Methylmercury Concentration in Fish and Risk-Benefit Assessment of Fish Intake among Pregnant versus Infertile Women in Taiwan.

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RESEARCH ARTICLE Methylmercury Concentration in Fish and Risk-Benefit Assessment of Fish Intake among Pregnant versus Infertile Women in Taiwan Hsing-Cheng Hsi1, You-Wen Hsu2, Tien-Chin Chang2, Ling-Chu Chien3* 1 Graduate Institute of Environmental Engineering, National Taiwan University, Taipei, Taiwan, 2 Institute of Environmental Engineering and Management, National Taipei University of Technology, Taipei, Taiwan, 3 School of Public Health, Taipei Medical University, Taipei, Taiwan a11111 * Abstract OPEN ACCESS Citation: Hsi H-C, Hsu Y-W, Chang T-C, Chien L-C (2016) Methylmercury Concentration in Fish and Risk-Benefit Assessment of Fish Intake among Pregnant versus Infertile Women in Taiwan. PLoS ONE 11(5): e0155704. doi:10.1371/journal. pone.0155704 Editor: Yi Hu, Chinese Academy of Sciences, CHINA Received: September 1, 2015 Accepted: April 14, 2016 Published: May 17, 2016 Copyright: © 2016 Hsi et al. This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Data Availability Statement: All relevant data are within the paper and its Supporting Information files. Funding: This study was supported by a grant from Taipei Medical University and National Taipei University of Technology (NTUT-TMU-100-07). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript. Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist. This study examined methylmercury (MeHg) concentrations in fish, the daily MeHg exposure dose, and the risk–benefit of MeHg, ω-3 polyunsaturated fatty acid (ω-3 PUFA), docosahexaenoic acid (DHA), and eicosapentaenoic acid (EPA) related to fish intake among pregnant and infertile women in Taiwan. The measured MeHg concentrations in fish did not exceed the Codex guideline level of 1 mg/kg. Swordfish (0.28 ± 0.23 mg/kg) and tuna (0.14 ± 0.13 mg/kg) had the highest MeHg concentrations. The MeHg concentration in the hair of infertile women (1.82 ± 0.14 mg/kg) was significantly greater than that of pregnant women (1.24 ± 0.18 mg/kg). In addition, 80% of infertile women and 68% of pregnant women had MeHg concentrations in hair that exceeded the USEPA reference dose (1 mg/kg). The MeHg concentrations in hair were significantly and positively correlated with the estimated daily MeHg exposure dose. Based on the risk–benefit evaluation results, this paper recommends consumption of fish species with a low MeHg concentration and high concentrations of DHA + EPA and ω-3 PUFA (e.g., salmon, mackerel, and greater amberjack). Introduction Mercury (Hg) is a persistent element that bioaccumulates in humans and wildlife. It may influence the endocrine system, which could lead to a decrease in ovarian function, an irregular menstrual cycle, abortion, and infertility [1–6]. Methylmercury (MeHg) has a lipophilic characteristic and readily bioaccumulates in exposed organisms, after which it penetrates the blood–brain barrier, causing severe harm to the central nervous system [7, 8]. Recent evidence indicates that maternal low-level MeHg exposure may have adverse effects on fetal birth outcomes and growth [9]. Humans are exposed to MeHg through fish intake because Hg can transform into MeHg in aquatic environments. According to recent studies, fish intake is considered a major pathway of exposure to MeHg. McDowell et al. [10] found that women and children in the United States who reported consuming fish frequently had 3- (0.38 vs. 0.11 mg/ PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0155704 May 17, 2016 1 / 14 Methyl Hg Level and Risk-Benefit of Fish Intake for Women kg) and 2-fold (0.16 vs. 0.08 mg/kg) hair Hg levels, respectively, compared with those who did not consume fish. A study from Italy indicated that hair Hg levels increased by 2-fold for people consuming more fish (5–6 meals per week) compared with those who consumed less fish (i.e., less than 5 meals per week) [11]. In Hong Kong, a study found that greater blood Hg concentration in infertile women may interfere with their endocrine system and induce deleterious effects on reproduction [12]. Cole et al. [13] determined that couples with a maternal blood Hg concentration > 1.2 μg/L (0.24 ppm in hair) may require more time to become pregnant. In another two of our earlier studies [14, 15], the average maternal blood Hg concentration was 9.1 ± 0.40 μg/L, and 89% of mothers had a concentration exceeding the US National Research Council (USNRC) recommended value of 5.8 μg/L. There were 53% of women of childbearing age with Hg concentrations in hair exceeding the US Environmental Protection Agency (USEPA) reference dose of 1 mg/kg. Both of these two reference values were adopted by USNRC and USEPA with a purpose to avoid from Hg influence on the fetus neurodevelopment. Additionally, the fish consumption rate was found to be significantly correlated with the maternal blood and Hg concentrations in hair of pregnant women and women of childbearing age in Taiwan. Notably, data from the Department of Statistics, Ministry of the Interior, Taiwan showed that the infertility prevalence is approximately 15% in Taiwan couples [16]. Moreover, postnatal MeHg exposure could reduce expressive language performance in children who cannot make independent dietary decisions and defer more to their mothers [17]. The Nutrition and Health Surveys in Taiwan investigated changes in dietary habits for the 1993–1996 and 2005–2008 periods and observed an increase in fish intake [18]. Fish intake is thus a critical dietary source among the Taiwan population, which may be exposed to both MeHg and the intake of ω-3 polyunsaturated fatty acid (ω-3 PUFA), docosahexaenoic acid (DHA), and eicosapentaenoic acid (EPA). In addition, ω-3 PUFA and DHA have been known to increase the gestation duration and birth weight, and to reduce the risk of early preterm delivery [19]. The aforementioned results suggest that enhanced comprehension of MeHg concentrations in fish, the daily MeHg exposure dose, and the risks and benefits of MeHg, ω-3 PUFA, and DHA + EPA intake as related to fish intake is critical for women of childbearing age. In the present paper, we systematically analyze MeHg concentrations in fish and hair to examine the daily MeHg exposure dose among pregnant and infertile women in Taiwan. We further investigate the benefits of ω-3 PUFA and DHA + EPA as well as the risks of MeHg related to fish intake. According to the results of the risk–benefit assessment of fish intake, we can provide a useful recommendation on the species and quantity of fish consumption for women and reduce MeHg exposure for fetuses. Materials and Methods Participants and sample collection For this study, 224 women residing in Northern and Central Taiwan from August 2007 to May 2010 were recruited. We categorized women as infertile or pregnant according to their reproductive status, which was confirmed by 3 gynecologists. Infertile women were defined as those who presented with a complaint regarding difficulty conceiving after 1 year of normal sexual activity with the intention of becoming pregnant [20]. The demographic characteristics and dietary information of the participants were obtained using a structured questionnaire. All of the participants provided written informed consent prior to enrollment. The Institutional Review Board at Taipei Medical University (approval number: P950045) and the Investigational Review Board of Taiwan Adventist Hospital (TAIRB number: 989801A) have approved this study. PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0155704 May 17, 2016 2 / 14 Methyl Hg Level and Risk-Benefit of Fish Intake for Women Hair samples of approximately 2 cm in length were collected from the occipital area of the scalp by using clean stainless steel surgical scissors. The hair samples were placed, sealed, and stored in clean polythene bags until analysis. To assess the daily MeHg exposure dose through fish intake, the 10 most popular species of fish (30 samples, with 3 samples for each species) were determined and selected from the questionnaire. The fish samples were divided into the following 3 categories according to the Fisheries Agency database: (1) carnivorous: mackerel (Scomber australasicus), tilapia (Oreochromis mossambicus), hairtail (Trichiurus lepturus), salmon (Oncorhynchus mykiss), greater amberjack (Seriola dumerili), cod (Gadus macrocephalus), tuna (Thunnus alalunga), and swordfish (Xiphias gladius); (2) omnivorous: milkfish (Chanos chanos); and (3) filter feeding: anchovy (Stolephorus commersonnii) [21]. Fish samples were randomly obtained from March to June in 2014 at fish markets, supermarkets, and traditional markets in Taipei City. The samples were placed in clean polyethene bags and transferred to the laboratory immediately after collection. The fish muscle was cleaned, ground with pestle, homogenized, and stored at −18°C for subsequent analysis. Hair and fish sample analysis The MeHg concentrations in hair and fish were analyzed through the Brooks Rand BRL Method BR-0011 and the USEPA Method 1630, with minor modifications. Hair samples were treated with a neutral detergent by performing sonication for 30 min, rinsed 3 times with deionized (d.i.) water, and then dried in an oven at 37°C for 24 h. Details of the analytical method are available in our previous study [17]. The 1.0-g fish samples were transferred to Teflon vials, to which 2 mL of 25% KOH/methanol was added and heated at 75°C for 5.5 h. After being cooled to room temperature, 10 mL of CH2Cl2 and 2 mL of HCl were further added to the samples and violently shaken for 30 min. After being filtrated using a 1PS filter, the solution was purged for 1 h after the addition of d.i. water. The aliquot was diluted to 100 mL with d.i. water in a Teflon vial. The MeHg concentration was analyzed using a MERX integrated automated MeHg analyzer (Brooks Rand, USA). A 100-mL aliquot from the hair samples and a 1-mL aliquot from the fish samples were used for analysis. A sodium acetate buffer (300 mL) and 1.0% NaBEt4 (40 μL) were added into the aliquot prior to analysis. Aliquots of 10 mL and 100 μL from the standard reference materials were analyzed to confirm the quality of the hair and fish test sets, respectively. IAEA-085 MeHg, total Hg, and other trace elements in human hair from the International Atomic Energy Agency as well as certified reference material BCR-465 tuna fish were used to ensure the precision and accuracy of the hair and fish analyses. The average recovery rate was 94.7%, and each sample was analyzed in triplicate. The precision (coefficient of variation) and accuracy were 4.27% and 89.2%, respectively. Daily MeHg exposure dose Information on fish intake was obtained using a structured questionnaire. The individual daily MeHg exposure dose was assessed using Eq 1 from the US Environmental Protection Agency [22], which was modified for this study. 0 n 1 X ! B ðCmj  IRj ÞC X B j¼1 C n B C IRj n n B C X X A j¼1 IRj ðCmj  IRj Þ @ j¼1 C  IR j¼1 ¼ ¼ ð1Þ Em ¼ m BW BW BWi PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0155704 May 17, 2016 3 / 14 Methyl Hg Level and Risk-Benefit of Fish Intake for Women where Em = the dietary MeHg exposure dose from fish (μg/kg/d); Cm = the MeHg concentration in fish (mg/kg wet wt.); IR = the ingestion rate of fish (g/d); Cmj = the MeHg concentration in species j fish (mg/kg wet wt.); IRj = the ingestion rate of species j fish (g/d); and BWi = the individual body weight (kg). Risk–benefit assessment of specific fish intake Eq 2 was solved to estimate the hazard quotient (HQ) for women of childbearing age [23]. The HQ was the ratio between the daily MeHg exposure dose and the reference dose. HQ ¼ Cmj  IRave RfD  BW ð2Þ where Cmj = the MeHg concentration in species j fish (mg/kg wet wt.); IRave = the average ingestion rate of ingesting fish (30 g/d); BW = body weight (56 kg was used in this study); and RfD = the reference dose of the US Environmental Protection Agency (i.e., 0.1 μg/kg/d). The proportion of the desirable dose consumed for the DHA + EPA and ω-3 PUFA concentrations of specific fish was assessed using Eq 3: Ddesire ¼ CFAj  IRave RDIFAj ð3Þ where Ddesire = the proportion of the desirable dose; CFAj = DHA + EPA or ω-3 PUFA concentrations in species j fish (mg/g wet wt.); IRave = the average ingestion rate of fish (30 g/d); and RDIFA = the recommended daily intake of DHA + EPA or ω-3 PUFA concentrations (mg/d). For nonpregnant and nonlactating women, a minimum intake of 250 mg/d of DHA + EPA was recommended by the Food and Agriculture Organization of the United Nations as well as the World Health Organization [24]. For adults, an approximate minimum intake of 1000 mg/ d of ω-3 PUFA was recommended by the Ministry of Health, Labour, and Welfare, Japan, for optimal health [25]. Eq 4 was solved to predict the allowable daily intake of fish for women of childbearing age according to the MeHg concentration of fish species (wet wt.): ADIj ¼ BW  RfD Cmj ð4Þ where ADIj = the allowable daily intake of species j fish (g/d); BW = body weight (56 kg was used for this study); RfD = the reference dose of the US Environmental Protection Agency (i.e., 0.1 μg/kg/d); and Cmj = MeHg concentration in species j fish (mg/kg wet wt.). Statistical analysis The distribution of continuous variables (i.e., age, height, and weight) are expressed as the mean ± standard deviation. The nonparametric Wilcoxon rank-sum test was conducted to compare the parameters that were not normally distributed. The chi-square test and Fisher exact test were performed to compare the categorical variables between pregnant and infertile women. The Spearman rank correlation coefficient was used to compare the relationship between MeHg concentrations in hair and the daily MeHg exposure dose. All statistical analyses were conducted using SPSS (version 17.0) for Windows. The level of significance in a 2-sided test was considered to be P < 0.05. PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0155704 May 17, 2016 4 / 14 Methyl Hg Level and Risk-Benefit of Fish Intake for Women Results and Discussion In this study, the infertile women (34.4 ± 3.7) were on average older than the pregnant women (31.6 ± 4.9) (P < 0.0001) (Table 1). The frequency of Chinese herbal medicine use and sashimi intake in the infertile group was greater than that in pregnant women (P < 0.05). The geometric mean (GM) MeHg concentration in the hair of the pregnant and infertile women was Table 1. Demographic characteristics and MeHg concentrations in the hair of study participants. Age (y) a Height (cm) a Weight (kg) a Pregnant women Infertile women (n = 62) (n = 162) 31.6 ± 4.9 34.4 ± 3.7 <0.0001 b 160.4 ± 5.4 160.0 ± 5.3 0.840 b 55.9 ± 8.2 55.4 ± 11.4 0.567 b 0.003 c Education level Senior high school 16 (25.8) 14 (8.7) College 38 (61.3) 114 (70.8) Graduate 8 (12.9) 33 (20.5) 0.558 d Occupational exposure Yes 5 (8.3) 10 (6.2) No 55 (91.7) 151 (93.8) 0.025 c Amalgam fillings No 24 (40.0) 35 (22.7) 1–3 26 (43.4) 67 (43.5) 4–6 8 (13.3) 36 (23.4) 7 2 (3.3) 16 (10.4) 0.002 c Alcohol consumption Yes 3 (5.0) 40 (24.8) No 57 (95.0) 121 (75.2) <0.001 c Chinese herbal medicine use Never 15 (24.2) 7 (4.4) <1 time per month 31 (50.0) 71 (44.7) 1 time per month 16 (25.8) 81 (50.9) 0.296 d Smoking Yes 1 (1.7) 10 (6.2) No 59 (98.3) 151 (93.8) 0.387 c Fresh fish intake 1 meal per week 23 (37.1) 74 (46.0) 1–2 meals per week 30 (48.4) 62 (38.5) 3 meals per week 9 (14.5) 25 (15.5) <0.05 d Sashimi intake Never 30 (48.4) 49 (30.8) 1–3 meals per month 31 (50.0) 106 (66.7) 1–2 meals per week MeHg concentration (mg/kg wet wt.)e a b 1 (1.6) 4 (2.5) 1.24 ± 0.18 1.82 ± 0.14 0.01 b Mean ± standard deviation Wilcoxon rank-sum test c Chi-square test d Fisher exact test Geometric mean ± standard error e P value doi:10.1371/journal.pone.0155704.t001 PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0155704 May 17, 2016 5 / 14 Methyl Hg Level and Risk-Benefit of Fish Intake for Women 1.24 ± 0.18 mg/kg and 1.82 ± 0.14 mg/kg, respectively. The MeHg concentrations in the hair of the infertile women were significantly higher than those in the hair of the pregnant women (P = 0.01). In addition, 80% of the infertile women and 68% of the pregnant women had MeHg concentrations in hair that exceeded the US Environmental Protection Agency reference dose of 1 mg/kg. We collected 2-cm hair samples from the occipital area of the scalp, which indicated the previous 1–2 months of exposure as suggested by Díez et al. [11]; 32 maternal hair samples after delivery (including the first, second, and third trimester) were collected. Significant differences in Hg concentrations in hair among the 3 trimesters (P = 0.54, S1 Table) were not found. Thus, hair could be used as a suitable indicator of long-term Hg exposure because Hg exposure is considered being constant. The MeHg concentration distributions of the fish that were frequently consumed by the women are summarized in Fig 1 and S2 Table. The highest MeHg concentrations were in swordfish (X. gladius: 0.28 ± 0.23 mg/kg wet wt.) and tuna (T. alalunga: 0.14 ± 0.13 mg/kg wet wt.). Karjalainen et al. [26] reported that the MeHg concentrations in tuna, cod, and salmon in Finland ranged from 0.19–0.31, 0.038–0.056, and 0.01–0.10 mg/kg wet wt., respectively. A recent study in North America reported MeHg concentrations in tuna (0.49 ± 0.07 mg/kg wet wt.), cod (0.14 ± 0.09 mg/kg wet wt.), salmon (0.014 ± 0.013 mg/kg wet wt), and tilapia (0.016 ± 0.012 mg/kg wet wt.) [27]. Levels of MeHg in Tuna were 0.78 ± 0.91 mg/kg wet wt. and 0.14 ± 0.02 mg/kg wet wt. in Portuguese and Spain, respectively [28, 29]. In Hong Kong, the MeHg concentration in tilapia ranged from foram contidos fisicamente em decúbito lateral direito, e as agulhas posicionadas sobre os acupontos (ACs) coração 7 (C-7 – Shenmen), localizado entre o processo estiloide lateral e o osso cárpico acessório, exatamente na dobra da articulação úmero-rádio-ulnar, e pericárdio 6 (PC-6 – Neiguan), localizado entre os tendões do músculo flexor carporradial e do músculo flexor digital superficial (Fig. 1A, 1B e 1C), conforme descrito por Draehmpaehl e Zohmann (1997). Já para a segunda seção, os animais foram novamente posicionados em decúbito lateral direito, e as agulhas inseridas em acupontos falsos (AF), localizados no oitavo e no nono espaço intercostal esquerdo (Figura 1D), onde não há interferência de nenhum outro meridiano, conforme descrito por (Draehmpaehl e Zohmann, 1994). Independentemente da seção, não foi realizada estimulação manual das agulhas, e os acupontos permaneceram estimulados por um período de 30 minutos, respeitando-se o período mínimo de 10 a 20 minutos sugerido por Scott (2001) para que o acuponto possa promover um efeito observável. Figura 1. Localização dos acupontos C-7 (seta em A) e PC-6 (seta em B) no cão (Adaptado de Draehmpaehl e Zohmann, 1997). Em C, acupuntura em cão do experimento acuponto C-7 (seta azul) e acuponto PC-6 (seta laranja). Em D, acupuntura em cão do experimento em acuponto falso. Arquivo pessoal, 2014.  Previamente à aplicação das agulhas nos ACs, foi realizado um registro eletrocardiográfico (ECG) com dois minutos de duração e, após a inserção das agulhas nos ACs, o registro eletrocardiográfico se manteve durante os 30 minutos de acupuntura. Para a realização do eletrocardiograma, foi utilizado um aparelho de eletrocardiografia computadorizada (ECGPC – TEB®), respeitando-se o padrão de fixação de eletrodos descrito por Tilley (1992), com registro das derivações bipolares e unipolares aumentadas e calibração de 25mm/s e 1mV (N). Os dados do ECG foram interpretados de forma comparativa pré e pós-estimulação dos acupontos, sendo os dados pós-estimulação coletados e interpretados em intervalos de cinco minutos até o final da gravação (30 minutos). Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.68, n.1, p.252-256, 2016 253 Silva et al.  Para a análise da VFC, foi utilizada a fórmula disponível em Carareto et al. (2007). A normalidade dos dados obtidos foi verificada pelo teste de Shapiro-Wilk (P>0,05), seguida pelo teste ANOVA com pós-teste de Bonferroni para as variáveis paramétricas e pelo teste de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn (P<0,05) para as variáveis não paramétricas. Foi realizada análise descritiva para as variáveis qualitativas. No presente estudo, 90% dos animais apresentaram arritmia sinusal respiratória, demonstrando maior influência do sistema nervoso simpático, em todos os momentos do grupo ACs, enquanto no grupo AF esse ritmo cardíaco esteve presente em 100% dos animais, em todos os momentos. O ritmo sinusal foi encontrado apenas em 10% dos animais do grupo ACs, sugestivamente por se tratar da primeira exposição dos animais ao experimento, resultando em maior influência parassimpática sobre o sistema cardiovascular. Conforme demonstrado na Tab. 1, houve pequena e irrelevante diferença quando comparada a FC de todos os momentos do grupo ACs com os momentos do grupo AF, o que evidencia, portanto, a ineficácia da estimulação dos acupontos sobre esse parâmetro. Tabela 1. Frequência cardíaca (FC) e variabilidade da frequência cardíaca (VFC) obtidas com a realização dos acupontos verdadeiros (AV) C-7 e PC-6 e do acuponto falso (AF) em diferentes momentos do ECG, expressos em mediana (percentil 25% - percentil 75%) para a FC e média±desvio-padrão para a VFC Momentos FC (bpm) VFC AV AF AV AF 0 minuto 107 (92-130)a 112 (93-129)a 12,79±0,46ab 12,71±0,47b 5 minutos 90 (79-121)a 93 (82-115)a 13,08± 0,48ab 13,09± 0,49ab 10 minutos 94 (79-118)a 88 (70-123)a 13,01± 0,48ab 13,12± 0,53ab 15 minutos 96 (76-120)a 99 (81-115)a 13,04± 0,52ab 13,17± 0,51a 20 minutos 95 (79-120)a 95 (81-112)a 13,13± 0,51ab 13,07± 0,54ab 25 minutos 104 (83-115)a 89 (76-108)a 13,15± 0,45ab 13,17± 0,53a 30 minutos 87 (82-107)a 95 (81-117)a 13,18± 0,46ab 13,11± 0,56ab P = 0,0890 P = 0,0051 Para a FC, valores seguidos por letras distintas diferem entre si (P<0,05) ao teste de Dunn. Para a VFC, valores seguidos por letras distintas diferem entre si (P<0,05) ao teste de Bonferroni. Não foi observada diferença na VFC (Tab. 1) entre os grupos do ACs e AF, exceto quando comparado apenas o momento basal com os momentos 15 e 25 minutos do AF, contudo sem relevância clínica para o estudo. Sabidamente, VFC constitui uma medida simples e não invasiva que avalia os efeitos do sistema nervoso autônomo sobre o coração. Variações nessa variabilidade são normais e esperadas, indicando habilidade do coração em responder a múltiplos estímulos fisiológicos e ambientais. Em síntese, uma alta VFC representa boa adaptação, caracterizando um indivíduo saudável, com mecanismos autonômicos eficientes, enquanto a baixa VFC representa adaptação anormal e insuficiente do SNA (Carareto et al., 2007). Dentre as opções terapêuticas para o tratamento de anormalidades dos mecanismos autonômicos, a acupuntura vem se destacando em vários estudos em animais, entretanto em nenhum desses estudos se objetivou a avaliação do efeito da acupuntura em indivíduos saudáveis, conforme ocorreu no presente estudo, fator limitante à discussão mais aprofundada. Observam-se, na literatura, diversos estudos em que foram observados os efeitos da acupuntura sobre pacientes com diferentes distúrbios cardiovasculares. Syuu et al. (2001) relataram efeitos benéficos da estimulação do acuponto PC-6 em cães anestesiados e sob toracotomia. Nesse estudo, os autores descrevem reduções na pressão arterial média, volume diastólico final, frequência cardíaca, débito cardíaco e pressão sistólica final mediante estimulação do acuponto. O efeito cardiovascular da acupuntura sobre o acuponto PC-6 em cães também foi observado por Jingbi (2004) em modelo de experimental de infarto agudo do miocárdio. Nesse estudo, foi observado que a acupuntura proporcionou redução do segmento ST do eletrocardiograma, além de reduzir as áreas de infarto induzidas pela ligadura coronariana. Entretanto, esses dois 254 Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.68, n.1, p.252-256, 2016 Efeitos da acupuntura estudos diferem do presente pelo fato de as agulhas terem sido estimuladas eletricamente (eletroacupuntura), enquanto no presente estudo estas permaneceram em repouso. Cárdenas (2006) observou que a estimulação dos mesmos acupontos empregados no presente estudo em cavalos sob anestesia geral demonstrou efeitos positivos sobre a taquicardia ventricular induzida por infusão contínua de dopamina, nos quais a estimulação dos ACs C-7 e PC-6 promoveu diminuição do tempo da taquicardia ventricular, demonstrando, assim, a eficácia da estimulação desses acupontos em animais. Um estudo controlado em ratos demonstrou que a estimulação dos acupontos PC-5 e PC-6 reduziu significativamente a incidência de taquiarritmias induzidas experimentalmente pós-oclusão e reperfusão da artéria coronária esquerda (Lujan et al., 2007). Em humanos, a revisão de oito estudos utilizando acupuntura para o tratamento de arritmias cardíacas encontrou cerca de 87 a 100% que foram convertidos ao ritmo sinusal após a estimulação dos acupontos (Xie e Wedemeyer, 2012). estudo não se valeu da estimulação elétrica sobre os acupontos falsos ou verdadeiros (C-7 Shenmen e PC-6 Neiguan). Limitações a este estudo compreendem o fato de que a escolha dos acupontos explorados baseouse nas indicações terapêuticas descritas por Draehmpaehl e Zohmann (1994), em que o acuponto C-7 é indicado em casos de alterações funcionais do coração, e o acuponto PC-6 quando há dores miocárdicas. Ainda segundo os mesmos autores, essa forma de terapia alternativa objetiva normalizar funções orgânicas alteradas e, como no presente estudo foram utilizados animais hígidos, a acupuntura pode não ter promovido influência sobre a VFC nos cães que participaram do experimento. Limita-se, ainda, este estudo quando da observação das recomendações descritas por Scott (2001), quando ele destaca a necessidade de um ou dois tratamentos semanais durante quatro a seis semanas consecutivas, tempo em que se espera que possa haver a resposta desejada à terapia, fato não realizado no presente estudo. Finalmente, Kimura e Hara (2008) desenvolveram um estudo em que foram estudados os efeitos da eletroacupuntura sobre o ritmo do sistema nervoso autônomo em cães. Dentre outras análises, observaram o coeficiente de variação dos intervalos R-R (CVRR) do eletrocardiograma, o qual avalia o índice de atividade nervosa autônoma, de forma semelhante à VFC, a qual também se utiliza do intervalo R-R como unidade de medida. Seus até antes de 12 horas, 24 horas até antes de 72 horas aproximadamente de incubação, os valores foram superestimados. Subestimativas dos valores foram obtidas entre aproximadamente 12 horas às 24 horas e após 72 horas. Em nenhum momento os dados estimados foram iguais aos observados. Nas Fig. 2 e 3, apresentam-se a produção cumulativa de gases obtidos a partir dos dados observados e dos ajustados pelos dois modelos. Para estimativa da produção de gases, tanto o modelo logístico quanto o modelo de Gompertz podem ser utilizados, porém, de acordo com os parâmetros encontrados, o modelo logístico apresentou melhor valor de QME, critério que recomenda o seu uso. Com base nos gráficos de dispersões, pode-se verificar que tanto o modelo logístico como o Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.63, n.1, p.136-142, 2011 139 Farias et al. Tempo de incubação (h) Figura 2. Curvas de produção cumulativa de gases da matéria seca do farelo e da torta de babaçu (Orbignya martiana) a partir da média dos dados observados e dos ajustados pelo modelo de Gompertz. Tempo de incubação (h) Figura 3. Curvas de produção cumulativa de gases da matéria seca do farelo e da torta de babaçu (Orbignya martiana) a partir da média dos dados observados e dos ajustados pelo modelo logístico bicompartimental. Barbosa (2007) obteve melhor ajuste para o modelo logístico em relação ao modelo de Gompertz, ao estudar a faveira e o pau-ferro. Azevedo (2007) encontrou, nos modelos logístico, exponencial e de France, ajuste adequado a todas as etapas do processo fermentativo, descrevendo as características de fermentação do material avaliado, tanto na fase inicial como na final. Na análise gráfica dos resíduos, o modelo logístico subestimou apenas no final da curva e superestimou no início. As curvas de produção de gases caracterizam-se por apresentar forma sigmoidal, podendo ser distinguidas três fases: inicial de baixa produção, fase exponencial de rápida produção e uma fase assintótica de lenta ou inexistente produção de gases (Noguera et al., 2004). Nas primeiras horas de fermentação, uma parte do substrato, geralmente os açúcares solúveis, é fermentada rapidamente, mas isto representa uma pequena porção do total a ser degradado. Na sequência, uma menor quantidade de alimento é hidratada e colonizada pela microbiota, dando origem a degradações distintas, dependendo do substrato, quanto aos constituintes solúveis e estruturais (Beuvink e Kogut, 1993). Giraldo et al. (2006), em estudo sobre a relação entre pressão e volume para a implantação da técnica in vitro de produção de gases, na Colômbia, obtiveram taxas de fermentação mais altas nas primeiras horas de incubação e atribuíram o fato à fermentação dos carboidratos solúveis, e também observaram grande diferença entre os alimentos estudados. Verificaram, ainda, que, entre seis e 12 horas de incubação, houve aumento na taxa de produção de gases, que foi atribuído à fermentação de carboidratos fibrosos ou estruturais. O QME, o R2 e o DMA dos modelos estudados para descrever a produção de gases oriundos da fermentação ruminal da FDN encontram-se na Tab. 3. Quanto ao QME, o modelo logístico bicompartimental foi o que apresentou menor valor. Os valores de R2 foram elevados (0,99) para os dois modelos. Os desvios médios absolutos diferiram entre os modelos, com o de Gompertz apresentando valor mais elevado. Azevedo (2007) obteve valores de R2 baixos para todos os modelos, sendo o menor valor para o de Gompertz. Schofield et al. (1994), ao compararem alguns modelos para descrever a cinética da digestão da fibra, obtiveram valores elevados de R2 para o logístico bicompartimental e o de Gompertz, com menor valor para o primeiro. 140 Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.63, n.1, p.136-142, 2011 Avaliação dos modelos logístico. Tabela 3. Médias do quadrado médio do erro (QME), do coeficiente de determinação (R²) e do desvio médio absoluto (DMA) obtidas a partir dos ajustes dos dados de produção de gases da parede celular com os modelos logístico e de Gompertz Modelo QME R² DMA Logístico 6,39 0,99 1,98 de Gompertz 11,1 0,99 3,21 Nas Fig. 4 e 5, apresentam-se as produções cumulativas de gases obtidos a partir dos dados observados e dos ajustados pelos modelos de Gompertz e logístico bicompartimental para a FDN do farelo e da torta de babaçu. Figura 4. Modelo de Gompertz para o farelo e a torta de babaçu. Azevedo (2007) obteve melhor ajuste para o modelo logístico bicompartimental e exponencial do que para os de France e de Gompertz, no entanto utilizou o modelo de Gompertz, que, apesar de ter apresentado maior dispersão do resíduo, assim como valores mais elevados para QME e DMA, apresentou melhor estimativa para a curva de produção de gases. CONCLUSÕES O modelo logístico bicompartimental estimou os valores de produção de gases melhor do que o modelo de Gompertz. Desse modo, pode ser adotado na estimativa da cinética de fermentação ruminal da matéria seca e fibra em detergente neutro do farelo e da torta de babaçu. AGRADECIMENTOS Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela bolsa de estudo concedida e pelo apoio financeiro necessário à condução da pesquisa. Figura 5. Modelo logístico para o farelo e a torta de babaçu. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AZEVEDO, M.M.R. 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