Identificação e caracterização bioquímica das esterases em Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae) e a relação com a resistência aos inseticidas

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Adriana Aparecida Sinópolis Gigliolli Identificação e caracterização bioquímica das esterases em Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae) e a relação com a resistência aos inseticidas Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (área de concentração Biologia Celular e Molecular), da Universidade Estadual de Maringá para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas Maringá-2008 Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) (Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil) G459i Gigliolli, Adriana Aparecida Sinópolis Identificação e caracterízação bioquímica das esterases em Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae) e a relação com a resistência aos inseticidas / Adriana Aparecida Sinópolis Gigliolli. - Maringá : [s.n.], 2008. 57 f. : il. color. Orientadora : Prof. Dr. Ana Silvia Lapenta Co-orientadora: Prof. Dr.Maria Claudia C. R. Takasusuki Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Maringá, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, área de concentração: Biologia Celular e Molecular, 2008. 1. Insetos (caruncho da farinha de trigo) Resistência aos inseticidas. 2. Insetos (caruncho da farinha de trigo) - Esterases - Resistência aos inseticidas. I. Universidade Estadual de Maringá, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, área de concentração: Biologia Celular e Molecular. II. Título. CDD 21.ed.572.79 Adriana Aparecida Sinópolis Gigliolli Identificação e caracterização bioquímica das esterases em Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae) e a relação com a resistência aos inseticidas Orientador(a): Profª Drª Ana Silvia Lapenta Co-orientador(a): Profª Drª Maria Claudia Colla Ruvolo Takasusuki Maringá-2008 Dedico ao meu esposo Anderson Agradecimentos A todas as pessoas que colaboraram para a realização deste trabalho, desejo prestar os mais sinceros agradecimentos. Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Maringá e ao Departamento de Biologia Celular e Genética onde foram desenvolvidos os experimentos desta dissertação. Ao CNPq pelo apoio financeiro. A minha orientadora Ana Silvia, pela paciência, compreensão e pelos votos de confiança que me fortaleceram durante a realização deste trabalho. Obrigada pelos conhecimentos que me proporcionou e acima de tudo pela amizade em todos os momentos. A minha co-orientadora e grande amiga Maria Claudia, exemplo de dedicação ao trabalho e a ciência. Te agradeço pela presteza em me orientar, pelas sugestões e incentivo para a conclusão deste trabalho. Aos membros da banca, Profº Drº Hélio Conte e Profª Drª Mary Massumi Itoyama. Aos professores Claudete Mangolin, Erasmo Renesto, José Ricardo, Maria de Fátima e Sandra Collet pela convivência e profissionalismo com que me atenderam durante a pós-graduação. Aos técnicos Sérgio e Valmir que auxiliaram no desenvolvimento desta pesquisa. Ao colega Narcimário Pereira Coelho, mestrando do Departamento de Química da Universidade Estadual de Maringá, pelo auxílio nos cálculos experimentais necessários na realização deste trabalho. A Ana Paula, Leandro e Rosimar, pela amizade solidificada durante a graduação, incentivo e confiança. Também a todos os colegas da pós-graduação pelos momentos de alegrias e dificuldades compartilhados. A toda turma do laboratório de genética animal que com pequenos gestos contribuíram para mais esta etapa na minha vida. Com imenso carinho, agradeço a Débora e a Ana Luísa, que me ensinaram muito com seus exemplos e atitudes, amigas do coração que farão parte da minha vida pra sempre. Ao meu esposo, que esteve ao meu lado em todos os momentos. Obrigada pela motivação diária, por ter acreditado nos meus ideais e por hoje estar compartilhando comigo mais esta conquista vitoriosa. Aos meus pais, Hélio e Antonia, e minha irmã querida. Obrigada pelo amor, incentivo e confiança. Enfim, a Deus, a quem nos momentos de incerteza pedi que me mostrasse o caminho certo. A quem pedi forças e me destes dificuldades para fazer-me mais forte, a quem pedi sabedoria e me destes problemas para resolver, a quem pedi coragem e me destes obstáculos para eu superar. Agradeço a este ser supremo, pois recebi mais do que precisava para que eu não desistisse de atingir os meus objetivos. BIOGRAFIA Adriana Aparecida Sinópolis Gigliolli, nascida no dia 12 de agosto de 1980, na cidade de São Jorge do Ivaí –PR. Graduada no curso de Licenciatura em Ciências Biológicas pela Universidade Estadual de Maringá. Especialista em Capacitação Docente no Ensino de Ciências: com ênfase em Ciências Biológicas (Departamento de Biologia Celular-UEM) e mestranda do Curso de Pós-graduação em Ciências Biológicas: área de concentração em Biologia Celular e Molecular (UEM). “ O valor das coisas não está no tempo em que elas duram, mas na intensidade com que acontecem. Por isso existem momentos inesquecíveis, coisas inexplicáveis e pessoas incomparáveis". (Fernando Pessoa) Apresentação Em consonância com a resolução nº 07/2007-CPBC do Programa de Pósgraduação em Ciências Biológicas, esta dissertação é composta por dois artigos que tratam da identificação e caracterização bioquímica das esterases durante o desenvolvimento de Tribolium castaneum e buscam estabelecer a relação dessas isoenzimas com a resistência deste inseto-praga ao organofosforado malathion e ao piretróide cipermetrina. Cada artigo está redigido de acordo com as normas das revistas a qual serão submetidos para a publicação. Artigo I – Análise genética e caracterização funcional das esterases em Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae) e a relação com os mecanismos de resistência ao malathion – Revista Biochemical Genetics (ISSN 006-2928) Artigo II – Estudo da toxicidade do malathion e da cipermetrina em Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae) e a participação da EST-5 nos mecanismos de resistência a esses compostos – Revista Journal of Stored products research (ISSN 0022-474X) Identificação e caracterização bioquímica das esterases em Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae) e a relação com a resistência aos inseticidas. Resumo Os insetos da espécie Tribolium castaneum, conhecidos popularmente no Brasil como “caruncho”, são pragas que infestam produtos armazenados como sementes, grãos, especiarias, cereais, rações, farinhas e outros, gerando perdas qualitativas e quantitativas na produção e grandes prejuízos econômicos para produtores e comerciantes. O uso intensivo de inseticidas no controle de pragas de grãos armazenados tem contribuído para o desenvolvimento de resistência, por meio de mecanismos fisiológicos, comportamentais e bioquímicos. O mecanismo bioquímico talvez seja um dos mais importantes, uma vez que são realizados por enzimas, tais como as esterases. Duas classes de esterases estão envolvidas na resistência aos inseticidas, as carboxilesterases e as colinesterases. As carboxilesterases atuam na detoxificação metabólica por meio da hidrólise e/ou seqüestro do inseticida. Dentre as colinesterases, as acetilcolinesterase (AChE) é uma enzima que atua nos terminais do impulso nervoso do inseto, hidrolisando o neurotransmissor acetilcolina, sendo que os organofosforados e carbamatos ligam-se covalentemente ao sítio ativo desta enzima causando a morte do inseto. Algumas modificações estruturais no seu sítio ativo podem conferir resistência a estes compostos. Os objetivos do presente estudo foram identificar e caracterizar as esterases nos estágios do desenvolvimento de T. castaneum, determinar a resistência de seis linhagens desta espécie ao organofosforado malathion e ao piretróide cipermetrina, avaliar a ocorrência de resistência cruzada entre esses compostos e o possível envolvimento das esterases nos mecanismos de resistência a esses inseticidas. Para tanto, os insetos foram expostos diretamente aos inseticidas e a mortalidade verificada após 24 horas. Várias concentrações foram testadas e a CL50 estimada para cada linhagem. Os indivíduos sobreviventes a cada tratamento foram congelados e submetidos à eletroforese em gel vertical de poliacrilamida (PAGE), para a análise das esterases. O sistema PAGE permitiu a identificação de 19 bandas esterásicas, atribuídas a 11 locos gênicos, com expressão diferencial tanto ao longo do desenvolvimento quanto entre as linhagens analisadas. Foram identificadas cinco esterases em insetos adultos, das quais, EST-1, 2, 3 e 9 foram classificadas como colinesterases e a EST-5 como carboxilesterase. Todas as linhagens foram submetidas à bioensaios com malathion e cipermetrina. A CL50 para o malathion variou de 8,81 a 49,93 µg/cm2 e para a cipermetrina de 0,6 a 1,6 µg/cm2. O comportamento das esterases em insetos expostos aos agroquímicos foi avaliado em todas as linhagens. Para o malathion, duas delas responderam de maneira diferencial, a EST-3 e a EST-5. Foi verificado que a EST-5, por estar presente nas linhagens resistentes e ser ausente na linhagem mais sensível ao malathion, parece ser uma importante enzima envolvida na detoxificação metabólica deste organofosforado, atuando principalmente na pronta resposta a este inseticida em insetos resistentes. Já EST-3, apresentou sensibilidade diferencial entre as linhagens analisadas, o que pode refletir diferenças na capacidade de detoxificação enzimática, provavelmente, envolvendo o seqüestro do inseticida. A EST-5 também pode estar envolvida na detoxificação da cipermetrina, provavelmente por seqüestro do inseticida, uma vez que a exposição a este inseticida, selecionou uma esterase com menor afinidade pelo malathion. De maneira especial este trabalho mostra a existência de grande variação no grau de resistência aos inseticidas malathion e cipermetrina e sugere a participação da carboxilesterase EST-5 nestes mecanismos de resistência. No entanto, maiores investigações envolvendo análises bioquímicas e moleculares devem ser realizadas para um melhor entendimento dos mecanismos que tornam os insetos resistentes aos inseticidas. Identificação e caracterização bioquímica das esterases em Tribolium castaneum (Coleoptera: Tenebrionidae) e a relação com a resistência aos inseticidas. ABSTRACT The insects of the species Tribolium castaneum, popularly known in Brazil as “caruncho”, are pests which have affecting the quality of stored-products like seeds, grains, spices, crumbs, rations, maize flour, flours in general, and cereal meals generating qualitative and quantitative losses in the production and great economical damages for producers and merchants. The intensive use of insecticides has contributed for developing resistance through physiological, behavioural and biochemical mechanisms. The biochemical mechanism is one of the most important because they are accomplished by enzymes of the esterase groups. Two classes of esterases are involved in resistance insecticide: the carboxylesterases and cholinesterases. The carboxylesterases act in metabolic detoxification through the hydrolysis or molecule sequestration. Among the cholinesterases, the acetylcholinesterases (AChEs) act on the terminal nerves of insects by hydrolyzing the acetylcholine neurotransmitter. The objectives of the present experiment was to identify and characterise esterases during the stages of Tribolium castaneum development, determine the resistance of six strains to the malathion (an organophosphorate) and cypermethrin (a pyrethroid), evaluate the occurrence of crossed resistance among those composed, and the involvement of esterases in the resistance mechanisms to both insecticide. The insects were exposed directly to the insecticides and the mortality was verified after 24 hours. Several concentrations were tested and the CL50 was estimated for each strain. The survivors of each treatment were frozen and submitted to the vertical polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) for the analysis of the esterases. The PAGE system permitted the identification of eleven esterases with distinguishing expression during the insect development and among the strains. Four esterases in the adults, EST-1, 2, 3, and 9, were classified in the cholinesterase and EST-5 was classified in the carboxylesterase class. All of the strains were submitted to the treatments with malathion and cypermethrin. The LC50 for malathion varied from 8.81 to 49.93 µg/cm2 and for the cypermethrin from 0.6 to 1.6 µg/cm2. The esterase performance was evaluated in all the strains of insects which were exposed to the agrochemicals. For the malathion, the EST- 3 and EST-5 had different performance. It seems that the EST-5 is an important enzyme which is involved in the metabolic detoxification of the organophosphorate because it is present in the resistant and absent in the susceptible lines. On the other hand, the EST-3 had distinguishing sensitivity among strains which is reflecting differences in the capacity of detoxification. Such a fact may be caused by the presence of molecule sequestration. The EST-5 may also be involved in the cypermethrin detoxification probably through molecule sequestration because the exposition to the insecticide selected a sterase with less afinity to the malathion. In a special manner, this experiment shows a large variation in the resistance to malathion and cypermetrin and suggest that the EST-5 are participating in the mechanisms of resistance. However, more studies involving biochemical and molecular analyses must be done for a better understanding of mechanisms which made the insects resistant to insecticides.

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