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1 Universidade de São Paulo Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” Análise transcriptômica de plantas de cana de açúcar inoculadas com Leifsonia xyli subsp. xyli, agente causal do raquitismo das soqueiras Mariana Cicarelli Cia Tese apresentada para obtenção do título de Doutora em Ciências. Área de concentração: Genética e Melhoramento de Plantas Piracicaba 2014 2 Mariana Cicarelli Cia Engenheira Agronôma Análise transcriptômica de plantas de cana-de-açúcar inoculadas com Leifsonia xyli subsp. xyli, agente causal do raquitismo das soqueiras Orientador: Prof. Dr. LUIS EDUARDO ARANHA CAMARGO Tese apresentada para obtenção do título de Doutora em Ciências. Área de concentração: Genética e Melhoramento de Plantas Piracicaba 2014 Dados Internacionais de Catalogação na Publicação DIVISÃO DE BIBLIOTECA - DIBD/ESALQ/USP Cia, Mariana Cicarelli Análise transcriptômica de plantas de cana de açúcar inoculadas com Leifsonia xyli subsp. xyli, agente causal do raquitismo das soqueiras / Mariana Cicarelli Cia. - - Piracicaba, 2014. 105 p.: il. Tese (Doutorado) - - Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, 2014. 1. Cana-de-açúcar 2. Leifsonia xyli subsp. xyli 3. Microarranjo 4. Expressão gênica I. Título CDD 633.61 C565a “Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor” 3 À minha família por todo o apoio, incentivo e amor DEDICO 4 5 AGRADECIMENTOS À Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, ESALQ/USP, onde me tornei Engenheira agrônoma e cursei o mestrado e doutorado, pela inestimável oportunidade. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo suporte financeiro. Ao professor Dr. Luis Eduardo Aranha Camargo pela orientação, paciência, ensinamentos, conversas, apoio e especialmente pela confiança no meu trabalho. Aos professores Ricardo Antunes de Azevedo, Daniel Scherer de Moura e a pesquisadora Dra Carolina Vianna Morgante por terem contribuído como grandes incentivadores da minha carreira científica. À professora Dra Claudia Barros Monteiro-Vitorello pelo incentivo e auxílio durante o desenvolvimento do meu projeto de doutorado. Aos professores do departamento de Genética e Melhoramento de Plantas pelos ensinamentos. À Carolina Lembke e Milton Y. Nishiyama Junior pela colaboração nas hibridizações e análises de bioinformática. À Silvio Cristofoletti e Felipe Sabadin por cederem o material vegetal utilizado no experimento. À todos os funcionários dos departamentos de Genética e Fitopatologia pelo o auxílio no desenvolvimento deste trabalho. À Raphael Severo pela colaboração em todas as etapas deste trabalho. Muito obrigada pela sua amizade, disponibilidade em me ajudar, paciência nos momentos de nervosismo e pelas boas risadas. À Giselle de Carvalho, Fernanda Moretti e Suzane Saito por terem me auxiliado no cultivo in vitro de Lxx. Aos amigos do Laboratório de Genética Molecular (LGM), Fernanda Moretti, Maisa Curtolo, Raphael Severo, Jerônimo Vieira, Giselle de Carvalho, Thais Egreja, Débora Wassano, Aline Zavaglia, Thayne Munhoz, Leandro Dallagnol, Líllian Bibiano e Rafael Popin pela amizade, boa convivência e ajuda na montagem dos vários experimentos. Torcerei sempre pelo sucesso de todos vocês. Aos meus queridos amigos Victor A. Forti, Luciane Santini, Cristiane Carvalho, Silvio Cristofoletti, Renato Lima, Thalita da Silva e Eduardo Picelli. Guardo com carinho todos os momentos que passamos juntos. À minha irmã Sandra, meu cunhado Vlademir e meu sobrinho Guilherme pela ajuda no cultivo e avaliação das plantas, inclusive nos feriados. 6 À minha família por estar sempre ao meu lado e acreditar em mim. 7 SUMÁRIO RESUMO . 9 ABSTRACT . 11 1 INTRODUÇÃO . 13 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA . 15 2.1 Leifsonia xyli subsp. xyli. 15 2.2 O raquitismo das soqueiras . 16 2.3 Interação planta patógeno . 18 2.4 Uso de tecnologias de análise de expressão gênica em larga escala no estudo da interação planta-patógeno . 20 3 MATERIAL E MÉTODOS . 23 3.1 Análises de expressão gênica por hibridização em lâminas de microarranjos . 23 3.1.1 Material vegetal . 23 3.1.2 Hibridização de microarranjos e análise de dados. 24 3.2 Análises de validação . 26 3.2.1 Seleção de genes para validação e desenho de primers. 26 3.2.2 Análise de expressão por qPCR. 27 3.2.3 Experimento de validação I . 29 3.2.4 Experimento de validação II . 29 4 RESULTADOS . 33 4.1 Análise de expressão gênica com base em hibridização em lâminas de microarranjos . 33 4.1.1 Extração de RNA do cartucho foliar da cana-de-açúcar . 33 4.1.2 Genes diferencialmente expressos entre plantas inoculadas e não inoculadas com Lxx 33 4.1.3 Classificação funcional e agrupamento dos genes diferencialmente expressos . 34 4.1.4 Seleção dos genes para validação e teste de especificidade dos primers . 36 4.1.5 Estabilidade dos genes normalizadores . 46 4.2 Experimentos de validação dos resultados do microarranjo . 46 4.2.1 Ensaio I de validação . 46 4.2.2 Ensaio de validação II . 49 5 DISCUSSÃO . 53 5.1 Relação Lxx versus cana-de-açúcar . 53 5.2 Processos e via afetados em função do aumento no título de Lxx . 54 5.2.1 Ciclo celular e metabolismo do DNA. 54 8 5.2.2 Metabolismo de hormônios . 57 5.2.3 Transdução de sinal . 58 5.2.4 Regulação da transcrição . 60 5.2.5 Defesa. 62 5.2.6 Adaptação ao hospedeiro . 66 5.3 Validação dos dados. 66 5.4 Proteômica x transcriptômica. 67 5.5 Considerações finais . 68 6 CONCLUSÕES . 73 REFERÊNCIAS . 75 ANEXOS . 94 9 RESUMO Análise transcriptômica de plantas de cana de açúcar inoculadas com Leifsonia xyli subsp. xyli, agente causal do raquitismo das soqueiras O raquitismo das soqueiras, causado pela bactéria endofítica Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx), já foi identificado em praticamente todas as regiões produtoras de cana-de-açúcar no mundo causando sérias perdas na produção. A doença é caracterizada por reduzir o crescimento da planta, resultando no afinamento dos colmos e encurtamento dos internódios. A intensidade destes sintomas está positivamente correlacionada ao título de Lxx nas plantas. Diante disto, o objetivo deste estudo foi investigar diferenças na expressão gênica em plantas da variedade SP80-3280 em resposta à variação na quantidade de bactéria em seus tecidos. As plantas, infectadas com Lxx, foram cultivadas em casa de vegetação e inoculadas ou não com Lxx. Em plantas inoculadas, a população bacteriana média foi de 27,3 e 264 células de Lxx / 100 ng de DNA aos 30 e 60 dias após a inoculação, respectivamente, ao passo que em plantas não inoculadas, os níveis foram significativamente menores, de 6,8 e 34,5 células de Lxx / 100 ng de DNA. Os níveis de expressão gênica foram comparados entre plantas inoculadas e não inoculadas, em cada tempo de avaliação, por meio de hibridização de cDNA sintetizado a partir de RNAm extraído do cartucho foliar em lâminas de microarranjo. Ao todo foram identificados 272 genes diferencialmente expressos em plantas inoculadas com maior título bacteriano em relação às não inoculadas, com menor título, sendo 106 e 152 diferencialmente expressos unicamente aos 30 e 60 DAI, respectivamente. Destes, 55 genes foram selecionados para validação por qPCR, com ênfase nos genes pertencentes às categorias de ciclo celular, metabolismo de DNA e hormônios, trandução de sinal e regulação da transcrição já que estes processos estão diretamente implicados no crescimento vegetal. Dos genes diferencialmente expressos aos 30 DAI, 17 (60,7%) foram validados, compreendendo 11 genes com menor expressão envolvidos no controle do ciclo celular e metabolismo de DNA como ciclinas, kinase dependente de ciclina (CDKB1;1), minichromosome maintenance proteins (MCM) e histona H4. Aos 60 DAI, 17 (53%) foram validados e englobaram genes com maior expressão relacionados a síntese de hormônios, fatores de transcrição e defesa como ACC oxidase, fator de transcrição contendo o domínio WRKY e fenilalanina amônia liase, além da repressão de genes MCM. Os padrões de expressão gênica são consistentes com os sintomas clássicos da doença e indicam que o aumento no título de Lxx altera o balanço hormonal e reduz o crescimento da planta ao reprimir a divisão celular. Palavras-chave: Cana-de-açúcar; Leifsonia xyli subsp. xyli; Microarranjo; Expressão gênica 10 11 ABSTRACT Transcriptomic analysis of sugarcane plants inoculated with Leifsonia xyli subsp. xyli, causal agent of ratoon stunting disease Ratoon stunting disease (RSD), caused by endophytic bacterium Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) has been identified in all sugarcane producing regions worldwide causing serious yield losses. The disease reduces the plant growth, resulting in thinner stalks and shorter internodes. The intensity of these symptoms correlates positively with levels of Lxx titers in the plant. In view of this, the objective of this study was to investigate differences in gene expression in plants of the variety SP80-3280 in response to the variation in the amount of the bacteria in leaf tissue. Lxx-infected plants were growth in a greenhouse and inoculated or not with Lxx. In inoculated plants the mean bacterial populations were 27,3 and 264 Lxx cells / 100 ng of DNA at 30 and 60 days after inoculation (DAI), respectively, while in noninoculated plants, the levels were significantly lower, reaching 6.8 and 34.5 cells / 100 ng of DNA. The levels of gene expression were compared between inoculated and non-inoculated plants at each time through hybridization of cDNA synthesized from mRNA extracted from leaf roll on microarray slides. A total of 272 differentially expressed genes were identified in inoculated compared with non inoculated plants, being 106 and 152 differentially expressed exclusively at 30 or 60 DAI, respectively. Of these, 55 genes were selected for validation by qPCR, with emphasis on genes belonging to the categories of cell cycle, DNA metabolism and hormones, signal transduction and transcriptional regulation, since these processes are directly correlated with plant growth. Of the genes differentially expressed at 30 DAI, 17 (60.7%) were validated, comprising 11 genes down-regulated involved in the control of cell cycle and DNA metabolism, such as cyclins, cyclin-dependent kinase (CDKB1;1), minichromosome maintenance (MCM) and histone H4 encoding-genes. Of the genes differentially expressed at 60 DAI, 17 (53%) were validated, comprising up-regulated genes related to the synthesis of hormones, transcription factors and defense such as ACC oxidase, a transcription factor containing the WRKY domain, phenylalanine ammonia lyase and repressed MCM genes. The patterns of gene expression are consistent with the classical symptoms of the disease and indicate that increased Lxx titers alters hormonal balance and reduces plant growth by repressing cell division. Keywords: Sugarcane; Leifsonia xyli subsp. xyli; Microarray; Gene expression 12 13 1 INTRODUÇÃO A cana-de-açúcar é uma cultura de interesse mundial, sendo cultivada em mais de 100 países (FAO, 2014). O Brasil é o maior produtor mundial, com uma estimativa de produção para a safra 2013/2014 de, aproximadamente, 595 milhões de toneladas (COMPANHIA NACIONAL DE ABASTECIMENTO - CONAB, 2013), as quais deverão suprir a crescente demanda, interna e externa, por álcool combustível e açúcar (CENTRO DE ESTUDOS AVANÇADOS EM ECONOMIA APLICADA - CEPEA, 2013). O agronegócio sucroalcooleiro do país movimenta cerca de R$ 40 bilhões por ano, considerando faturamentos diretos e indiretos, o que corresponde a aproximadamente 2,35% do PIB. Além disto, é um dos setores que mais empregam no país, responsável pela geração de 4,5 milhões de empregos diretos e indiretos e pela congregação de mais de 72.000 agricultores (UNIÃO DAS INDÚSTRIAS DE CANA-DE-AÇÚCAR - UNICA, 2012). Nos últimos anos, sua área de cultivo vem se expandindo principalmente nas regiões Centro-Sul e Centro-Oeste do país, englobando o oeste e noroeste do Estado de São Paulo, sudoeste de Minas Gerais, além dos Estados de Mato Grosso do Sul, Mato Grosso e Goiás. A estas se somam as potenciais novas fronteiras do Vale do São Francisco e do oeste da Bahia, Maranhão e Piauí. Assim, para que a produção agrícola da cana-de-açúcar no Brasil seja sustentável, é necessário compreender os mecanismos de resposta e adaptação da cultura aos fatores de estresses bióticos e abióticos às quais está submetida nestes variados ambientes de produção. Neste contexto, entre os fatores bióticos, destaca-se a doença denominada de raquitismo da soqueira (RSD), causada pela bactéria Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx). Considerada uma das principais doenças da cana-de-açúcar, o RSD leva a redução na produtividade da cultura, característica que se agrava após sucessivos cortes, com consequente redução da vida útil dos canaviais (GRISHAM et al., 1991). Perdas anuais de US$11 e US$36 milhões, respectivamente, já foram relatadas na Austrália e Flórida (EUA) (FEGAN et al., 1998; DEAN; DAVIS, 1990). Estima-se que somente no estado de São Paulo, nas últimas três décadas, as perdas decorrentes do RSD superaram dois bilhões de dólares (TOKESHI; RAGO, 2005). Urashima e Marchetti (2013) relatam que a porcentagem de cultivares infectadas por Lxx no estado em 2010 foi de aproximadamente 70%. Resultados semelhantes foram obtidos por Ponte et al. (2010) em áreas de multiplicação de cana-deaçúcar no Espírito Santo, oeste de Minas Gerais e sul da Bahia. É importante salientar que estas áreas estão sujeitas a condições prolongadas de déficit hídrico, o que pode agravar as perdas ocasionadas pelo RSD (BRUMBLEY et al., 2006). 14 Embora a doença seja conhecida há muito tempo, a literatura sobre o RSD é escassa no que tange aspectos da interação de Lxx com seu hospedeiro. Assim, este trabalho analisou perfis de expressão gênica em plantas de cana-de-açúcar infectadas com a bactéria visando identificar genes e vias metabólicas responsivas ao desenvolvimento do patógeno. Em plantas com maior população de Lxx observou-se redução na expressão de genes envolvidos no controle do ciclo e metabolismo de DNA, o que é consistente com o principal sintoma da doença, isto é, o subdesenvolvimento vegetativo. Em contrapartida, à medida que o título bacteriano aumentou ao longo do tempo, também ocorreu a indução de genes de defesa e transdução de sinais, sugerindo um a elaboração de material didático. Os Encontros contribuíram na articulação com outros povos e troca de experiências para manter as escolas resistentes contra o regimento dos brancos. Nós vamos continuar trabalhando como sempre. (Encontro dos professores., 1990, p.10) 36 Cadernos de Pesquisa, nº 111, dezembro/2000 Nesse processo de organização, os encontros anuais representam momentos decisivos. Além de possibilitar articulações culturais e políticas, trocas de experiências e de conhecimentos, favorecem o surgimento de novas concepções de educação escolar indígena que respeitam os conhecimentos, as tradições e os costumes de cada povo. Concomitantemente à valorização e ao fortalecimento da identidade étnica, procuram introduzir conhecimentos necessários para uma melhor relação com a sociedade não índia. A seguir, traço um panorama geral da trajetória histórica do movimento, em seus já 12 anos de existência, reportando-me a cada encontro realizado. Foram produzidos relatórios de todos os 12 encontros. No 1o Encontro, realizado na cidade de Manaus, em 1988, cada grupo relatou a maneira de educar na sua comunidade, com base na questão “Como se aprende a viver?” Problematizaram-se a existência da escola e os seus objetivos, tendo em vista o fato de que a educação sempre existiu, o que se traduziu na indagação: “Se já existia educação na originalidade, para que funciona a escola atual?” As reflexões também se reportaram ao perfil da escola desejada e aos passos para obtê-la. No 2o Encontro, de 1989, foram avaliadas as realizações dos professores para atingir os objetivos em consonância com os princípios estabelecidos com a finalidade de nortear a construção de uma verdadeira escola indígena. Destacaram-se, também, as ações empreendidas para garantir o reconhecimento e a regulamentação das escolas indígenas em nível oficial, pois, como explicitam os professores de Roraima: “o não reconhecimento das escolas indígenas é uma das dificuldades mais graves, no que diz respeito aos trabalhos clandestinos”. Os esforços para se manterem articulados foram considerados importantes para o fortalecimento do movimento e a conquista de seus ideais escolares. Como problemas comuns, destacaram-se a questão das línguas indígenas e a situação complexa de diversidade lingüística presente no movimento. No 3o Encontro, de 1990, avaliaram-se as contribuições dos encontros anteriores e o papel do movimento no encaminhamento e na resolução dos desafios enfrentados pelos professores na prática diária. Foram também discutidas temáticas como: “Currículos”, “Formação dos professores” e “Articulação do movimento”. O 4o Encontro, de 1991, aprofundou a discussão de problemas relativos à elaboração de currículos, e o estudo da legislação relacionada direta ou indiretamente à educação escolar indígena. Houve também discussão sobre a articulação do movimento dos professores com as diversas organizações indígenas (de cará- Cadernos de Pesquisa, nº 111, dezembro/2000 37 ter mais amplo, como a Coordenação das Organizações Indígenas da Amazônia Brasileira – Coiab –; e outros movimentos específicos, como o de agentes de saúde indígena e de mulheres). Realizou-se ainda um trabalho inédito com base na metodologia dos “temas geradores”, ocasião em que os professores puderam vivenciar um profundo exercício de interculturalidade, confrontando os diversos saberes dos povos indígenas presentes no encontro. Um dos momentos mais significativos foi a discussão e aprovação de uma “Declaração de Princípios” sobre a educação escolar indígena, que se tornou, desde a ocasião, o principal documento do movimento, de caráter articulador e reivindicatório. O 5o Encontro, de 1992, realizado na cidade de Boa Vista, em Roraima, centrou a atenção nos currículos, no regimento, na metodologia do tema gerador no contexto da diversidade cultural, na legislação/política governamental, nas propostas para o novo Estatuto do Índio, no Comitê Assessor do MEC e, ainda, na articulação e na continuidade do processo. Nessa ocasião o Estado do Acre passou a integrar também o movimento. No 6o Encontro, de 1993, realizado pela segunda vez na cidade de Boa Vista, discutiu-se sobre as “Culturas diversificadas”, o que demonstra a vontade de aproveitar os momentos de reunião não só para se conhecer mas também para conhecer a história e a cultura dos demais povos indígenas presentes. Esse tema, por sua vez, gerou a discussão de vários subtemas: organização social e política; origens; rituais; trabalho, economia e produção; educação tradicional. O 7o Encontro, de 1994, focalizou, além da temática “Medicina tradicional”, vários outros assuntos, tais como a avaliação da história do movimento; diagnóstico e avaliação da situação atual dos currículos e regimentos; política educacional oficial (governamental) e interna (indígena). No 8o Encontro, de 1995, discutiram-se as “Escolas indígenas e projetos de futuro” (relação entre escola e economia) com base na “Declaração de princípios”. Elaborou-se também um detalhado diagnóstico da realidade e dos problemas enfrentados pelas escolas indígenas da região, bem como procurou-se identificar as metas a serem alcançadas, dependentes do poder externo (União, estados e municípios), e as que estavam prioritariamente nas mãos do próprio movimento, ou seja, as que dependem da articulação e do trabalho interno. Foi também retomada uma questão fundamental, discutida no 1o Encontro: “Para que escola?” O 9o Encontro, de 1996, realizado pela primeira vez em São Gabriel da Cachoeira, no Amazonas, elegeu como tema “Escolas indígenas e projetos de futuro”. Na ocasião foram aprofundadas discussões do encontro anterior, a partir da constatação de que as escolas tanto podem ajudar a construir o futuro, como 38 Cadernos de Pesquisa, nº 111, dezembro/2000 podem destruí-lo. Foi também debatida a problemática da saída dos jovens das aldeias, por falta de alternativas internas. O 10o Encontro, de 1997, realizado em clima de festa, em comemoração aos dez anos, teve como tema “Avaliando o passado é que se constrói o futuro”. Num grande esforço coletivo, os participantes efetuaram profunda avaliação dos avanços alcançados e dos problemas e dificuldades que permanecem no tocante à situação das escolas indígenas nas regiões englobadas pelo movimento. Também se discutiu a continuidade do movimento, com base na temática “Pensando as perspectivas futuras”. No 11o Encontro, de 1998, além de serem abordados inúmeros temas – “A educação indígena e suas alternativas rumo ao ano 2000”; “Amazônia: políticas de ocupação e desenvolvimento”; “Educação indígena na trilha do futuro”; “As organizações indígenas frente aos projetos de ocupação da Amazônia”; “Educação indígena e desafios atuais” –, foi desenvolvido um trabalho sobre a proposta de estruturação da COPIAR, suas ações e maneira de se organizar. Decidiu-se também que essa discussão deveria ser aprofundada nas diferentes regiões, durante o período posterior ao encontro, e retomada no 12o Encontro, de 1999. O 12o Encontro, de 1999, realizado novamente na cidade de Manaus, escolheu como tema “A educação indígena nas trilhas do futuro: o Brasil que a gente quer são outros 500”. Na ocasião, foram analisados a situação da educação escolar nas regiões e os avanços e impasses na construção de escolas indígenas. Foram também relatadas experiências indígenas na gestão da educação, atividade que contou com a contribuição do professor Gersem dos Santos Luciano, do povo Baniwa, na época secretário municipal de educação de São Gabriel da Cachoeira, no Amazonas, e do professor Bento Macuxi, coordenador da DEI, de Roraima. A opção pela “oficialização”: riscos e desafios de um novo momento A dinâmica dos encontros tem priorizado, ao longo desses 12 anos, o intercâmbio das variadas experiências de como “fazer escolas indígenas”, fortalecendo o movimento como formulador de políticas e princípios próprios para a educação escolar. Também a troca de informações acerca do debate nacional quanto ao direito dos povos indígenas a “escolas diferenciadas”, inclusive prevista na legislação oficial, tem merecido constantes reflexões, como foi o caso da discussão sobre Resolução elaborada pelo Conselho Nacional de Educação, que cria e normatiza a categoria “escolas indígenas”. No final do último encontro, em 1999, decidiu-se, com o objetivo de aprimorar o instrumental de organização do movimento – seu Cadernos de Pesquisa, nº 111, dezembro/2000 39 poder de articulação e proposição –, transformar a Copiar em Conselho de Professores Indígenas da Amazônia – Copiam. Para tanto, as diversas regiões assumiram tarefas concretas, entre as quais a elaboração de uma proposta de estatuto, discutida no 13o Encontro Anual, em Manaus, em agosto de 2000. Esse encontro teve o formato de Assembléia Geral do Copiam, ocasião em que foi abordado o tema “A educação indígena diferenciada é a trilha do novo milênio”. Com uma pauta predominantemente ligada às de Araçatuba, São Paulo, Brasil, e relação entre elas no período de 1994 a 2004. Ano Cães Habitantes Relação habitante/ cão Relação cão/ 10 habitantes * 1994 1999 2004 26.926 34.332 31.793 159.700 169.303 177.823 * Relação seguida de letras diferentes diferem entre si (p < 0,0001). 5,93 4,93 5,59 1,69 c 2,03 a 1,79 b Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro, 24(4):927-932, abr, 2008 ESTUDO DESCRITIVO DE UMA ESTRUTURA POPULACIONAL CANINA 929 Figura 1 Porcentagem de cães segundo a faixa etária na área urbana de Araçatuba, São Paulo, Brasil, nos anos de 1994 e 2004. baixa resposta imunológica frente a diversas vacinas contra importantes enfermidades, como a raiva 2,13. O número de eutanásias realizadas pelo CCZ declinou no período pós-raiva (1997 e 1998) e aumentou a partir de 1999 com a introdução da leishmaniose visceral (Figura 2). A taxa de eutanásia em 1994 foi de 8,8% (2.376/26.926); em 1999 foi de 14,9% (5.121/34.332) e em 2004 de 29,4% (9.364/31.793), diferenças estas estatisticamente significantes (p < 0,0001). Considerando-se o período de 11 anos, 49.380 cães foram submetidos à eutanásia no CCZ, sendo que deste total, 41.774 corresponderam ao período entre 1999 e 2004 (dados não apresentados). Ao contrário da raiva, cujas medidas de controle são amplamente eficazes, a enzootia de leishmaniose visceral no município não conta com meios de prevenção tão eficientes 14,15 e a alta taxa de eutanásia observada pode ter sido fator determinante para o decréscimo da população canina. Segundo Lima Júnior 2, elevadas taxas de mortalidade favorecem a renovação populacional o que pode resultar em população mais jovem e com maior tendência à prolificidade. Em Araçatuba, porém, a eliminação anual de um grande número de cães pode ter prejudicado seriamente o crescimento desta população uma vez que, mesmo havendo a reposição dos cães, muitos podem ter sido eliminados antes de atingirem a idade reprodutiva. A distribuição dos animais pela área urbana de Araçatuba revelou uma densidade de cães variável entre os diversos setores. Em 2004, por exemplo, os cães jovens com menos de dois anos de idade representaram 49,6% dos cães da área urbana (Figura 3). Os setores mais periféricos, com população de poder aquisitivo mais baixo, com mais problemas sociais e de saneamento ambiental, além de animais sem acompanhamento médico-veterinário, apresentaram alto percentual de cães menores de dois anos de idade (62% a 68%). Por outro lado, em setores economicamente mais desenvolvidos (região central), a porcentagem de cães com menos de dois anos de idade variou de 32,7% a 37,7%, sugerindo que a expectativa de vida dos cães destes setores é superior à dos periféricos. Os setores com maior porcentagem de animais jovens também apresentaram maior número de casos humanos de leishmaniose visceral e prevalência canina da doença (Centro de Controle de Zoonoses, Secretaria de Saúde e Higiene Pública. Boletins mensais das atividades de controle da leishmaniose visceral. Araçatuba, 1999-2004). Tal resultado é influenciado pela maior freqüência de ações de controle desenvolvidas nesses locais em decorrência dos casos humanos, resultando em maior taxa de eutanásia. Porém, o aumento da população canina mais jovem pode resultar em aumento da susceptibilidade destes cães à leishmaniose visceral, mantendo a doença na área. Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro, 24(4):927-932, abr, 2008 930 Andrade AM et al. Figura 2 Número de cães eutanasiados e existentes no período de 1994 a 2004 na área urbana de Araçatuba, São Paulo, Brasil. Figura 3 Porcentagem de animais de até dois anos de idade nos diferentes setores do Município de Araçatuba, São Paulo, Brasil, em 2004. São Paulo Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro, 24(4):927-932, abr, 2008 33% a 38% 38% a 46% 46% a 54% 54% a 62% 62% a 68% ESTUDO DESCRITIVO DE UMA ESTRUTURA POPULACIONAL CANINA 931 Conclui-se que a ocorrência de raiva e leishmaniose visceral influenciou na estrutura e composição da população canina da área urbana de Araçatuba, em decorrência das ações de controle aplicadas ao reservatório canino. Resumo Colaboradores No período de 1994 a 2004, a população canina de Araçatuba, São Paulo, Brasil, registrou duas importantes zoonoses: a raiva e a leishmaniose visceral. Analisaram-se as mudanças ocorridas nessa população durante esse período, utilizando resultados de censos caninos e de coletas censitárias de sangue realizados em 1994, 1999 e 2004. A relação cão/10 habitantes variou significativamente, passando de 1,7 em 1994 para 2,0 em 1999 e para 1,8 em 2004. A porcentagem de cães com até um ano de idade passou de 20% para 32,5% e o número de eutanásias realizadas também aumentou após 1999, com a introdução da leishmaniose visceral. O número de cães e a estrutura etária variaram nos diversos setores do município e aqueles com maior porcentagem de animais com até dois anos de idade apresentaram maior ocorrência de casos de leishmaniose visceral humana e canina. Tais resultados decorrem de ações de controle adotadas nos setores com casos humanos de leishmaniose visceral, porém, o aumento da população canina mais jovem pode resultar em aumento da susceptibilidade destes cães à doença, favorecendo a manutenção da mesma na área. A. M. Andrade contribuiu na coleta de dados, análise e interpretação dos resultados e elaboração do manuscrito. S. H. V. Perri colaborou na análise estatística e correção do texto. L. H. Queiroz e C. M. Nunes contribuíram na concepção e planejamento, análise e interpretação dos dados e correção do texto. Agradecimentos À Prefeitura Municipal de Araçatuba, por meio da Secretaria de Saúde e Higiene Pública e do Centro de Controle de Zoonoses, e ao relator (anônimo) pelas correções e sugestões. Raiva; Leishmaniose Visceral; Eutanásia Animal; Cães Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro, 24(4):927-932, abr, 2008 932 Andrade AM et al. Referências 1. Beran GW, Frith M. Domestic animal rabies control: an overview. Rev Infect Dis 1988; 10(4 Suppl): 672-7. 2. Lima Júnior AD. Caracterização da população canina para o controle da raiva e outros problemas de saúde pública. Ciência Veterinária Tropical 1999; 2:65-78. 3. Wandeler AI, Budde A, Capt S, Kappeler A, Matter H. Dog ecology and dog rabies control. Rev Infect Dis 1988; 10(4 Suppl):684-8. 4. Silva LHQ, Bissoto CE, Delbem ACB, Ferrari CIL, Perri SHV, Nunes CM. Canine rabies epidemiology in Araçatuba and neighborhood, Northwestern São Paulo State – Brazil. Rev Soc Bras Med Trop 2004; 36:139-42. 5. Galimbertti MZ, Katz G, Camargo-Neves VLF, Rodas LAC, Casanova C, Costa IP, et al. Leishmaniose visceral americana no Estado de São Paulo. Rev Soc Bras Med Trop 1999; 32(1 Suppl):217-8. 6. Centro de Vigilância Epidemiológica “Prof. Alexandre Vranjac”, Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo. Leishmaniose visceral americana humana – casos autóctones e óbitos de leishmaniose visceral americana, segundo município de residência, 1999-2005. http://www.cve.saude. sp.gov.br/htm/zoo/lvah_auto9904.htm (acessado em 24/Ago/2007). 7. Coordenadoria de Controle de Doenças, Superintendência de Controle de Endemias, Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo. Manual de vigilância e controle da leishmaniose visceral americana do Estado de São Paulo. São Paulo: Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo; 2006. 8. Nunes CM, Martines DA, Fikaris S, Queiroz LH. Avaliação da população canina da zona urbana do Município de Araçatuba, São Paulo, SP, Brasil. Rev Saúde Pública 1997; 31:308-9. 9. Glasser CM, Fonseca Junior DPF. Guia de instruções do plano de erradicação de Aedes aegypti. São Paulo: Superintendência de Controle de Endemias, Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo; 1998. 10. Zar JH. Biostatistical analysis. 4th Ed. New Jersey: Prentice-Hall; 1998. 11. Oboegbulem SI, Nwakonobi IE. Population density and ecology of dogs in Nigeria: a pilot study. Revue Scientifique et Technique 1989; 8:733-45. 12. Soto FRM. Dinâmica populacional canina no Município de Ibiúna-SP: estudo retrospectivo de 1998 a 2002 referente a animais recolhidos, eutanasiados e adotados [Dissertação de Mestrado]. São Paulo: Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo; 2003. 13. Silva LHQ. Produção de anticorpos e determinação da resistência adquirida à raiva canina [Tese de Doutorado]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo; 1999. 14. Costa CHN, Vieira JBF. Mudanças no controle da leishmaniose visceral no Brasil. Rev Soc Bras Med Trop 2001; 34:223-8. 15. Palatinik-de-Souza CB, Santos VR, França-Silva JC, Costa RT, Reis AB, Palatinik M, et al. Impact of canine control on the epidemiology of canine and human visceral leishmaniasis in Brazil. Am J Trop Med Hyg 2001; 65:510-7. Recebido em 19/Set/2007 Versão final reapresentada em 08/Jan/2008 Aprovado em 15/Jan/2008 Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro, 24(4):927-932, abr, 2008

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