Expression of PROKR1 and PROKR2 in human enteric neural precursor cells and identification of sequence variants suggest a role in HSCR.

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Expression of PROKR1 and PROKR2 in Human Enteric Neural Precursor Cells and Identification of Sequence Variants Suggest a Role in HSCR Macarena Ruiz-Ferrer1,2, Ana Torroglosa1,2, Rocı́o Núñez-Torres1,2, Juan Carlos de Agustı́n3, Guillermo Antiñolo1,2, Salud Borrego1,2* 1 Unidad de Gestión Clı́nica de Genética, Reproducción y Medicina Fetal, Instituto de Biomedicina de Sevilla, Hospital Universitario Virgen del Rocı́o/CSIC/Universidad de Sevilla, Sevilla, Spain, 2 Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras (CIBERER), Sevilla, Spain, 3 Unidad de Gestión Clı́nica de Cirugı́a Infantil, Hospital Universitario Virgen del Rocı́o, Sevilla, Spain Abstract Background: The enteric nervous system (ENS) is entirely derived from neural crest and its normal development is regulated by specific molecular pathways. Failure in complete ENS formation results in aganglionic gut conditions such as Hirschsprung’s disease (HSCR). Recently, PROKR1 expression has been demonstrated in mouse enteric neural crest derived cells and Prok-1 was shown to work coordinately with GDNF in the development of the ENS. Principal Findings: In the present report, ENS progenitors were isolated and characterized from the ganglionic gut from children diagnosed with and without HSCR, and the expression of prokineticin receptors was examined. Immunocytochemical analysis of neurosphere-forming cells demonstrated that both PROKR1 and PROKR2 were present in human enteric neural crest cells. In addition, we also performed a mutational analysis of PROKR1, PROKR2, PROK1 and PROK2 genes in a cohort of HSCR patients, evaluating them for the first time as susceptibility genes for the disease. Several missense variants were detected, most of them affecting highly conserved amino acid residues of the protein and located in functional domains of both receptors, which suggests a possible deleterious effect in their biological function. Conclusions: Our results suggest that not only PROKR1, but also PROKR2 might mediate a complementary signalling to the RET/ GFRa1/GDNF pathway supporting proliferation/survival and differentiation of precursor cells during ENS development. These findings, together with the detection of sequence variants in PROKR1, PROK1 and PROKR2 genes associated to HSCR and, in some cases in combination with RET or GDNF mutations, provide the first evidence to consider them as susceptibility genes for HSCR. Citation: Ruiz-Ferrer M, Torroglosa A, Núñez-Torres R, de Agustı́n JC, Antiñolo G, et al. (2011) Expression of PROKR1 and PROKR2 in Human Enteric Neural Precursor Cells and Identification of Sequence Variants Suggest a Role in HSCR. PLoS ONE 6(8): e23475. doi:10.1371/journal.pone.0023475 Editor: Jan-Hendrik Niess, Ulm University, Germany Received February 25, 2011; Accepted July 19, 2011; Published August 12, 2011 Copyright: ß 2011 Ruiz-Ferrer et al. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Funding: This work was supported by Fondo de Investigación Sanitaria, Spain (PI070080, PI1001290 and PI071315 for the E-Rare project), Consejerı́a de Innovación Ciencia y Empresa de la Junta de Andalucı́a (CTS 2590) and Consejerı́a de Salud de la Junta de Andalucı́a (PI0249-2008). The CIBER de Enfermedades Raras is an initiative of the ISCIII. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript. Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist. * E-mail: salud.borrego.sspa@juntadeandalucia.es The genetic complexity observed in HSCR could be explained by the complex nature of ENS development, which is regulated by an ever-increasing range of molecules and signalling pathways involving both the NCCs and intestinal environment [4]. Developmental biology studies have identified that the RET/GFRa1/ GDNF signalling pathway is the most critical player for enteric neurogenesis and the proper expression of these proteins have been demonstrated to be crucial for the normal development of the ENS. Recently, it was shown that Prokineticin-1 (Prok1) is expressed in the mucosa and mesenchyme of the mouse embryonic gut during ENS development and promotes the survival/ proliferation and differentiation, but not migration, of enteric NCCs [5]. Prok1 crosstalks with GDNF/Ret signaling and probably provides an additional layer of signaling refinement to maintain proliferation and differentiation of enteric NCCs [6]. Prokineticins (PROK1 and PROK2) belong to the AVIT protein family, a recently identified family of cysteine-rich secreted protein that share the identical amino terminal sequence crucial Introduction The enteric nervous system (ENS) is composed of a large number of neurons and glia, which are organised into interconnected ganglia distributed throughout the gastrointestinal tract. It is originated from neural crest cells (NCCs), that invade the foregut mesenchyme during embryogenesis and migrate in a rostrocaudal direction to extensively colonize the entire length of the gut [1]. Failure in these processes results in aganglionic gut conditions, such as Hirchsprung disease (HSCR) in humans. HSCR, with an incidence of 1:5000 live births, is the most common developmental disorder of the ENS, characterized by its incomplete formation and the absence of enteric ganglia in a variable segment of distal bowel. This leads to peristaltic misregulation and tonic contraction within the affected gut, causing intestinal obstruction [2]. HSCR most commonly presents sporadically and displays a complex pattern of inheritance with low, sex-dependent penetrance and variable expression [3]. PLoS ONE | www.plosone.org 1 August 2011 | Volume 6 | Issue 8 | e23475 PROKR1 and PROKR2 in Human ENS Progenitors observed between neurospheres derived from ganglionic gut from children with or without HSCR. for their biological activities [7,8]. These proteins are known to bind and activate two closely related Gprotein-coupled receptors, PROKR1 and PROKR2, leading to the mobilization of calcium, the stimulation of phosphoinositide-3-kinase turnover, and the activation of the mitogen activated protein kinase (MAPK) signalling pathway [9–11]. Prokineticins were first identified in the gastrointestinal tract as a potent agents mediating smooth muscle contraction [7]. However, they also act as survival/mitogenic factors for endothelial cells, neurons, lymphocytes and hematopoietic stem cells. This report provides the first evidence that PROKR2 could be involved in ENS development. We show that not only PROKR1, as it was previously suggested [5,6], but also PROKR2 are present in human enteric NCCs since both receptors are expressed in ENS progenitors isolated from ganglionic gut samples of patients diagnosed with HSCR. In addition, we have also performed a mutational analysis of PROKR1, PROKR2, PROK1 and PROK2 genes in a cohort of HSCR patients, evaluating them for the first time as susceptibility genes for the disease. Human ENS-Derived Cells Expressed PROKR1 and PROKR2 receptors ‘‘in vitro’’ The expression of prokineticins receptors in human neurospheres was examined. Immunocytochemical detection using specific antibodies revealed that both receptors, PROKR1 and PROKR2, were expressed in floating neurospheres obtained from the ganglionic gut from HSCR patients (Figure 3A and B, Figure S2). Cells PROKR1 and PROKR2 positives were also Nestin positive, which demonstrate that both receptors are expressed by undifferentiated enteric neural precursor cells (Figure 3C and E). In addition, we have also observed co-expression of PROKR1 with TuJ1 (Figure 3D), suggesting that this receptor is still expressed in cells already committed to neuronal fate. Analysis of mRNA by RT-PCR was also performed to confirm the presence of both PROKR1 and PROKR2 transcripts in human ENSderived cells (Figure 4). cDNA from the neuroblastoma cell line SK-N-MC and human endometrium tissue were used as positive control and cDNA from lymphocytes as negative control (data not shown). Results Characterization of Cell Cultures Postnatal ganglionic gut tissues from HSCR patients and controls were dissociated into near single cell suspension and plated in a medium suplemented with EGF, bFGF and GDNF that promotes the growth of isolated ENS progenitors. Over the next 3–4 days, floating neurospheres could be observed (Figure 1). After multiple (3–4) subcultures, part of the neurospheres derived cells still generated new neurospheres with similar characteristics, which indicates the existence of cells with self-renewal properties. To characterize the cells that form the neurospheres, they were immunostained using a neural stem cells marker (Nestin), neuronal marker (TuJ1), glial markers (GFAP, S100) and smooth muscle marker (SMA) (Figure 2). As a result, neurospheres were constituted by Nestin-positive cells (77%62), and most of them also contained cells that expressed the neuronal marker (11%63) (Figure S1). However, staining with antibodies against S100 and SMA showed only a small fraction of positives cells (3%61 and 2%60.4, respectively), while immunofluorescence for GFAP demonstrated a lack of reactivity. RET was also expressed by neurosphere cells and confocal analysis revealed the presence of this receptor in all Nestin-positive neurosphere cells. Taken together, these results suggest that the neurosphere-like bodies contained a mixture of neural and non-neural cells representing different stages of differentiation. In addition, no differences were Mutational analysis The mutational screening of PROKR1, PROK1, PROKR2 and PROK2 genes revealed a total of 13 heterozygous sequence variants in 16 unrelated HSCR patients (Table 1, Figure 5). Four of those variants, detected in PROKR2, had been previously reported as mutations associated to Kallmann Syndrome [12–14]. However, no clinical signs or symptoms of Kallmann syndrome were observed in HSCR patients carrying PROKR2 variants. Only the variants R85C in PROKR2 and the novel G54G in PROK1 were present in control individuals, while the remaining variants were absent in 150 control individuals tested. In addition, when genomic DNA from other family member was available, we have also analysed them and we found that all the variants had been inherited from one of their parents. Five out of the 16 patients carrying these changes (32%) also presented a mutation in the coding sequence of RET or GDNF [15,16]. No mutations were detected in any other HSCR related gene, namely NRTN, ARTN, PSPN, NTF3, NTRK3, EDNRB, EDN3, SOX10 or PHOX2B [16– 21, unpublished results]. In order to establish the pathogenic relevance of those variants, we have performed in silico analysis using different bioinformatic tools. Based on the conserved status of the sequence and the physical properties of amino acids, Polyphen and SIFT programs predicted Figure 1. Generation of neurospheres from human neural precursors cells isolated from ENS. Phase contrast images showing characteristic neurospheres generated from freshly dissociated HSCR ganglionic gut tissue cells after 7 days in culture (A, B). Floating neurospheres were seeded onto coverslip and grown adhered using the same culture conditions (C). Scale bars 50 mm. doi:10.1371/journal.pone.0023475.g001 PLoS ONE | www.plosone.org 2 August 2011 | Volume 6 | Issue 8 | e23475 PROKR1 and PROKR2 in Human ENS Progenitors a different distribution of the disulfide bonds in comparison to the wild type protein, that may induce a change in the threedimensional structure of the protein. Finally, after analysis using ScanProsite interface we observed that the residues R85, R268, P290, Y292 and V297 in PROKR2 were distributed in the functional domains of the receptor, suggesting that an amino acid change at these position could affect its function. Discussion Several studies have demonstrated that undifferentiated precursors cells are present within the gastrointestinal tract not only during embryonic development but also into early postnatal life [22–26]. In the present report, ENS progenitors were isolated from the ganglionic gut from childrens diagnosed with or without HSCR, using full-thickness gut resection specimens or gut biopsy samples, respectively. Immunocytochemical analysis of neurosphere-forming cells showed that the majority of the ENS progenitors in culture were undifferentiated neural stem cells, expressing most of them the RET receptor. A subset of neuronal cells was also observed, including TuJ1 positive cells co-expressing nestin that still retain multipotent characteristics but are competent to differentiate along the differentiated phenotype. However, only a small fraction of S100 positives cells could be identified, indicating an initial step for glial lineage differentiation in the neurospheres. In this sense, it has been demonstrated that neural diversity lineages strongly depends on the cell-intrinsic differences in their responsiveness to factors and gut NCCs are more responsive to neurogenic factors than gliogenic factors, giving rise primarily to neurons [27]. Moreover, diverse environmental conditions was suggested to play a role in regulate differentiation, and the neurosphere microenvironment in culture could be not appropriate enough for the differentiation of glial cells [24,28]. On the other hand, it was possible to dissociate primary derived neurospheres and generate secondary and tertiary neurospheres, supporting the presence of self-renewing progenitors in culture [24]. Using these neurospheres cultures, we investigated the expression of PROKR1 and PROKR2 in human enteric NCCs. Our results show that not only PROKR1 is present in neural stem cells and neuronal precursors, but also PROKR2 receptor is observed. PROKR1 expression was previously demonstrated in mouse enteric neural crest derived cells and Prok-1 was shown to work coordinately with GDNF in the development of the ENS [5,6]. Firstly, both GDNF and Prok-1 share common downstream elements, prominently the MAPK and Akt pathways, which provide multiple points of insertions between these two factors and lead them to exhibit similar biological functions [5]. In addition, GDNF potentiate the proliferative and differentiation effects of Prok-1 by up-regulating PROKR1 expression in enteric NCCs [6]. This functional redundancy of PROKR1/Prok-1 and RET/ GFRa1/GDNF signalling supports the idea that Prok-1/ PROKR1 provides a compensatory pathway to ensure the proper development of ENS. On the other hand, our results show for the first time the expression of PROKR2 in human enteric neural crest derived cells, which confirm that expression profiles of prokineticin receptors in mouse are slightly different from that in human [29]. We suggest that PROKR2 would have a relevant role by inhibiting apoptosis of enteric neuronal precursors, as it was previously described in neural crest-derived neuroblastoma cells [30]. Therefore, PROKR2 could mediate neuronal protection or survival not only in the central nervous system [31], but also during the ENS development. According to that, PROKR1, PROK1, PROKR2 and PROK2 were evaluated as susceptibility genes for HSCR, based on the Figure 2. Characterization of neurospheres from human neural precursors cells isolated from ENS. Confocal microscopy images of floating neurospheres inmunostained with antibodies against Nestin (blue), TuJ1 (green), SMA (green), S100 (red) and RET (red) and counterstained with DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole). Scale bars 25 mm. doi:10.1371/journal.pone.0023475.g002 that, with the exception of the variant V297I in PROKR2, all the changes could generate a probably damaged protein. Moreover, DiANNA software also predicted that the inclusion of additional cysteine residues at positions 85 and 268 in PROKR2 could lead to PLoS ONE | www.plosone.org 3 August 2011 | Volume 6 | Issue 8 | e23475 PROKR1 and PROKR2 in Human ENS Progenitors Figure 3. PROKR1 and PROKR2 expression in neurosphere cultures. Confocal microscopy images of floating neurospheres (A, B) and adhered neurosphere derived cells as described in Figure 1C (C–E) immunostained with antibodies against PROKR1 (red), PROKR2 (red), Nestin (blue) and TuJ1 (green). Scale bars 25 mm. doi:10.1371/journal.pone.0023475.g003 etiopathogenesis of the disease. Several missense variants in PROKR1, PROK1 and PROKR2 genes were detected, most of them affecting highly conserved amino acid residues of the protein and located in functional domains of both receptors, which suggests a possible deleterious effect in their biological function. It is also worth of mentioning that four of the PROKR2 mutations were previously described associated to Kallmann syndrome [12–14], another congenital disorder defined by hypogonadotropic hypogonadism and olfactory abnormalities, often associated with renal agenesis and other developmental defects. In these patients, hypogonadism is due to a failure of embryonic migration of gonadotropin-releasing hormone-synthesizing neurons from the olfactory epithelium to the forebrain, and insufficient prokineticin signalling through PROKR2 seems to play a critical role. The analysis of the functional effect of these mutations by measuring intracellular calcium release upon ligand binding has demonstrated a decreased signalling activity of the receptor [32]. Specifically, P290S impaired cell surfacetargeting of the receptor and R85C, R85H and R268C presumably impaired G protein-coupling. However, when both the wild-type and mutant receptors were co-expressed, none of the mutant receptors affected the properly signalling activity provided by the wild-type receptor. Therefore, these results argue against a dominant negative effect of these mutations in vivo, supporting the com a ocorrência de raiva e leishmaniose visceral canina. Material e métodos Foram utilizados os resultados do censo canino e felino realizado em 1994 8 e os dados da coleta censitária de sangue para diagnóstico da leishmaniose visceral canina realizada na área urbana do município, entre janeiro e dezembro de 1999 (Centro de Controle de Zoonoses, Secretaria de Saúde e Higiene Pública. Boletins mensais das atividades de controle da leishmaniose visceral. Araçatuba, 1999-2004). Os dados de 2004 também foram obtidos por meio de censo canino realizado pelo Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) da Secretaria de Saúde e Higiene Pública do município, no período de novembro de 2003 a março de 2004. Utilizou-se a divisão do município em oito áreas e 36 setores, divisão esta adotada pela Superintendência de Controle de Endemias (SUCEN) desde 1996, como padrão para as ações de saúde 9. Os dados de eutanásia canina foram obtidos dos boletins mensais das atividades de controle da raiva do Município de Araçatuba (Direção Regional de Saúde de Araçatuba, Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo. Boletins das atividades de controle da raiva, Município de Araçatuba, 1993 a 2004). Para a comparação entre as faixas etárias da população canina consideraram-se os anos de 1994 e 2004, adotando-se o critério previamente utilizado em 1994 (< 1 ano; de 1 a 4 anos; > 4 anos). Como na coleta censitária de sangue de 1999 não houve registro da idade dos animais, a mesma não foi considerada para análise. Para a análise estatística utilizaram-se os testes do qui-quadrado e de duas proporções, adotando-se o nível de significância de 5% 10. Resultados e discussão A relação cão/habitante na área urbana de Araçatuba variou de 1,69 em 1994 para 2,03 cães em 1999, atingindo 1,79 cães para cada dez habitantes em 2004 (Tabela 1). O aumento observado no período pós-epidemia da raiva (1996 a 1998) reforça as observações de Beran & Frith 1 e Wandeler et al. 3 de que qualquer redução no tamanho da população canina por aumento na mortalidade é rapidamente compensada pelo aumento na reprodução e na taxa de sobrevivência. Quanto à distribuição sexual, houve diferença estatisticamente significante entre os períodos (p < 0,0001) com 56,2% de machos e 43,8% de fêmeas em 1994, passando a 51% e 49%, respectivamente, em 1999 e 49,9% e 50,1% em 2004. Embora na maioria dos estudos observese a predominância de animais do sexo masculino 2, em Araçatuba a predominância de machos observada em 1994 evoluiu para uma similaridade na distribuição entre os sexos, em 2004. As preferências da população que resultam na seleção de cães machos ou fêmeas são variáveis e sofrem influência de vários fatores econômicos e culturais, podendo ter influenciado os resultados observados na presente pesquisa. Observou-se também diferença estatisticamente significante (p < 0,0001) entre os anos de 1994 e 2004 para a distribuição da população canina segundo a faixa etária (Figura 1). A população de cães com até um ano de idade que representava 20,2% dos animais de 1994, passou a 32,5% em 2004 e a população de um a quatro anos de idade que era de 56,6% da população canina de 1994, diminuiu para 39,1% em 2004. Esse tipo de distribuição é típico de países do terceiro mundo e situações semelhantes foram observadas na Nigéria 11 e em Ibiúna, Estado de São Paulo 12. As implicações epidemiológicas dessa predominância de cães jovens incluem maior suscetibilidade a diferentes doenças e Tabela 1 Populações canina e humana na área urbana de Araçatuba, São Paulo, Brasil, e relação entre elas no período de 1994 a 2004. Ano Cães Habitantes Relação habitante/ cão Relação cão/ 10 habitantes * 1994 1999 2004 26.926 34.332 31.793 159.700 169.303 177.823 * Relação seguida de letras diferentes diferem entre si (p < 0,0001). 5,93 4,93 5,59 1,69 c 2,03 a 1,79 b Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro, 24(4):927-932, abr, 2008 ESTUDO DESCRITIVO DE UMA ESTRUTURA POPULACIONAL CANINA 929 Figura 1 Porcentagem de cães segundo a faixa etária na área urbana de Araçatuba, São Paulo, Brasil, nos anos de 1994 e 2004. baixa resposta imunológica frente a diversas vacinas contra importantes enfermidades, como a raiva 2,13. O número de eutanásias realizadas pelo CCZ declinou no período pós-raiva (1997 e 1998) e aumentou a partir de 1999 com a introdução da leishmaniose visceral (Figura 2). A taxa de eutanásia em 1994 foi de 8,8% (2.376/26.926); em 1999 foi de 14,9% (5.121/34.332) e em 2004 de 29,4% (9.364/31.793), diferenças estas estatisticamente significantes (p < 0,0001). Considerando-se o período de 11 anos, 49.380 cães foram submetidos à eutanásia no CCZ, sendo que deste total, 41.774 corresponderam ao período entre 1999 e 2004 (dados não apresentados). Ao contrário da raiva, cujas medidas de controle são amplamente eficazes, a enzootia de leishmaniose visceral no município não conta com meios de prevenção tão eficientes 14,15 e a alta taxa de eutanásia observada pode ter sido fator determinante para o decréscimo da população canina. Segundo Lima Júnior 2, elevadas taxas de mortalidade favorecem a renovação populacional o que pode resultar em população mais jovem e com maior tendência à prolificidade. Em Araçatuba, porém, a eliminação anual de um grande número de cães pode ter prejudicado seriamente o crescimento desta população uma vez que, mesmo havendo a reposição dos cães, muitos podem ter sido eliminados antes de atingirem a idade reprodutiva. A distribuição dos animais pela área urbana de Araçatuba revelou uma densidade de cães variável entre os diversos setores. Em 2004, por exemplo, os cães jovens com menos de dois anos de idade representaram 49,6% dos cães da área urbana (Figura 3). Os setores mais periféricos, com população de poder aquisitivo mais baixo, com mais problemas sociais e de saneamento ambiental, além de animais sem acompanhamento médico-veterinário, apresentaram alto percentual de cães menores de dois anos de idade (62% a 68%). Por outro lado, em setores economicamente mais desenvolvidos (região central), a porcentagem de cães com menos de dois anos de idade variou de 32,7% a 37,7%, sugerindo que a expectativa de vida dos cães destes setores é superior à dos periféricos. Os setores com maior porcentagem de animais jovens também apresentaram maior número de casos humanos de leishmaniose visceral e prevalência canina da doença (Centro de Controle de Zoonoses, Secretaria de Saúde e Higiene Pública. Boletins mensais das atividades de controle da leishmaniose visceral. Araçatuba, 1999-2004). Tal resultado é influenciado pela maior freqüência de ações de controle desenvolvidas nesses locais em decorrência dos casos humanos, resultando em maior taxa de eutanásia. Porém, o aumento da população canina mais jovem pode resultar em aumento da susceptibilidade destes cães à leishmaniose visceral, mantendo a doença na área. Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro, 24(4):927-932, abr, 2008 930 Andrade AM et al. Figura 2 Número de cães eutanasiados e existentes no período de 1994 a 2004 na área urbana de Araçatuba, São Paulo, Brasil. Figura 3 Porcentagem de animais de até dois anos de idade nos diferentes setores do Município de Araçatuba, São Paulo, Brasil, em 2004. São Paulo Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro, 24(4):927-932, abr, 2008 33% a 38% 38% a 46% 46% a 54% 54% a 62% 62% a 68% ESTUDO DESCRITIVO DE UMA ESTRUTURA POPULACIONAL CANINA 931 Conclui-se que a ocorrência de raiva e leishmaniose visceral influenciou na estrutura e composição da população canina da área urbana de Araçatuba, em decorrência das ações de controle aplicadas ao reservatório canino. Resumo Colaboradores No período de 1994 a 2004, a população canina de Araçatuba, São Paulo, Brasil, registrou duas importantes zoonoses: a raiva e a leishmaniose visceral. Analisaram-se as mudanças ocorridas nessa população durante esse período, utilizando resultados de censos caninos e de coletas censitárias de sangue realizados em 1994, 1999 e 2004. A relação cão/10 habitantes variou significativamente, passando de 1,7 em 1994 para 2,0 em 1999 e para 1,8 em 2004. A porcentagem de cães com até um ano de idade passou de 20% para 32,5% e o número de eutanásias realizadas também aumentou após 1999, com a introdução da leishmaniose visceral. O número de cães e a estrutura etária variaram nos diversos setores do município e aqueles com maior porcentagem de animais com até dois anos de idade apresentaram maior ocorrência de casos de leishmaniose visceral humana e canina. Tais resultados decorrem de ações de controle adotadas nos setores com casos humanos de leishmaniose visceral, porém, o aumento da população canina mais jovem pode resultar em aumento da susceptibilidade destes cães à doença, favorecendo a manutenção da mesma na área. A. M. Andrade contribuiu na coleta de dados, análise e interpretação dos resultados e elaboração do manuscrito. S. H. V. Perri colaborou na análise maior foco. No Brasil e no mundo os dados epidemiológicos demonstram que a epidemia avançou acometendo grupos sociais mais vulneráveis, estando os idosos entre estes 1,2. A expansão da AIDS, apesar das campanhas preventivas, é apontada em pesquisas como consequência de mudanças comportamentais impulsionadas pelo fenômeno da globalização, da massificação da notícia e da relativização de valores 5,6. É dito, ainda, que o aumento da infecção em idosos se deve a não assimilação/ adoção por parte desta população das medidas para o sexo seguro. Atualmente, medicamentos Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro, 29(10):2131-2135, out, 2013 CARACTERIZAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA DOS CASOS DE AIDS 2133 Tabela 1 Distribuição dos casos de AIDS em pessoas com 60 anos ou mais, segundo as Gerências Regionais de Saúde (GERES) de Pernambuco, Brasil, 1998 a 2008. GERES 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 Total % I 12 11 9 15 21 15 20 27 18 15 20 183 62,5 II 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 2 0,7 III 0 1 1 0 0 0 0 0 1 0 0 3 1,0 IV 0 1 1 0 3 1 0 3 2 4 2 17 5,8 V 0 0 0 1 1 0 0 0 1 0 0 3 1,0 VI 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0,3 VII 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0,3 VIII 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 3 1,0 IX 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 2 0,7 X 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0,3 XI 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0,0 Pernambuco 12 14 12 16 26 17 20 32 25 19 23 216 73,7 Ignorado 0 0 9 8 10 7 7 2 15 19 0 77 26,3 Total 12 14 21 24 36 24 27 34 40 38 23 293 100,0 Fonte: Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN), 2010. Figura 1 Incidência dos casos de AIDS por 100 mil habitantes em pessoas com 60 anos ou mais, segundo ano de diagnóstico. Pernambuco, Brasil, 1998 a 2008. Fonte: Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN), 2010. que inibem a impotência sexual e a reposição hormonal fazem com que os idosos passem a ter uma vida sexual mais ativa, não utilizando, contudo, medidas preventivas por não se sentirem vulneráveis 6. Pesquisas brasileiras constatam o aumento de casos de AIDS em pessoas com menor escolaridade 7,8,9,10,11, ficando esta condição demonstrada neste estudo. A via heterossexual foi a categoria de maior expressão, reforçando que a prática sexual, sem proteção, constitui a mais importante via de transmissão também entre os idosos, denotando a necessidade de abordagens para o sexo seguro também para esta faixa etária. Chama a atenção o fato de não ter havido nenhum caso de UDI entre os idosos deste trabalho. Possivelmente, assumindo erroneamente que es- Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro, 29(10):2131-2135, out, 2013 2134 Silva MM et al. Tabela 2 Distribuição dos casos de AIDS em pessoas com 60 anos ou mais, segundo sexo, anos de estudos e categoria de exposição. Pernambuco, Brasil, 1998 a 2008. Variáveis 60-69 n% Faixa etária (anos) 70-79 80 e mais n%n% Sexo Masculino 159 54,2 33 11,3 Feminino 74 25,3 18 6,2 Anos de estudos Nenhum 19 6,4 3 1,0 1-3 38 13,0 6 2,1 4-7 28 9,5 7 2,4 8-11 21 7,1 2 0,7 12 e mais 20 6,8 3 1,0 Ignorado 107 36,5 30 10,2 Categoria de exposição Homossexual 15 5,1 3 1,0 Bissexual 10 3,4 2 0,7 Heterossexual 108 36,9 19 6,5 UDI 0 0,0 0 0,0 Ignorado 100 34,2 27 9,2 Total 233 79,5 51 17,4 UDI: usuários de drogas injetáveis. Fonte: Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN), 2010 3 6 1 1 2 0 1 4 2 0 4 0 3 9 1,0 2,0 0,3 0,3 0,7 0,0 0,3 1,4 0,7 0,0 1,4 0,0 1,0 3,1 Total n% 195 66,5 98 33,5 23 7,8 45 15,4 37 12,6 23 7,8 24 8,2 141 48,1 20 6,8 12 4,1 131 44,7 0 0,0 130 44,4 293 100,0 se grupo não é passível de tal comportamento, os profissionais de saúde não tenham investigado essa prática (no presente ou no passado) nessa população, embora seja essa abordagem um fator importante na investigação epidemiológica do caso 10,11. A ausência de casos em alguns anos deste estudo pode refletir a falta de diagnóstico, a subnotificação, atraso na investigação, denotando, todavia, baixa qualidade da informação coletada, sendo este um dos principais problemas da vigilância epidemiológica 12. Considerações finais O envelhecimento para ser experiência positiva exige independência e qualidade de vida, concebendo o exercício da sexualidade como natural e, portanto, inerente a essa população. A incidência de AIDS na população estudada faz supor que as campanhas de prevenção sobre HIV/AIDS e outras DST, até então realizadas, não estão atingindo eficazmente essa população. Faz-se necessário que campanhas específicas sejam pensadas e que os serviços de saúde abordem essa temática durante as consultas de rotina em atendimento aos idosos, possibilitando a prevenção primária. Para isso, é preciso capacitar profissionais, não só os envolvidos com a vigilância epidemiológica, mas, especificamente, os que assistem aos pacientes, para que atentem sobre a importância da informação. A confiabilidade, completude e atualização dos dados de notificação melhoram a qualidade e privilegiarão as tomadas de decisões. Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro, 29(10):2131-2135, out, 2013 CARACTERIZAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA DOS CASOS DE AIDS 2135 Resumen Colaboradores Se están produciendo cambios en el escenario mundial durante los últimos años, debido a la reducción de las tasas de fecundidad y mortalidad, y como resultado, la longevidad se presenta como un fenómeno real. Durante la madurez, la sexualidad viene asociada a prejuicios más diversos. Este estudio caracteriza los casos de SIDA en personas de 60 años o más que vivían en el estado de Pernambuco, Brasil, y que se notificaron al Departamento de Salud de Pernambuco entre el 1 enero 1998 al 31 diciembre 2008. Se realizó un estudio transversal/ datos descriptivos con información del Sistema de Notificación de Resultados. En 1998, la tasa de incidencia del SIDA en la población estudiada fue de 1,6 casos por cada 100 mil habitantes, elevándose a 4,8 casos/100 mil habitantes en 2008, con un incremento del 200%. Es evidente la necesidad de desarrollo de la prevención, el diagnóstico y la asistencia dirigida específicamente a las personas mayores, ya que la sexualidad esa etapa de la vida, sigue rodeada de muchos tabúes y mitos. M. M. Silva, A. L. R. Vasconcelos e L. K. N. P. Ribeiro contribuíram na concepção do desenho, análise e interpretação dos dados, redação do artigo, e elaboraram e fizeram todas as correções necessárias até a aprovação da versão final. Agradecimentos Agradecemos ao Departamento de Saúde Coletiva, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz e ao Núcleo de Epidemiologia da Secretaria Estadual de Saúde de Pernambuco, pelo incentivo à pesquisa e ao fornecimento de dados. VIH; Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida; Envejecimiento de la Población Referências 1. Brito A, Castilho E, Szwarcwald C. AIDS e infecção pelo HIV no Brasil: uma epidemia multifacetada. Rev Soc Bras Med Trop 2001; 34:207-17. 2. Ministério da Saúde. Curso básico de vigilância epidemiológica. Brasília: Ministério da Saúde; 2005. 3. Barbosa LM. A dinâmica da epidemia de AIDS nas regiões nordeste e sudeste [Tese de Doutorado]. Belo Horizonte: Universidade Federal de Minas Gerais; 2001. 4. Rede Interagencial de Informação para a Saúde. Indicadores básicos para a saúde no Brasil: conceitos e aplicações. 2a Ed. Brasília: Organização PanAmericana da Saúde; 2008. 5. Grangeiro A, Escuder M, Castilho E. Magnitude e tendência da epidemia de AIDS em municípios brasileiros de 2002-2006. Rev Saúde Pública 2010; 44:430-40. 6. Rodrigues LCB. As vivências da sexualidade de idosos [Dissertação de Mestrado]. Rio Grande: Universidade Federal do Rio Grande; 2008. 7. Rique J, Pinto KM. Perfil epidemiológico dos pacientes HIV/AIDS que abandonaram a terapia retroviral [Monografia de Graduação]. Recife: Faculdade de Enfermagem Nossa Senhora das Graças, Universidade de Pernambuco; 2001. 8. Rodrigues Jr. A, Castilho E. A epidemia de AIDS no Brasil, 1991-2000: descrição espaço-temporal. Rev Soc Bras Med Trop 2004; 37:312-7. 9. Pottes F, Brito A, Gouveia G, Araújo C, Carneiro R. AIDS e envelhecimento: características dos casos com idade igual ou maior que 50 anos em Pernambuco, de 1990 a 2000. Rev Bras Epidemiol 2007; 10:338-51. 10. Toledo L, Maciel E, Rodrigues L, Tristão-Sá R, Fregona G. Características e tendência da AIDS entre idosos no Estado do Espírito Santo. Rev Soc Bras Med Trop 2010; 43:264-7. 11. Perez B, Gasparini S. A vivência do idoso no processo de envelhecer e o HIV/AIDS: uma reconstrução dupla com suas possibilidades e limites. J Bras AIDS 2005; 6:106-9. 12. Gonçalves V, Kerr L, Mota R, Mota J. A Estimativa de subnotificação de casos de AIDS em uma capital do Nordeste. Rev Bras Epidemiol 2008; 11:356-64. Recebido em 06/Nov/2012 Versão final reapresentada em 10/Mai/2013 Aprovado em 05/Jun/2013 Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro, 29(10):2131-2135, out, 2013
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