio (EROs).O início destes eventos provavelmente é a causa da progressão do dano neuronal semelhante a seus efeitos em outros tecidos (GLANTZOUNIS et al.,2001).O óxido nítrico (NO) é um radical livre na forma de um gás sintetizado a partir do aminoácido L-arginina pela enzima NO sintase e está presente em diversos tecidos (endotélio vascular, neurônios, glia, macrófagos, leucócitos).No cérebro exerce diversas funções como a regulação da circulação sanguínea cerebral, neurotransmissão e modificação da inflamação. Está presente em quase todo o cérebro, incluindo córtex, hipocampo e estriado (DAWSON; DAWSON; SNYDER, 1992; DAWSON; DAWSON, 1995).O NO exerce efeitos benéficos (potente vasodilatador) e citotóxicos (inibindo sistemas enzimáticos mitocondriais) no cérebro isquêmico. A atividade do NO aumenta devido estimulação de receptores glutamatérgicos NMetil-D-Aspartato (NMDA) e Ácido amino-3-hidroxi-5-metil-isoxasole-propiônico (AMPA),culminando com a elevação do Ca2+ intracelular, enquanto que níveis elevados de NO estão presentes na micróglia e outras células inflamatórias 24 h depois da isquemia (SAMDANI; DAWSON; DAWSON, 1997).O malondialdeído (MDA),que tanto é indicador como efetor do estresse oxidativo, é formado a partir da quebra de radicais lipídicos e também oxida moléculas protéicas. A 26 prevenção dos danos causados pela isquemia e reperfusão, especialmente em estruturas neurais, depende de um complexo ciclo de formação de radicais livres de oxigênio, sequestro de neutrófilos, enzima lisossomal e ativação do complemento e dano celular endotelial (WINTERBOURN; KETTLE, 1988).Este processo também causa aumento nos níveis de produtos de peroxidação lipídica em membranas celulares (BUEGE; AUST, 1978).Em estudo recente realizado após submeter ratos à isquemia global por oclusão bilateral das artérias carótidas, os pesquisadores observaram aumento dos níveis de MDA principalmente no hipocampo, causando portanto dano oxidativo (COSAR et al.,2014).1.3.2 Neuroinflamação O hipocampo é uma região do lobo temporal responsável por alguns aspectos da neurobiologia da memória. Possui muitas funções como aquelas relacionadas ao aprendizado, memória, cognição e comunicação (LENT, 2004).Como já mencionado anteriormente, esta área cerebral é especificamente vulnerável ao dano causado pela isquemia e reperfusão. Na fase subaguda, entre poucas horas a alguns dias após a isquemia, uma resposta neuroinflamatória e apoptótica se desenvolve como resultado de influências estimulatórias da fase aguda, como a elevada concentração intracelular de cálcio levando a uma superativação de vários sistemas enzimáticos proteolíticos (CEULEMANS, 2010).Já é sabido que fatores inflamatórios são liberados nas células endoteliais cerebrais nos estágios iniciais da isquemia, o que causa aderência e migração de leucócitos nas células endoteliais cerebrais, e estas células contribuem para as modificações estruturais das proteínas de junção impermeáveis, que consequentemente induz edema vasogênico (COISNE; ENGELHARDT, 2011).A inflamação ativa a isoforma da enzima Óxido Nítrico Sintase induzível (iNOS) que é neurotóxica. A isquemia global resulta na expr hemic Stroke. Part One: Modeling Risk Factors. Open Neurol. J.,v. 4, p. 26-33, 2010. 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