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Ao Senhor Jesus, por me capacitar. “Com a força que Cristo me dá, posso enfrentar qualquer situação” Fp 4.13

Aos meus primos, Tetelo (in memorian) e Leo (in memorian),

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Ao Gustavo, pela oportunidade, pela orientação neste trabalho, por partilhar do seu convívio científico e, principalmente, pelo apoio, amizade e respeito.

À Márcia pela orientação segura, interessada e participativa; pela confiança em mim depositada e por poder contar com sua amizade.

A Painho e Mainha, pelo amor e incentivo constante. Amo vocês.

Aos meus irmãos, Rogério e Régia. Presentes de Deus na minha vida.

Aos meus tios Otaviano e Risolda, por me adotarem como filha.

À minha prima e irmã Cláudia, pelas boas risadas.

Às amigas Raquel, Fabiana, Monisa, Karla e Patrícia, sempre presentes. Mulheres de Deus.

A Gilma, Salete e Jaime Neto, família que me acolheu. Amo vocês.

A Germano, Leandro e Otidene, pela amizade e companheirismo.

À Robertinha, pela amizade e por estar sempre pronta a me ajudar.

Aos amigos Sandra e Rui Fraga, pelo apoio e incentivo.

A Douglas Silva. Minha grande admiração.

Aos amigos Marconi, Josenilton e Janine, pela amizade e disponibilidade.

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Aos colegas e amigos da Embrapa Agroindústria Tropical: Kênya, Alex, Manoel, Érica, Marcos, Lúcia, Henriette, Edy, Socorro, Laura, Renato, Arthur e Déborah.

Ao Prof. Lindbergue Crisóstomo, pelo profissionalismo, competência e infinita paciência em me ajudar, e por permitir o uso do Laboratório de Solos e Água.

Aos funcionários do Laboratório de Solos e Água, pela disponibilidade.

Ao Fernando Abreu, pela prontidão em me ajudar e pelo exemplo de profissional.

Ao pesquisador Fernando Aragão, pela contribuição no estudo estatístico dos meus resultados.

Ao Prof. Benvindo e ao Carlos Henrique do CEFET-CE, pela parceria.

Aos professores Everaldo Silvino, Gorete Macedo, Roberta Targino e Sônia Couri, pela disposição em discutir o projeto e por seus questionamentos, contribuindo para esta forma final da dissertação.

A Euzamar e Medeiros, da Secretaria do PPGEQ, pelo atendimento correto e atencioso que sempre me dispensaram.

A todos os colegas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

Ao Wander e à Cooperativa do Jangurussu, pelo empenho na coleta das amostras, que foram fundamentais para realização deste trabalho.

À Embrapa Agroindústria Tropical, em cujas dependências realizei esta dissertação.

À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pela oportunidade e condições oferecidas durante a realização do curso.

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Graduação em Engenharia Química, Área de Concentração: Engenharia de Processos, Sub-área de Concentração: Alimentos e Biotecnologia, Natal/RN, Brasil.

Orientadora: Profa. Dra. Márcia Regina da Silva Pedrini Co-orientador: Dr. Gustavo Adolfo Saavedra Pinto

Resumo

A utilização do líquido da casca de coco verde (LCCV) em fermentação surgiu como uma alternativa ao aproveitamento de um efluente, rico em açúcares fermentáveis, liberado pelas usinas de beneficiamento da casca de coco verde. A primeira fase deste trabalho foi avaliar o potencial fermentativo do líquido da casca de coco verde através da fermentação natural do líquido. Por não possuir informação disponível na literatura e pela dificuldade de se trabalhar com um efluente orgânico, a segunda fase foi realizar a caracterização do líquido e a elaboração de um meio sintético, para melhor explorar seu potencial como diluente em bioprocessos. A terceira fase, estudar a influência de taninos iniciais condensados e hidrolisáveis em fermentação alcoólica. A última fase foi dividida em três etapas, na qual se avaliou a influência da quantidade de inóculo no processo fermentativo; a influência da fonte de carbono e do uso de LCCV como diluente; a temperatura; a agitação e, finalmente, o estudo comparativo entre o LCCV in natura e sintético, nas condições ótimas de processo.

Para a caracterização foram realizadas análises físico-químicas do LCCV, bem como os teores de DQO, DBO e série de sólidos. As fermentações foram realizadas em biorreator de bancada, com volume de trabalho de 5L, Saccharomyces cerevisiae e 0,30% de óleo de soja como

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Palavras-chave: LCCV, Saccharomyces cerevisiae, Fermentação alcoólica.

BANCA EXAMINADORA:

Presidente: Profa. Dra. Márcia Regina da Silva Pedrini (DEQ/UFRN)

Membros: Dr. Gustavo Adolfo Saavedra Pinto (pesquisador - EMBRAPA/CE) Profa. Dra. Gorete Ribeiro de Macedo (DEQ/UFRN)

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The liquid of the rind of green coconut (LCCV), an effluent stream from the industrial processing of green coconut rind, is rich in sugars and is a suitable feedstock for fermentation. The first step of this study was to evaluate the potential of natural fermentation of LCCV. As the literature did not provide any information about LCCV and due to the difficulty of working with such an organic effluent, the second step was to characterize the LCCV and to develop a synthetic medium to explore its potential as a bioprocess diluent. The third step was to evaluate the influence of initial condensed and hydrolysable tannins on alcoholic fermentation. The last step of this work was divided into several stages: in particular to evaluate (1) the influence of the inoculum, temperature and agitation on the fermentation process, (2) the carbon source and the use of LCCV as diluent, (3) the differences between natural and synthetic fermentation of LCCV, in order to determine the best process conditions. Characterization of LCCV included analyses of the physico-chemical properties as well as the content of DQO, DBO and series of solids. Fermentation was carried out in bench-scale bioreactors using Saccharomyces cerevisiae as inoculum, at a working volume of 5L

and using 0.30% of soy oil as antifoam. During fermentations, the effects of different initial sugars concentrations (10 - 20%), yeast concentrations (5 and 7.5%), temperatures (30 - 50°C) and agitation rates (400 and 500 rpm) on pH/sugars profiles and ethanol production were evaluated. The characterization of LCCV demonstrated the complexity and variability of the liquid. The best conditions for ethanol conversion were (1) media containing 15% of sugar; (2) 7.5% yeast inoculum; (3) temperature set point of 40°C and (4) an agitation rate of 500 rpm, which resulted in an ethanol conversion rate of 98% after 6 hours of process. A statistical comparison of results from natural and synthetic fermentation of LCCV showed that both processes are similar.

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Resumo ...v

Sumário... viii

Lista de Figuras... xiii

Lista de tabelas ... xvii

Nomenclatura... xviii

Capítulo 1...1

Introdução Geral ...1

Capítulo 2...5

Aspectos teóricos ...5

2.1. Melaço da cana-de-açúcar...6

2.2. Leveduras ...6

2.3. LCCV ...8

2.4. Fermentação alcoólica...10

2.5. Sistema em batelada...12

2.5.1. Temperatura...12

2.5.2. pH do meio de cultivo ...13

2.6. Taninos...14

Capítulo 3...16

Estado da arte...16

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4.1 Microrganismo ...21

4.2 Matérias-primas...21

4.2.1 Melaço ...21

4.2.2 Líquido da Casca de Coco Verde...21

4.3 Fluxograma Experimental...21

4.4 Avaliação da fermentação natural do líquido da casca de coco verde ...22

4.5 Caracterização do líquido da casca de coco verde...23

4.6 Elaboração do LCCV sintético ...24

4.7 Avaliação da influência de taninos iniciais condensados e hidrolisáveis em

diferentes concentrações de açúcares...24

4.8 Fermentação em biorreator de bancada ...25

4.8.1 Influência da quantidade de inóculo e de açúcares no processo

fermentativo...26

4.8.2 Influência da fonte de carbono e do uso de LCCV como diluente no

processo fermentativo...26

4.8.3 Influência da agitação no processo fermentativo ...27

4.8.4 Influência da temperatura no processo fermentativo ...27

4.8.5 Estudo comparativo entre o LCCV sintético e

in natura

em condições

ótimas de processo...27

4.9 Determinações analíticas...27

4.9.1 Métodos analíticos empregados na caracterização do LCCV...27

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4. 9.1.6 Amônia total...29

4. 9.1.7 Nitrito ...29

4. 9.1.8 Nitrato...29

4. 9.1.9 Determinação de Nitrogênio ...30

4. 9.1.10 Determinação de açúcares redutores...30

4. 9.1.11 Determinação de açúcares redutores totais ...31

4. 9.1.12 Fenólicos totais...31

4. 9.1.13 Taninos condensados...31

4. 9.1.14 Digestão nitroperclórica ...32

4. 9.1.15 Determinação de Fósforo ...32

4. 9.1.16 Determinação de Sódio e Potássio ...32

4. 9.1.17 Determinação de Cálcio e Magnésio...32

4. 9.1.18 Determinação de Cobre, Ferro, Manganês e Zinco ...33

4. 9.1.19 Determinação de Enxofre...33

4.9.2 Métodos analíticos empregados no processo fermentativo...33

4.9.2.1 Determinação de açúcares redutores totais ...33

4.9.2.2 Determinação de etanol...34

4.9.2.3 Determinação de cor durante a fermentação natural do LCCV....35

4.9.2.4 Caracterização e quantificação da população fúngica durante o

processo fermentativo natural do LCCV...35

4.9.2.5 Determinação de células viáveis ...36

4.9.2.6 Determinação de biomassa...36

4.9.2.7 Determinação de fenólicos totais ...36

4.9.2.8 Determinação dos parâmetros de fermentação ...37

4.10 Estudo estatístico...38

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5.1 Fermentação natural do LCCV em garrafinhas de polietileno ...40

5.2 Avaliação da influência de taninos iniciais condensados e hidrolisáveis em

diferentes concentrações de açúcares na fermentação alcoólica ...46

5.3. Caracterização do Líquido da Casca do Coco Verde ...49

5.4 Elaboração do LCCV sintético ...53

5.5 Influência da quantidade de inóculo no processo fermentativo...54

5.6 Influência da fonte de carbono e do uso de LCCV como diluente no

processo fermentativo ...56

5.7 Influência da agitação no processo fermentativo...59

5.8 Influência da temperatura no processo fermentativo...60

5.9 Estudo comparativo entre o LCCV in natura e o LCCV sintético ...62

5.9.1 Concentração de açúcar...63

5.9.2 Concentração de etanol...64

5.9.3 pH ...65

5.9.4 Células viáveis e totais ...66

5.9.5 Biomassa...67

5.9.6 Fenólicos totais...68

5.9.7 Parâmetros cinéticos...68

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Referências bibliográficas ...72

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“L” e -60 a +60 para as demais variáveis. ...44 Figura 5.6 - Fermentação natural do LCCV em garrafinhas de polietileno durante os dez dias de fermentação...45 Figura 5.7 - Concentração de grupos fenólicos totais durante a fermentação natural do LCCV.

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levedura, em diferentes concentrações de açúcar, diluídos em água (a) e LCCV sintético (b), respectivamente. Temperatura 30°C e agitação de 500 rpm. ...58 Figura 5.15 - Velocidade de formação de etanol nas fermentações inoculadas com 7,5% de levedura, em diferentes concentrações de açúcar, diluídos em água (a) e LCCV sintético (b), respectivamente. Temperatura a 30°C e agitação de 500 rpm.58Figura 5.16 - Consumo de açúcares (a) e concentração de etanol (b) no processo fermentativo em sistemas submetidos a diferentes agitações...59 Figura 5.17 - Eficiência de conversão e velocidade de formação de etanol no processo fermentativo em sistemas submetidos a diferentes agitações...60 Figura 5.18 - Concentração de etanol e de açúcares no processo em sistemas submetidos a diferentes temperaturas...61 Figura 5.19 - Eficiência de conversão e velocidade de formação de etanol no processo em sistemas submetidos a diferentes temperaturas. ...61 Figura 5.20 - Estudo comparativo entre o LCCV in natura (a) e sintético (b) nas condições

ótimas de processo: 150 g.L-1 de açúcar, 7,5% de levedura, 500 rpm e 40°C. ...62 Figura 5.21 - Concentração de açúcares da fermentação, durante o estudo comparativo entre LCCV in natura e sintético, nas condições ótimas de processo. Desvio-padrão da triplicata de

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comparativo entre LCCV in natura e sintético, nas condições ótimas de processo. Desvio-padrão da triplicata de cada diluente. ...64 Figura 5.25 - Concentração de biomassa da fermentação, durante o estudo comparativo entre LCCV in natura e sintético, nas condições ótimas de processo. Desvio-padrão da triplicata de

cada diluente. ...67 Figura 5.26 - Concentração de fenólicos na fermentação, durante o estudo comparativo entre LCCV in natura e sintético, nas condições ótimas de processo. Desvio-padrão da triplicata de

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LCCV Líquido da Casca do Coco Verde

T Temperatura

DBO Demanda Bioquímica de Oxigênio

BQO Demanda Química de Oxigênio

UFC Unidade Formadora de Colônias

rpm Rotações por minuto

ART Açúcares Redutores Totais

C1 Concentração de açúcares do melaço (g.L-1)

C2 Concentração de açúcares do mosto (g.L-1)

V1 Volume de melaço

V2 Volume do mosto de fermentação

Ef Eficiência de conversão do processo

P0 Peso inicial do sistema (Kg)

Pf Peso final do sistema (Kg)

S0 Concentração de substrato inicial (g.L-1)

a* Contribuição de vermelho

b* Contribuição de amarelo

L* Luminosidade

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Capítulo 1

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A importância econômica da indústria alcooleira no Brasil está intimamente ligada à indústria açucareira, pois o álcool era praticamente um subproduto desta indústria. Sendo estas as primeiras indústrias manufatureiras implantadas no país, existem em todos os estados e sua produção é muito elevada.

Apesar de ser lembrado como resposta do Brasil às crises do petróleo, o álcool anidro era usado desde os anos 30 como aditivo na gasolina brasileira. Na busca de autonomia energética, o país desenvolveu o Programa Nacional do Álcool (Proálcool) e o pioneiro carro a álcool. Hoje, o Brasil produz cerca de 13 bilhões de litros/ano. Aproximadamente três milhões de veículos são movidos a álcool hidratado, consumindo 4,9 bilhões de litros/ano. Usa-se álcool anidro na proporção de 25%, como aditivo para a gasolina. De 1980 para cá, registrou-se uma economia de US$ 1,8 bilhão por ano, com a substituição pelo álcool, do equivalente a 200 mil barris de gasolina/dia (UNICA,2004). Dada a importância que o álcool representa para o nosso país, e por se tratar de um produto renovável e limpo, que contribui para a redução do efeito estufa e diminui substancialmente a poluição do ar, existe um grande interesse do Brasil em desenvolver e melhorar técnicas de produção de álcool por via fermentativa.

O setor sucroalcooleiro do Brasil tem um diferencial ambiental positivo, representado pela produção do álcool etílico, combustível limpo e renovável, oriundo da cana-deaçúcar. A utilização extensiva do álcool etílico como combustível automotivo no Brasil, seja em mistura de 25% com a gasolina, como combustível dos veículos equipados com motor a álcool ou, ainda, nos recentemente lançados veículos com tecnologia flex fuel que operam com gasolina,

álcool ou qualquer mistura desses combustíveis, confere ao país liderança no cenário internacional quanto ao seqüestro de carbono e à mitigação do efeito estufa (Macedo at al, 2004).

O consumo crescente de água de coco verde, in natura ou industrializada, vem

acompanhado de expressivo aumento de resíduos, constituídos basicamente pela casca fibrosa, que corresponde a 85% do fruto (Araújo et al., 2004). A área de produção de

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processo de prensagem da unidade-piloto é, em média, 15 m3/dia, podendo chegar a 20 m3/dia em períodos de produção intensa. Uma alternativa à redução da carga orgânica deste efluente é a utilização deste líquido como base de diluição em processos fermentativos.

Existe uma grande preocupação em reduzir os custos de produção industrial de álcool. Sabendo que os custos com matéria-prima correspondem a 55-75% do custo do produto, a produção de álcool utilizando matérias-primas de baixo custo tem se tornado uma importante área de investigação. O melaço é um substrato rico em açúcares diretamente fermentescíveis, sendo utilizado para correções de mosto, através de diluição. Desta forma, a utilização do líquido da casca de coco verde (LCCV), efluente proveniente do beneficiamento da casca de coco verde, como base para diluição de melaços, surgiu como uma alternativa. Este visa a minimização dos custos de produção do processo fermentativo, o aproveitamento deste resíduo e, assim, viabilizar o pleno funcionamento de unidades benefeciadoras da casca de coco verde.

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2.1. Melaço da cana-de-açúcar

O melaço é muito utilizado como matéria-prima na fermentação alcoólica por razões econômicas e, a eficiência do processo depende da utilização de linhagens específicas de leveduras. A sacarose é hidrolisada pela invertase da levedura à glicose e frutose, e estes monossacarídeos são substratos utilizados pela levedura para fermentação (Takeshige et al.,

1995).

O melaço da cana-de-açúcar é o líquido que se obtêm como resíduo de fabricação do açúcar cristalizado. Sua composição é muito variável, e depende da qualidade da cana-de-açúcar e do método de fabricação. De maneira geral possui, aproximadamente, 19% de água, 57% de açúcares, 8% de cinzas, 8% de materiais nitrogenados e 27% de outros, como gomas e ácidos. Nas frações de açúcares distinguem-se 32% de sacarose, 37% de dextrose, além de levulose, podendo-se afirmar que o melaço é um sub-produto com teores de açúcares diretamente fermentescíveis próximos a 50% (Campos, 2007).

2.2. Leveduras

As leveduras são os microrganismos mais importantes na obtenção do álcool por via fermentativa. Bactérias, entre as quais a Zymomonas mobilis, são tidas como capazes de

produzir etanol, mas, economicamente, as leveduras do gênero Saccharomyces são os agentes

largamente usados (Lima et al, 2001).

As leveduras são fungos unicelulares, e muitos deles são classificados como Ascomicetos. As células de levedura são geralmente esféricas, ovais ou cilíndricas, e sua divisão celular geralmente se dar por brotamento. As leveduras geralmente são encontradas em habitats onde os açúcares estão presentes, tais como frutos, flores, casca de árvores e etc (Madigam et al, 1997).

As espécies mais usadas na produção industrial de álcool e aguardentes são os

Saccharomyces cerevisae e Saccharomyces uvarum (Borzani, 2001).A cepa selecionada deve

crescer bem, produzir grande quantidade de etanol e apresentar uma alta tolerância ao produto sintetizado (Pelczar Jr, 1996).

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parte é convertida em etanol e CO2 em anaerobiose, processo denominado fermentação alcoólica (Lima, Basso e Amorim, 2001). Em condições aeróbicas, o metabolismo da levedura, leva a uma maior produção de moléculas de ATP por unidade de glicose, favorecendo a produção de biomassa (Moraes, 2001).

O objetivo principal da levedura, ao metabolizar anaerobicamente o açúcar, é gerar energia, sob a forma de ATP, que será empregada na relação de diversos trabalhos fisiológicos (absorção, excreção e outros) e biossíntese, necessários à manutenção da vida, crescimento e multiplicação. O etanol e o CO2 resultantes se constituem, tão somente, de produtos de excreção, sem utilidades metabólicas para a célula em anaerobiose (Lima, Basso e Amorim, 2001).

Maiores concentrações de leveduras permitem fermentações mais rápidas, com maior produtividade e maior controle das bactérias contaminantes, além de restringir o crescimento da própria levedura. Por outro lado, elevado teor de levedura exige energia de manutenção maior, isto é, maior consumo de açúcar para manter as células vivas. Como conseqüência, resulta em maior competição pelos nutrientes do meio, minerais e vitaminas, diminuindo a viabilidade do fermento. Daí existir um teor ótimo de levedura na dorna, dependendo das condições do processo industrial (Lima, Basso e Amorim, 2001).

As leveduras comerciais de hoje são provavelmente muito diferentes das linhagens selvagens, por terem sido grandemente aperfeiçoadas ao longo dos anos através de seleções cuidadosas e manipulação genética por microbiologistas industriais (Madigam et al, 1997).

O poder fermentativo de uma levedura pode ser expresso em termos de quantidade de açúcar que ela degrada, numa dada temperatura, em uma unidade de tempo, por quantidade de células (Jorgensen, 1939).

Com o progresso da tecnologia de bebidas, as linhagens de levedura foram sendo selecionadas segundo características desejáveis ao processo e ao produto. A produtividade e a eficiência de fermentação, a tolerância ao etanol e à temperatura, a resistência às altas concentrações de açúcares, a habilidade de flocular e de produzir ou não certos componentes do aroma das bebidas e a propriedade de produzir metabólitos anti-contaminantes são constantes fontes de interesse (Hammond, J.R.M. apud Ribeiro et al, 1999).

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ácido succínico pela levedura, esta não exerce ação antagônica às bactérias e, no transcorrer dos reciclos fermentativos, inviabiliza a utilização prática do ácido benzóico nas fermentações correntes.

Takeshige et al. (1995) estudaram os efeitos da invertase de Saccharomyces cerevisiae

em fermentação alcoólica a base de melaço e observou que alta pressão osmótica é um importante fator de depreciação da fermentação.

Segundo Zech et al (1995), a inativação da invertase pelo etanol é a principal razão pela limitada concentração de etanol produzida nos processos de fermentação industrial a base de melaço.

2.3. LCCV

O Líquido da casca de coco verde (LCCV) é um resíduo proveniente do beneficiamento da casca do coco verde para aproveitamento das frações de fibra e entre-fibra (pó), que constitue a parte sólida desta matéria-prima, conforme pode ser observada no esquema apresentado na Figura 2.1 e na foto do equipamento (Figura 2.2). O nível de informação disponível na literatura científica sobre o LCCV, até então, é nulo. No entanto, análises preliminares identificaram a presença de açúcares fermentescíveis, compostos fenólicos, cátions (cálcio, magnésio, potássio e sódio) e ânions (cloreto, bicarbonato e sulfato), além de elevados valores de DQO e DBO.

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Figura 2.1 - Etapas do sistema de processamento da casca de coco verde. TRITURAÇÃO

PRENSAGEM

CLASSIFICAÇÃO POR PENEIRAS PÓ

FIBRA

EFLUENTE Casca do Coco Verde

Casca Triturada Úmida

Casca Triturada Seca

( 3% (v/v))

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Figura 2.2 - Linha de processamento da casca do coco verde, instalada no desativado Aterro Sanitário do Jangurussu, em Fortaleza-CE. Seqüência de etapas do beneficiamento do coco: alimentação (I), trituração (II); prensagem (III) e classificação (IV).

2.4. Fermentação alcoólica

Processo fermentativo é definido atualmente como aquele em que substratos são convertidos em produtos de interesse, mediante a ação de microrganismos viáveis (Borzani, 2001).

A fermentação alcoólica é a mais importante forma de obtenção de álcool etílico. A fermentação alcoólica desenvolve-se por uma série de reações (Lima, 2001). Ela consiste, basicamente, na conversão de açúcar em álcool, no qual o resultado final pode ser expresso pela equação de Gay-Lussac.

C6H12O6 2 C2H5OH

+

2 CO2

(1)

I

II

III

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Como se pode observar na Equação (1), o fator estequiométrico é igual a 0,511, ou seja, cada grama de glicose convertida gera 0,511 g de etanol. A Saccharomyces cerevisiae,

normalmente empregada nesta fermentação, com freqüência permite obter um rendimento da ordem de 90% deste valor estequiométrico, o que torna este microrganismo o mais importante para realizar esta conversão, lembrando que vários outros também podem acumular etanol, a partir da glicose, porém não com rendimento tão elevado (Schmidell et al,

2001).

Um dos fatores que torna a produção de etanol por via fermentativa a forma mais econômica de obtenção é o grande número de matérias-primas naturais existentes em todo país. Sua ditribuição geográfica, que encerra diversos climas e tipos de solos, permite seu cultivo em quase todo o território e durante todo o ano (Lima, Basso e Amorim, 2001).

Numa fermentação alcoólica, pode-se distinguir uma fase preliminar, uma fase tulmutuosa e uma fase final ou complementar. A fase preliminar inicia-se no momento do contato do levedo com o mosto, e caracteriza-se por multiplicação celular intensa, pequena elevação de temperatura e pequeno desprendimento de dióxido de carbono. A fase tumultuosa caracteriza-se pelo desprendimento volumoso e intenso de dióxido de carbono, conseqüência da existência de um número suficiente de células para desdobrar os açúcares fermentescíveis do mosto; a temperatura eleva-se rapidamente, a densidade do mosto reduz-se e elevam-reduz-se as percentagens de álcool e a acidez. A fareduz-se complementar caracteriza-reduz-se pela diminuição da intensidade do desprendimento do dióxido de carbono, maior tranqüilidade no líquido e diminuição da temperatura; nesta fase a concentração de açúcares chega ao fim (Lima, 2001).

Enquanto existem condições aeróbias, os açúcares sofrem fermentação oxidante exotérmica produzindo H2O e CO2. À medida que o meio se torna menos aeróbico, os açúcares são hidrolisados e submetidos à fermentação etílica com a formação de CH3CH2OH e CO2 (CNPq, 1987).

Os componentes básicos, nutricionalmente importantes, são fonte de carbono, de nitrogênio, sais minerais, e em alguns casos, fatores de crescimento. A maioria dos processos biotecnológicos usa carbono e nitrogênio a partir de misturas complexas de produtos e subprodutos naturais de baixo custo, buscando resíduos e águas residuárias com boa composição e em disponibilidade (Moraes, 2001).

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acarreta-se menor crescimento do fermento e menor formação de glicerol por unidade de substrato. Entretanto, elevados teores de açúcar acarretam um estresse osmótico da levedura de tal sorte que existe, dependendo do processo de fermentação, uma faixa de concentração considerada ideal (Lima, Basso e Amorim, 2001).

A produção de etanol por via fermentativa é acompanhada pela formação de compostos como glicerol, ácido succínico e álcoois superiores. A presença de álcoois superiores é indesejável nas destilarias porque dificulta a obtenção do etanol puro (Gutierrez, 1993). Segundo Ayrapaa (1971), aumentando a disponibilidade de nitrogênio ocorreu redução na produção de álcoois superiores.

Embora a produção do etanol com concentrações elevadas de melaço esteja realmente sendo alcançada pela New Energy and Industrial Tecnology Development Organization (NEDO) no Japão, a produtividade de etanol, a 30ºC, é de apenas 1,3 g.L-1.h-1, (Morimura, S. et al, 1997).

2.5. Sistema em batelada

As fermentações descontínuas clássicas, ou simplesmente, fermentações descontínuas, vêm sendo utilizadas pelo homem desde a Antiguidade e, ainda hoje, são as mais empregadas para a obtenção de uma variedade de produtos fermentados. São também conhecidos por fermentação batelada ou processo descontínuo de fermentação (Borzani, 2001).

As grandes vantagens de sistemas em batelada estão em apresentarem menores riscos de contaminação e grande flexibilidade de operação.

2.5.1. Temperatura

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As leveduras são mesófilas e as temperaturas para produção industrial de álcool situam-se na faixa de 26-35ºC, com média de 30ºC (Lima, 2001). A temperatura ótima para uma espécie microbiana não é a temperatura mediana entre as temperaturas máxima e mínima, e sim a mais próxima do limite superior da variação de temperatura, porque a velocidade das reações enzimáticas aumenta com o aumento da temperatura até o ponto em que as enzimas são desnaturadas pelo calor e as células param de crescer (Pelczar, 1996).

À medida que a temperatura aumenta, aumenta a velocidade da fermentação, mas favorece a contaminação bacteriana, ao mesmo tempo que a levedura fica mais sensível à toxidez do etanol. Por outro lado, temperaturas elevadas permitem maior perda de etanol pela evaporação em dornas abertas. Tais aspectos justificam o controle da temperatura no processo industrial (Lima, Basso e Amorim, 2001).

Para uma redução dos custos de produção, Morimura (1997) relatou que o desenvolvimento de processos a altas temperaturas com altas concentrações de melaço era necessário. Utilizando linhagens de levedura termotolerantes e halotolerantes, previamente desenvolvidas, observou que em meios contendo 22% de melaço, em temperaturas acima de 33ºC, a concentração final de etanol foi maior que 90 g.L-1 e alcançou rendimento superior a 80%.

A temperatura é conhecida por afetar o metabolismo da levedura, e como resultado, a formação de metabólicos secundários como glicerol, ácido acético, ácido succínico, etc (Lafon-Lafourcade, 1983). Torija et al (2003) estudaram os efeitos da temperatura em linhagens de Saccharomyces cerevisiae e observaram que o tamanho da população máxima

foi similar em todas as temperaturas. Em baixas temperaturas (15 e 20ºC), as leveduras desenvolveram-se lentamente, com uma longa fase lag, mas permaneceram constantes durante a fermentação alcoólica. Entretanto, a altas temperaturas (35ºC) não houve nenhuma fase lag, e sim uma rápida fase exponencial e pequena fase estacionária, com uma grande redução de células viáveis.

2.5.2. pH do meio de cultivo

O pH é um parâmetro importante, afetando o crescimento celular e a formação de produto. Por sua importância, este é controlado em muitas fermentações (Wang et al, 1979).

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contaminantes, restringem a formação de novas células de leveduras, reduzem a produção de glicerol, consequenemente aumentando a eficiência de conversão a etanol. O controle de pH pode ser alcançado com a adição de soluções de ácido sulfúrico e / ou hidróxido de sódio.

2.6. Taninos

Taninos são compostos fenólicos hidrossolúveis comumente encontrados em tecidos vegetais, que têm a propriedade de se combinar com proteínas, celulose e pectina para formar complexos insolúveis.

A maioria dos fenólicos não é encontrada no estado livre na natureza, mas sob forma de ésteres ou de heterosídeos sendo, portanto, solúveis em água e em solventes orgânicos polares. Por serem fenólicos, os taninos são muito reativos quimicamente, formam pontes de hidrogênio, intra e intermoleculares. Estes compostos são facilmente oxidáveis, tanto através de enzimas vegetais específicas quanto por influência de metais, como cloreto férrico, o que ocasiona o escurecimento de suas soluções (Santos e Mello, 2003).

Taninos condensados e ácidos tânicos hidrolisáveis são as principais classes de taninos. Taninos hidrolisáveis consistem de um álcool poliédrico, em geral beta-D-glicose, esterificado com ácido gálico ou derivados, enquanto que taninos condensados, ou proantocianidinas, são compostos de flavonóides, e, diferentemente dos hidrolisáveis, não contêm resíduos de açúcares. As unidades monoflavonóides encontram-se unidas por ligações C-C que não podem ser degradadas por hidrólise (Pizzi, 1994)

Apesar das propriedades antimicrobianas dos taninos, muitos fungos, bactérias e leveduras são bastante resistentes e conseguem crescer e se desenvolver.

(34)
(35)
(36)

O Brasil, que sempre esteve na vanguarda da produção de açúcar, também ocupa uma posição de destaque como o primeiro país que produziu e utilizou biocombustíveis em sua frota automotiva (Andrieta et al., 2007).

No Brasil, as indústrias de açúcar e de álcool estiveram intimamente ligadas desde o tempo do descobrimento. Deduz-se que a produção de álcool iniciou na capitania de São Vicente, porque nela foi montado o primeiro engenho de açúcar do país, após a vinda das primeiras mudas de cana-de-açúcar, trazidas da Ilha da Madeira em 1532 (Lima, Basso e Amorim, 2001). Contudo, o Proálcool (Programa Nacional do Álcool) começou como uma resposta ao embargo às exportações de petróleo imposto pelos países do Oriente Médio em 1973. Nesta época, a dependência do país em relação ao petróleo importado nos tornava mais vulneráveis que o maior consumidor mundial desta matéria-prima, os Estados Unidos. Hoje, o Proálcool é considerado mundialmente um sucesso, sendo que toda a gasolina vendida no país contém 25% de etanol, além de uma frota de 3 milhões de veículos movidos exclusivamente por este combustível, bem como uma nova geração de motores capazes de utilizar tanto a mistura álcool/gasolina, quanto apenas o biocombustível (Grad, 2006).

A observação da natureza dos avanços tecnológicos na produção de etanol ao logo do período mostra que, nos anos iniciais, as preocupações foram centradas em aumentar a produção rapidamente (produtividades de equipamentos e processos), mesmo em detrimento de eficiência de conversão; isso pode ocorrer sempre que a política indutora force metas muito altas de implementação, com garantia de compra. Nos anos seguintes, os aumentos de eficiência passaram a ser mais importantes (mesmo porque as garantias de preços não foram mais observadas); e a terceira dessas “fases” foi o avanço em técnicas gerenciais da produção, que levou a grandes reduções de custo. O resultado global foi uma forte redução nos custos de produção, levando o etanol a uma situação em que praticamente não há necessidade de subsídios para competir com a gasolina, considerando o petróleo a preços acima de US$ 45 o barril (Macedo, 2007).

(37)

cada 1 kcal de energia consumida, há um ganho líquido de 2,24 kcal de etanol (Andreoli e de Souza, 2006).

A cana-de-açúcar é a principal matéria-prima para a produção em escala industrial de etanol no Brasil, sendo que para cada tonelada são obtidos 80L de caldo. A vasta extensão territorial brasileira permite que este seja o maior produtor desta cultura. Os 5,5 a 6,5 milhões de hectares representam algo em torno de 2,5% da área total cultivada no país. Podem ainda ser agregados a esta cultura mais 80 a 100 milhões de hectares dormentes, sem impactar os ecossistemas nativos e florestais (Grad, 2006; Andrieta et al., 2007).

O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar, seguido por Índia e Austrália. Em média, nas últimas cinco safras, 52% dessa produção destinou-se às fábricas de etanol (anidro e hidratado) e 48% às de açúcar (refinado, cristal e demerara). A cultura espalha-se pelo Centro-Sul e pelo Norte-Nordeste do País, em dois períodos de safra, ocupando 2,4% da área agricultável do solo brasileiro, perto de 5,5 milhões de hectares (UNICA, 2004).

Quase todas operam com equipamentos fabricados por empresas nacionais de bens de capital, cuja tecnologia permitiu ao país alcançar rendimento industrial invejável. Se destinada apenas à fabricação de álcool, cada tonelada de cana-de-açúcar moída resultaria hoje em 89 litros de etanol hidratado ou 85 litros de etanol anidro; direcionada exclusivamente à produção açucareira, renderia 118 kg de açúcar e 10 litros de álcool do mel residual. Entretanto, em regime normal de operação de mercado, o rendimento médio nacional para cada tonelada de cana-de-açúcar moída fornece 71 kg de açúcar, 42 litros de álcool ou 11,5 toneladas de açúcares totais recuperáveis por hectare de cana-de-açúcar cultivada (UNICA, 2004).

Quando o Proalcoól foi introduzido, a maioria das unidades de fermentação operava exclusivamente com o caldo de cana. Porém, atualmente todas as unidades produtoras incorporaram a produção de açúcar, que tem como subproduto o melaço. Este pode alcançar 90oBrix, com 60% deste total sendo açúcares redutores. Além dos carboidratos, possui outros compostos necessários ao metabolismo microbiano (Andrieta et al., 2007). Uma outra vantagem do melaço é a possibilidade de ser estocado por longos períodos sem depender de cadeia de frio, devido à baixa atividade de água em função do elevado teor de sólidos solúveis. Isto permite às unidades processadoras ampliar o seu período de operação.

Leveduras do gênero Saccharomyces são largamente usadas por esta indústria. Este

(38)

metabólica em meios com pH em torno de 4, conferem as linhagens de Saccharomyces serem

os principais agentes da fermentação alcoólica (Andrieta et al., 2007).

Duas particularidades estão associadas ao processo fermentativo empregado nas indústrias brasileiras. Primeiro, o caldo não recebe nenhum tratamento para a eliminação da microbiota natural. E por outro lado, a levedura escolhida para ser utilizada é propagada no início da safra e reciclada, batelada após batelada ao longo desta (Andrieta et al., 2007). Este processo de fermentação, comumente utilizado no Brasil, é conhecido como Melle-Boinot. As células de levedura recuperadas são recirculadas, mantendo elevada a concentração celular, e obtendo-se, assim, um aumento do rendimento alcoólico devido o menor consumo de açúcar para multiplicação e crescimento do agente fermentativo (Lopes, 1989). Hoje se tem conhecimento que a levedura inoculada no início da safra é substituída ao longo dos ciclos fermentativos por uma levedura selvagem. Essa substituição só foi perceptível com o advento de técnicas moleculares (Andrieta et al., 2007).

(39)

Capítulo 4

(40)

4.1 Microrganismo

Para este trabalho o microrganismo utilizado foi a levedura Saccharomyces cerevisiae,

fermento comercial liofilizado para massa salgada, da marca Fermipan.

4.2 Matérias-primas

4.2.1 Melaço

O melaço da cana-de-açúcar comercial, adquirido no mercado popular São Sebastião (Fortaleza-CE), foi utilizado como fonte de carbono no processo fermentativo.

4.2.2Líquido da Casca de Coco Verde

O LCCV foi obtido na unidade de beneficiamento instalada no Aterro Sanitário do Jangurussu, localizado no município de Fortaleza-CE.

4.3 Fluxograma Experimental

(41)

Figura 4.1 - Fluxograma experimental.

4.4 Avaliação da fermentação natural do líquido da casca de coco verde

Com o objetivo de avaliar a viabilidade de utilização do extrato da casca de coco verde em um processo fermentativo foram realizados testes preliminares, entre eles a fermentação natural do líquido da casca de coco verde em um sistema fechado.

O LCCV utilizado nesta etapa do trabalho foi proveniente da unidade-piloto de beneficiamento da própria Embrapa/CNPAT, que utiliza, em sua maioria, cocos cedidos pela

Fermentação natural do LCCV

Influência da quantidade de inóculo no processo fermentativo

Influência da fonte de carbono e do uso de LCCV como diluente no processo fermentativo

Estudo comparativo entre o LCCV in natura e LCCV sintético

Influência da agitação no processo fermentativo Influência da temperatura no processo fermentativo Fase I

Fase IV

Influência de taninos iniciais condensados e hidrolisáveis no processo fermentativo Fase III

Caracterização do LCCV

(42)

peneira de 0,3 mm de diâmetro de poro, para redução do número de partículas suspensas, e devidamente distribuído em garrafas de polietileno - PET.

A fermentação natural do LCCV foi realizada em sistema fechado, em garrafas de PET de 330 mL de volume com 240 mL de líquido (Figura 4.2), hermeticamente fechadas, e incubadas a 30º C por até 10 dias.

Figura 4.2. Fermentação natural do líquido da casca de coco verde em sistema fechado, em garrafas de PET.

As amostras foram analisadas a cada 24 horas. Foram avaliadas a produção de etanol, a concentração de açúcares redutores e açúcares totais, o perfil de pH, a concentração de fenólicos totais, cor e unidades formadoras de colônias (UFC) de bolores e leveduras. Cada amostra consistia da remoção aleatória de duas garrafas de PET, sendo o líquido fermentado centrifugado a 15.000 rpm por 10 minutos. O experimento foi realizado em duplicata.

4.5 Caracterização do líquido da casca de coco verde

(43)

serem analisadas. De forma a garantir a representatividade da caracterização, 3 amostras compostas foram coletadas em intervalos de aproximadamente 1 mês.

Para caracterização do líquido foram realizadas análises de pH, Condutividade Elétrica, Amônia Total, Nitrito, Nitrato, Nitrogênio Total, NTK, Fósforo Total, Ortofosfato Solúvel, Açúcares Redutores e Totais, Fenólicos Totais, Tanino Condensado, Sódio, Potássio, Cálcio, Magnésio, Fósforo, Enxofre, Cobre, Ferro, Manganês e Zinco, bem como teores de DQO, DBO e Série de Sólidos. Todas as análises foram realizadas em triplicata.

4.6 Elaboração do LCCV sintético

A proposta de elaborar o LCCV sintético se mostrou a melhor alternativa de se trabalhar com um efluente orgânico. A caracterização do líquido revelou sua complexidade e variabilidade. Uma tentativa de controlar essa variabilidade seria trabalhar com um efluente proveniente de um mesmo processamento, o que obrigaria a se dispor de grandes espaços para o congelamento do material, uma vez que o LCCV fermenta tanto em temperatura ambiente quanto sob refrigeração. Não obstante, a aparência do líquido, principalmente a cor, é alterada mesmo estando congelado, o que denuncia uma alteração física ou química em sua composição. Levando em conta problemas de logística, transporte e estocagem sob ambiente refrigerado, e a variabilidade do líquido, o meio sintético proporcionou um maior controle das variáveis do processo e fácil disponibilidade.

O LCCV foi elaborado a partir de 15 reagentes. Nitrato de sódio, nitrito de sódio, fosfato de sódio, glicose, sacarose, sulfato de magnésio, cloreto de potássio, sulfato de zinco, cloreto de cálcio, sulfato de manganês, sulfato de sódio e ácido tânico foram adquiridos da Vetec. A peptona adquirida da Fluka. Tanino condensado e sulfato ferroso amoniacal foram adquiridos da Labsynth.

4.7 Avaliação da influência de taninos iniciais condensados e hidrolisáveis

em diferentes concentrações de açúcares

(44)

avaliadas em um meio à base de sacarose comercial Alteza, utilizando S. cerevisiae como

agente fermentador.

Os testes foram realizados utilizando-se 100mL de meio em erlenmeyers de 500mL. As concentrações avaliadas foram de 5, 10, 15 e 20 g.L-1 de taninos condensados ou hidrolisáveis em 100, 150 e 200 g.L-1 de sacarose como fonte de carbono e 7,5% de levedura. Os meios foram incubados a 30º C por 8 horas, sem agitação em incubadora BOD, e analisados em intervalos regulares. A produção de etanol foi avaliada através da perda de massa do sistema. O experimento foi realizado em triplicata.

4.8 Fermentação em biorreator de bancada

Após corroborar a viabilidade da presença de taninos na fermentação alcoólica, deu-se início o estudo do processo fermentativo em um biorreator de bancada. O biorreator empregado, New Brunswinck Scientific Co., modelo Bioflo 3000, com capacidade nominal de 14 L, e volume de trabalho de 10 L. A placa superior é provida de orifícios, que permitem alimentação, inoculação e coleta de amostras, eletrodo de pH e termômetro. Através de um “display” digital é possível acompanhar e controlar os parâmetros do processo (Figura 4.3).

Figura 4.3. Fermentador de bancada

(45)

0,30%. As fermentações foram conduzidas em regime de batelada simples, com duração de 6 horas. Os meios não foram esterilizados.

4.8.1 Influência da quantidade de inóculo e de açúcares no processo fermentativo

Para conhecer melhor como a fermentação se comportaria, os primeiros parâmetros a serem estudados no biorreator foram a quantidade de inóculo (5,0 e 7,5% (p/v)) e a concentração de açúcar inicial (100, 150 e 200 g.L-1).

Para elaboração do mosto de fermentação (V2 = 5000 mL), primeiramente, avaliou-se a concentração do melaço (diluído aproximadamente 50%). Como a composição do melaço comercial é muito variável, para se certificar da real concentração de açúcares (C1), análises de açúcares redutores totais (ART) foram realizadas previamente. A partir deste resultado, através da Equação (2), calculava-se o volume de melaço (V1) necessário para alcançar a concentração de açúcar desejada (C2).

C

1

.V

1

= C

2

.V

2

(2)

Conhecido o volume de melaço, levando em conta a massa de levedura e de óleo de soja, encontrava-se então o volume de água necessário para completar os 5000 mL de meio.

A fermentação foi conduzida a 30°C e 500 rpm durante 6 horas de experimento. Em intervalos de 30 minutos foram avaliados concentração de etanol e perfil de pH.

4.8.2 Influência da fonte de carbono e do uso de LCCV como diluente no processo fermentativo

(46)

4.8.3 Influência da agitação no processo fermentativo

Estabelecida as melhores concentrações de inóculo (7,5%) e de açúcar (15%) no processo fermentativo, estudou-se então diferentes rotações (400 e 500 rpm). O mosto foi elaborado conforme descrito no item 4.8.1. Em intervalos de 30 minutos foram avaliados concentração de etanol, consumo de açúcares e perfil de pH durante todo o processo.

4.8.4 Influência da temperatura no processo fermentativo

O último parâmetro a ser estudado foi a temperatura. As temperaturas testadas foram de 30, 35, 40, 45 e 50°C. O mosto foi elaborado e a fermentação foi conduzida conforme descrito no item 4.8.1, levando em conta as melhores condições estudadas.

4.8.5 Estudo comparativo entre o LCCV sintético e in natura em condições ótimas

de processo

Estabelecidas as condições ótimas de processo, finalmente realizou-se um estudo comparativo entre o LCCV sintético e in natura como diluente. O mosto foi elaborado

conforme descrito no item 4.8.1. Nesta etapa, diferentemente das outras, analisou-se a concentração de etanol, o consumo de açúcar, o perfil de pH, a concentração de biomassa, a viabilidade celular e a concentração de fenólicos totais durante as 6 horas de processo. Este experimento foi realizado em triplicata.

4.9 Determinações analíticas

4.9.1 Métodos analíticos empregados na caracterização do LCCV

4.9.1.1 pH

(47)

4.9.1.2 Condutividade elétrica

A condutividade elétrica foi determinada instrumentalmente, em condutivímetro Digimed – modelo DM3, segundo APHA et al (1998).

4. 5.1.3 Série de sólidos

As análises da série de sólidos (sólidos totais, sólidos totais fixos, sólidos totais voláteis, sólidos suspensos totais, sólidos suspensos fixos, sólidos suspensos voláteis, sólidos dissolvidos totais) seguiram a recomendação de APHA et al (1998). Esta análise consiste em

determinar a concentração de sólidos presentes no líquido, expressando-os em mg.L-1.

4. 9.1.4 Demanda Química de Oxigênio

A análise de DQO – Demanda Química de Oxigênio foi realizada pela técnica de Digestão por Refluxo Fechado, segundo APHA et al (1998). As amostras foram preparadas da

seguinte maneira: em cada tubo foram adicionados 1,5ml da solução digestora, 2,5ml da amostra, previamente diluída, e 3,5ml da solução catalisadora de sulfato de prata. Em seguida, os tubos foram levados ao digestor por a 150°C por 2 horas. Após resfriadas, as amostras foram transferidas para seus respectivos béqueres contendo 10ml de água ultrapura. Adicionou-se 1 gota de solução de Ferroína às amostras e as titulou com solução de sulfato ferroso amoniacal até o aparecimento de uma cor avermelhada. Todas as análises foram realizadas em triplicata. A partir dos volumes gastos na titulação realizou-se o cálculo de DQO em mgO2/L.

4. 9.1.5 Demanda Bioquímica de Oxigênio

(48)

4. 9.1.6 Amônia total

O método consiste na formação da cor amarela obtida quando amostras contendo mais que 20 µg.L-1 são tratadas com o reagente de Nessler, após terem sido pré-tratadas com uma solução de sulfato de zinco, hidróxido de sódio 6N e sal de Rochelle. Alíquotas de 100 mL das amostras foram adicionadas a erlenmeyers de 250 mL. Foi adicionado 1mL da solução de Sulfato de Zinco e em seguida 1mL NaOH 6N. Após a formação de precipitado (15min), foram retirados 5 mL do sobrenadante e a este foram adicionadas 2 gotas Sal de Rochelle. A amostra foi aferida em 50 mL com água isenta de amônia. Finalmente, foi adicionado 1 mL do Reagente de Nessler, e após 10 minutos, para o desenvolvimento da cor, realizou-se leitura em espectrofotômetro (FEMTO – modelo 660plus) a 450 nm (APHA, et. al., 1998).

4. 9.1.7 Nitrito

Esta análise foi realizada pelo método de espectrofotometria de absorção molecular pela Técnica da Diazotação Sulfanilamida – NED, segundo APHA et al (1998). O método

permite obter resultados a partir da formação de um corante azóico púrpura avermelhado produzido em pH entre 2,0 e 2,5 mediante a reação da sulfanilamida com o dicloreto de N-(1Naftil)-etilenodiamino (NED), que pode ser medido espectrofotometricamente em comprimento de onde de 543 nm, cuja intensidade é proporcional à sua concentração.

4. 9.1.8 Nitrato

Esta análise foi realizada pelo método de espectrofotometria de absorção molecular

(49)

desenvolvimento da cor, efetuaram-se as leituras de absorbância no espectrofotômetro (FEMTO – modelo 660 plus) a 420 nm.

4. 9.1.9 Determinação de Nitrogênio

A determinação de nitrogênio, Nitrogênio Orgânico e NTK foi realizada pelo método espectrofotométrico, através da Digestão e Destilação em Macro-Kjeldahl seguida de Nesslerização Direta, segundo APHA et al (1998).

4. 9.1.10 Determinação de açúcares redutores

As análises foram feitas pelo método do ácido 3-5-dinitrossalicílico, segundo Instituto Adolfo Lutz - IAL, 1985. Este método baseia-se na formação de um complexo de cor

castanho-alaranjado, por redução do ácido 3,5-dinitrosalicílico a 3-amino-5-nitrosalicílico pelos açúcares redutores (Figura 4.4) A concentração desse complexo corado é proporcional à concentração de açúcares redutores na amostra.

COOH

OH

NO2 O2N

COOH

OH

NH2 O2N

CHO

+

COOH

+

OH

Ácido

3,5-dinitro-salicílico Açúcar redutor

Ácido

3-amino 5-nitro-salicílico Ácido aldônico

Figura 4.4 - Conversão do ácido 3,5-dinitro-salicílico a ácido 3-amino-5-nitro-salicílico pela reação com açúcares redutores.

(50)

(Varian, modelo Cary 50) com comprimento de onda de 540 nm, contra um branco preparado em condições idênticas, mas utilizando 1mL de água destilada em substituição à amostra.

4. 9.1.11 Determinação de açúcares redutores totais

Para a determinação de açúcares redutores totais adicionou-se a 1mL da amostra 1mL de HCl 2N e incubou-se em banho-maria termostatizado a 80°C por 30 minutos. Após, resfriou-se a amostra rapidamente à temperatura ambiente, neutralizou-a com 3 mL de NaOH 1N. O procedimento para a quantificação dos açúcares totais foi o mesmo utilizado para açúcares redutores acima descritos.

4. 9.1.12 Fenólicos totais

A determinação de fenólicos totais foi realizada segundo o método de Lowry et al (1947). Este método se baseia na utilização de ácido tânico como padrão numa faixa de diluição de 10-100 mg.L-1 e da formação de um complexo de cobre.

4. 9.1.13 Taninos condensados

(51)

4. 9.1.14 Digestão nitroperclórica

Transferiu-se 5 mL de amostra do líquido para tubos de digestão, adicionou-se 8 mL da mistura ácida, composta por ácido nítrico e ácido perclórico na proporção HNO3:HClO4 (3:1 v/v), mantendo a frio por 3 a 4 horas. Os tubos foram levados ao bloco digestor, marca TECNAL (modelo TE007D), e aquecidos lentamente até 120°C, mantidos nesta temperatura até cessar o desprendimento de fumos castanhos. Elevou-se a temperatura a 200°C e mantendo esta temperatura até cessar o desprendimento de fumaça branca, levando 3 a 4 horas. Resfriou-se a amostra e completou-se o volume final a 50 mL.

A amostra digerida foi utilizada para determinações de fósforo, potássio, sódio, cálcio, magnésio, sódio, cobre, ferro, manganês e zinco, conforme descrito por Silva (1999).

4. 9.1.15 Determinação de Fósforo

Transferiu-se 5 mL de cada extrato para frascos de Erlenmeyers de 25 mL, adicionou-se a solução de molibidato de amônio (10%), adicionou-adicionou-se uma pitada de ácido ascórbico e agitou-se. Após 30 minutos fez-se leitura em espectrofotômetro (Femto – modelo 660 plus) a 660 nm, conforme descrito por Silva (1999).

4. 9.1.16 Determinação de Sódio e Potássio

Os extratos nitroperclóricos foram diluídos na proporção de 1:10. Após o fotômetro de chama ser calibrado com padrões de 0 e 10 mg.L-1 de K e Na, realizou-se a curva padrão com padrões intermediários. As leituras dos extratos foram realizadas em fotômetro de chama marca Digimed - modelo DM-61, segundo Silva (1999).

4. 9.1.17 Determinação de Cálcio e Magnésio

(52)

espectrofotômetro de absorção atômica, de marca Perkin-Elmer (modelo A -Analyst 300), de acordo com Silva (1999).Os extratos nitroperclóricos foram diluídos na proporção de 1:10.

4. 9.1.18 Determinação de Cobre, Ferro, Manganês e Zinco

A concentração dos íons de metais de transição foi determinada por espectrofotômetro de absorção atômica, a partir de leituras diretas dos extratos nitroperclóricos, em equipamento de marca Perkin-Elmer (modelo A-Analyst 300), com chama ar/acetileno. Os comprimentos de onda utilizados para esses minerais estão de acordo com Silva (1999). As concentrações de Ca e Mg foram determinadas em espectrofotômetro de absorção atômica.

4. 9.1.19 Determinação de Enxofre

Foram adicionados 1 mL do extrato nitroperclórico e 9 mL de água deionizada em Erlenmeyers de 50 mL e 1 mL da solução HCl 6N. Foram adicionados, então, cerca de 500 mg de cloreto de bário e após um minuto, agitou-se a amostra por alguns segundos, até completa dissolução do sal. Realizou-se leitura em espectrofotômetro (Femto – modelo 660 plus) a 420 nm.

4.9.2 Métodos analíticos empregados no processo fermentativo

4.9.2.1 Determinação de açúcares redutores totais

(53)

4.9.2.2 Determinação de etanol

Fermentação natural do LCCV em garrafas PET

A produção de etanol foi avaliada através da perda de peso do sistema baseada na equação de Gay-Lussac, consiste na conversão de açúcar em álcool e dióxido de carbono, mediante a ação de microrganismos viáveis, com fator estequiométrico igual a 0,511, ou seja, cada grama de glicose convertida gera 0,511 g de etanol e 0,489 g de CO2. Análise de produção de CO2 foi realizada através da perda de peso, na qual garrafinhas foram levemente abertas para liberação do gás, novamente fechadas, agitadas por 5 vezes, e reabertas. Este procedimento foi padronizado e repetido por três vezes para garantir uma total liberação do gás produzido e, em seguida, pesadas em balança semi-analítica.

Fermentação em biorreator de bancada

Através de uma balança (Toledo - modelo 2096DD), diretamente acoplada à dorna do fermentador (Figura 4.5), foi possível controlar todo CO2 liberado e assim, através da perda de peso do sistema, estimar a concentração de etanol produzido durante a fermentação.

(54)

4.9.2.3 Determinação de cor durante a fermentação natural do LCCV

A análise de cor foi realizada em colorímetro Minolta, modelo CR-300, o qual emite um feixe de luz sobre o material e, em seguida, captura a luz refletida, fornecendo três variáveis representadas pelas letras L* (cor variando de preto a branco), a* (de verde a vermelho) e b* (de azul a amarelo), em uma escala compreendida entre 0 a 100 para a variável “L*” e -60 a +60, para as demais variáveis.

4.9.2.4 Caracterização e quantificação da população fúngica durante o processo fermentativo natural do LCCV

A contagem de colônias fúngicas, com o objetivo de avaliar o perfil da carga microbiana durante o processo de fermentação natural do LCCV, foi realizada segundo o método de plaqueamento por espalhamento (Silva et al, 1997).

Alíquotas da amostra foram inoculadas sob diferentes diluições em meio BDA (0,2% dextrose, 0,15% ágar, 20% infusão batata). As análises foram realizadas de acordo com a Figura 4.6, em dias alternados. Esta análise foi realizada em duplicata.

(55)

4.9.2.5 Determinação de células viáveis

A concentração de células viáveis e total foi determinada pela contagem em volume conhecido (0,1 mm3) da suspensão previamente diluída, através da técnica de exclusão pela coloração com azul de metileno (Reagen) 0,1%, em Câmara de Neubauer (Figura 4.7). As células que permitirem a entrada do corante e tornarem-se azul não apresentarão a membrana intacta, e serão consideradas não-viáveis, enquanto que as células viáveis liberam uma enzima que as tornam transparentes. A concentração celular é expressa pelo número de células por mililitro. Esta metodologia foi empregada durante o estudo em biorreator de bancada.

Figura 4.7 - Contagem de células em Câmara de Neubauer.

4.9.2.6 Determinação de biomassa

Amostras do caldo fermentado foram centrifugadas a 5000 rpm por 10 minutos, reservando-se o sobrenadante para as outras análises. O precipitado foi lavado duas vezes com água destilada e centrifugado. A biomassa foi determinada pela medida da densidade óptica da suspensão celular em 600 nm e convertida em peso seco (g.L-1) usando uma curva de calibração de densidade óptica versus biomassa seca (KWON; KAUL; MATTIASSON, 1996).

4.9.2.7 Determinação de fenólicos totais

A concentração de compostos fenólicos foi realizada conforme descrito no item

(56)

4.9.2.8 Determinação dos parâmetros de fermentação

Velocidade de formação de etanol

A velocidade de formação de etanol calculada de acordo com a Equação(3):

(

)

Tempo

Volume

Pf

Po

×

×

=

1

,

04499

etanol

de

formação

de

Velocidade

(3)

onde:

Velocidade de formação de etanol (g.L-1. h-1) Po = Peso inicial do sistema (g)

Pf = Peso final do sistema (g)

1,04499 = Fator de conversão da massa de CO2 liberada em massa equivalente de etanol Volume = Volume do mosto (L)

Tempo de fermentação (h)

Eficiência de conversão em etanol

A eficiência de conversão em etanol foi calculada de acordo com a Equação 4, com base no rendimento teórico proveniente da equação de Gay-Lussac (51,1 g etanol / 100g glicose):

(

)

100

511

,

0

04499

,

1

×

×

×

=

So

Pf

Po

Ef

(4)

onde:

Ef = Eficiência de conversão (%) Po = Peso inicial do sistema (g) Pf = Peso final do sistema (g)

1,04499 = Fator de conversão da massa de CO2 liberada em massa equivalente de etanol So = Massa de açúcar inicial

(57)

4.10 Estudo estatístico

Com o intuito de avaliar a similaridade entre os sistemas LCCV (líquido da casca de coco verde) in natura e LCCV sintético, ao longo do tempo, foi realizada análise de variância

da regressão linear e quadrática, para todas as características estudadas. As variáveis avaliadas foram: produção de etanol, concentração de açúcares redutores totais, células viáveis, células totais, fenóis, pH e biomassa.

A partir dos parâmetros estimados na análise de regressão foram determinadas as curvas linear (y = a + bx) e quadrática (y = a + bx + cx2) para cada característica, dentro de cada sistema. As curvas (linear ou quadrática) com melhor ajuste aos dados observados foram escolhidas com base no nível de significância de cada parâmetro e no coeficiente de determinação (R2) das equações. A significância dos parâmetros foi calculada por meio do teste T, avaliando se o valor do parâmetro diferia ou não de zero. O coeficiente de determinação das equações foi estimado na própria análise de regressão dos dados observados.

Por fim, para determinar se as curvas de uma mesma característica são semelhantes ou não, foi realizado o teste T entre os respectivos parâmetros das equações de cada sistema. Isto é, se o parâmetro “a” da curva do sistema LCCV in natura diferia do parâmetro “a” da curva

(58)

Capítulo 5

(59)

5.1 Fermentação natural do LCCV em garrafinhas de polietileno

O LCCV quando colocado em recipientes fechados sempre produziu grandes liberações de gás e odor característico de etanol. Levando em conta que nenhum inóculo ou fonte de carbono foi adicionado ao LCCV, este demonstrou ser uma matéria-prima altamente sujeita a alterações microbianas.

Baseado nestas informações, a primeira etapa deste trabalho foi avaliar o potencial fermentativo do LCCV, através da fermentação natural do líquido. Durante 10 dias de incubação acompanhou-se a liberação de CO2, o consumo de açúcares, o perfil de pH, o perfil microbiano do líquido, a mudança na coloração e a concentração de fenólicos do meio fermentativo. Esse potencial pôde ser constatado pelos resultados apresentados nas Figuras 5.1 a 5.7 que evidenciaram o perfil da fermentação.

Através da liberação de CO2 do meio, estimou-se a concentração de etanol produzida pelo meio (Figura 5.1). A fermentação natural do LCCV se encerra, praticamente, após 4 dias, com a produção de aproximadamente 20 g.L-1 de etanol (Figura 5.1) e com um consumo de aproximadamente 80% dos açúcares iniciais (Figura 5.2).

0 2 4 6 8 10

0 5 10 15 20 25

C

o

n

c

e

n

tr

a

ç

ã

o

d

e

e

ta

n

o

l

(g

.L

-1 )

Tempo (dia)

(60)

0 2 4 6 8 10 0 10 20 30 40 50 C o n c e n tr a ç ã o d e a ç ú c a re s ( g .L -1) Tempo (dia) Redutores Totais

Figura 5.2 - Consumo de açúcares redutores e açúcares redutores totais, durante a fermentação natural do LCCV.

0 2 4 6 8 10

3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 p H Tempo (dia)

Figura 5.3 - Perfil de pH durante a fermentação natural do LCCV.

Para avaliar o perfil microbiano do líquido (Figura 5.4), durante a fermentação natural do LCCV foi realizado o plaqueamento segundo o método de plaqueamento por espalhamento (Tabela 5.1). Embora os resultados obtidos sejam limitados quanto às espécies de microrganismos presentes no LCCV, foi possível observar uma variação do número de colônias e tipos de bolores e leveduras presentes no líquido durante os dez dias de fermentação (Figura 5.4). No “Dia 0”, amostra in natura, o grande número de bolores

(61)

Figura 5.4 - Placas de Petri utilizadas na avaliação do perfil da carga microbiana durante processo fermentação natural do LCCV, segundo o método de plaqueamento por espalhamento: (a) Amostra in natura; (b) amostra após 24 horas de fermentação; (c) amostra

após 48 horas de fermentação; (d) amostra após 240 horas de fermentação.

Segundo Moraes (2001), cada microrganismo responde com a própria personalidade ao ambiente e é esta personalidade que lhe provê uma seletiva e competitiva vantagem em seu nicho ecológico. A resposta do microrganismo ao ambiente é por vezes interativa: enquanto cresce e se reproduz, ou quando se adapta ao ambiente, o microrganismo modifica o próprio ambiente, como uma conseqüência de suas próprias atividades de crescimento e, em alguns casos, para melhorar suas vantagens competitivas contra outros microrganismos.

Através da contagem de colônias (UFC) realizada durante o período de fermentação, foi possível observar que o crescimento microbiano se deu durante os quatro primeiros dias, verificando-se, a partir de então, um declínio da carga microbiana.

(c)

(a) (b)

(62)

método de plaqueamento por espalhamento.

Dias Número de Colônias (UFC/mL) 0 >300.000 – diluição de 103

2 340.000

4 1.630.000

6 >300.000 – diluição de 103

8 288.000

10 214.000

O acompanhamento da microbiota do LCCV durante sua fermentação natural permitiu isolar diferentes tipos de leveduras em função do tempo. O isolamento e a identificação de espécies presentes no LCCV, trabalho que já está sendo desenvolvido, é de grande valia, pois podem ser identificados tipos ou grupos de leveduras diretamente responsáveis pela fermentação alcoólica, reduzindo custos e aumentando a eficiência do processo.

A Figura 5.5 ilustra graficamente a mudança dos parâmetros de cor durante a fermentação natural do LCCV e a Figura 5.2 mostra as garrafas PET durante os 10 dias de fermentação.

(63)

0 2 4 6 8 10 0

10 20 30 40 50 60

C

o

r

(L

*

a

*

b

*)

Tempo (dia)

L* a* b*

(64)

Figura 5.6 - Fermentação natural do LCCV em garrafinhas de polietileno durante os dez dias de fermentação.

1

0 2 3

4 5 6 7

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