Evaluation of the antimicrobian resistance of Escherichia coli isolated of healthy hens (Gallus gallus).

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ISSN Impresso 0102 -5716 ISSN Eletrônico 2178-3764 Veterinária e Zootecnia 218 EVALUATION OF THE ANTIMICROBIAN RESISTANCE OF Escherichia coli ISOLATED OF HEALTHY HENS (Gallus gallus) Adriano Sakai Okamoto1 Raphael Lucio Andreatti Filho2 Ana Angelita Sampaio Baptista3 Ticiana Silva Rocha4 ABSTRACT Intestinal microbiota of the chickens is composed by many species of bacteria that benefit the host in many ways during its life. When the host is submitted to inadequate treatments with antibiotics, this microbiota suffers a selection trial, becoming resistant to these drugs. It was evaluated the resistance profile of Escherichia coli isolated from intestine of healthy posture hens to the antibiotics. From 100 samples analyzed, 83 showed resistance to more than three antibiotics, and two were resistant to all of the tested antibiotics. Keywords: antibiotics, microbiota, Escherichia coli, resistance, hens. AVALIAÇÃO DA RESISTÊNCIA ANTIMICROBIANA DE Escherichia coli ISOLADAS DE GALINHAS (Gallus gallus) SAUDÁVEIS RESUMO A microbiota intestinal das aves é composta por inúmeras espécies bacterianas que beneficiam o hospedeiro de alguma maneira durante toda sua vida. Quando o hospedeiro é submetido a tratamentos inadequados com antimicrobianos, essa microbiota sofre um processo de seleção, podendo tornar-se resistente a esses medicamentos. Nesse estudo avaliamos o perfil de resistência de amostras de Escherichia coli isoladas do intestino de galinhas de postura saudáveis aos antimicrobianos. Das 100 amostras analisadas, 83 apresentaram resistência a mais de três antimicrobianos, sendo que duas amostras foram resistentes a todos os antibióticos. Palavras-chave: antimicrobianos, microbiota, Escherichia coli, resistência, galinhas. EVALUACIÓN DE LA RESISTENCIA ANTIMICROBIANA DE Escherichia coli AISLADA DE GALLINAS (Gallus de gallus) SANAS RESUMEN La microbiota intestinal de los pollos se compone de muchas especies bacterianas que benefician al huésped de diversas maneras durante toda su vida. Cuando el huésped es sometido a tratamientos antibióticos inadecuados, este microbiota sufre un proceso de selección y puede llegar a crear resistencia a dichos fármacos. En este estudio, evaluamos el perfil de resistencia de Escherichia coli aislada del intestino de gallinas de postura sanas. De 1, 2 Professor Doctor discipline Avian Pathology FMVZ-UNESP-Botucatu-SP Brazil E-mail: adrisakai@hotmail.com Address: Department of Veterinary Clinic FMVZ UNESP District of Rubião Junior S/N Botucatu - SP 3 Doctoral Student Avian Pathology FMVZ-UNESP-BOTUCATU-SP 4 Msc. Student Avian Pathology FMVZ--UNESP-BOTUCATU-SP Okamoto AS et al. Evaluation of the antimicrobian resistance of Escherichia coli isolated of healthy hens (Gallus gallus). Vet. e Zootec. 2012 jun.; 19(2): 218-221. ISSN Impresso 0102 -5716 ISSN Eletrônico 2178-3764 Veterinária e Zootecnia 219 las 100 muestras, 83 presentaron resistencia a más de tres antibióticos y dos de las muestras fueron resistentes a todos los antibióticos probados. Palabras clave: antibióticos, microbiota, Escherichia coli, resistencia, gallinas. INTRODUCTION Escherichia coli (E. coli) is a Gram negative bacillus, facultative anaerobic, belonging to the family Enterobacteriaceae, found colonizing the healthy gut of birds and mammals (1). The pathogenic lineages for birds are named Avian Pathogenic Escherichia coli (2), responsible for infections characterized by signs of septicemia, peritonitis, pneumonia, aerossaculitis, pericarditis, onfalitis and salpingitis. The infection caused by E. coli represent one of the main problem of the industrial poultry breeding, responsible for economic losses as mortality, decrease of weight and condemnation of carcasses in the slaughterhouse (3). The use of antibiotics in the animal food as "promoters of growth" or in an indiscriminate way under the form of sub or over dosage (3), increases the resistance genes selection pressure to the antibiotics for multiresistant bacterial lineages (4). Studies have shown the resistance genes transmission between the micro-organisms. This fact has become a concerning a public health problem, as the genes of resistance may be transfered to pathogenic bacteria that can infect the humans (5). Many species of the family Enterobacteriaceae present in the gut of healthy birds are frequently exposed to several antibiotics during the life of the animal (6). The present study evaluated the profile of resistance to 12 antibiotics in isolated of E. coli obtained from the excrements of adult healthy hens, without intestinal signs. MATERIAL AND METHODS One hundred samples of E. coli obtained from the healthy posture hens excrements were used. The samples were isolated utilizing swab of cloaca, and cultivated in ágar MacConkey, in conditions of aerobiosis, to 37° C, for 24 hours. The characteristic colonies were submitted to the biochemical analysis. For the achievement of the sensitiveness test to the antibiotics, the colonies identified like E. coli were submitted to the diffusion standard test with disks (7), utilizing 12 antibiotics: cefalexin (30 g), gentamicin (10 g), enrofloxacin (5 g), norfloxacin (10 g), doxiciclin (30 g), florfenicol (30 g), cloranfenicol (30 g), neomycin (30 g), amoxicillin (10 g), tetraciclin (30 g), ampicillin (10 g) and penicillin (10 g). The results were submitted to the statistical analysis, using the program SAS (table 1). RESULTS AND DISCUSSION Table 1 shows the antibiogram results. From 100 samples of E. coli, just two (2%) showed itself sensitive to all the tested antibiotics, 15 presented resistance to one or two antibiotics and the other samples were resistant to three or more antibiotics; two of them were resistant simultaneously to the 12 tested antibiotics. Zao et al (8) described similar results when evaluating 95 isolated samples of E. coli, in which 71% were resistant to five or more antibiotics. Okamoto AS et al. Evaluation of the antimicrobian resistance of Escherichia coli isolated of healthy hens (Gallus gallus). Vet. e Zootec. 2012 jun.; 19(2): 218-221. ISSN Impresso 0102 -5716 ISSN Eletrônico 2178-3764 Veterinária e Zootecnia 220 Table 1. Sensitivity and resistance by 100 bacterial strains of Escherichia coli from the normal intestinal microbiota of hens. Antimicrobial % sensibility/ % resistance Risk of bacterial resistance RAP CI 95% Value P Penicillin 0/100 Reference Reference NA Amoxicillin 17/83 0,049 0,01-0,38 <0,004 Ampicillin 0/100 1,0 0,06-16,21 >0,1 Cefalexin 25/75 0,03 0,004-0,23 <0,001 Cloranfenicol 85/15 0,002 0,001-0,01 <0,0001 Doxiciclin 50/50 0,01 0,001-0,07 <0,0001 Enrofloxacin 75/25 0,003 0,001-0,02 <0,0001 Florfenicol 67/33 0,005 0,001-0,04 <0,0001 Gentamicin 75/25 0,003 0,001-0,02 <0,0001 Neomicin 0/100 1,0 0,06-16,21 >0,1 Norfloxacin 50/50 0,01 0,001-0,07 <0,0001 Tetraciclin 50/50 0,01 0,001-0,07 <0,0001 RAP: Ratio of adjusted proportions; CI 95%: Confidence interval 95% probability; NA: Not Applicable. Neomicin and ampicillin were not effective for the isolated samples. Blanco et al. (4) observed resistance in 46% of the isolated sample for ampicillin and 79% for neomicin when evaluating 310 isolated samples, differing from the results found in this study. The antibiotic which showed the best effectiveness facing the 100 isolated samples was cloranfenicol with 85% of sensitiveness. Zao et al. (8) observed 89% of sensitiveness of E. coli to this antibiotic. The prescription of antibiotic for healthy birds, in subtherapeutic concentrations for prolonged time, exposes microbiota to a selective pressure, enabling the acquisition of resistance genes to the antibiotics. The intestinal lumen complex, where a great amount of bacteria interacts in very limited space, represents an ideal niche for studies in vivo of the resistance genes transfer between different species and gender (9). The occurrence of multiresistant samples of E. coli from animal origin is concerning to the world health organization (10). Another prominent point resides in the fact of the majority of the antibiotics available in the market are based on ampicillin or neomicin that, coincidentally are broadly used in the human and veterinary medicine. However, these drugs of the group showed have low or no efficiency against all the samples tested, fact that can be consequence of the inappropriate use of the antibiotics in the poultry breeding. CONCLUSION Escherichia coli samples isolated from excrements of healthy birds were resistant to the antibiotics, fact that is a great problem for the poultry breeding and public health with dissemination risk of multiresistant gene to the antimicrobians to other microorganisms including the pathogenic ones. REFERENCES 1. Mokady D, Godhna U, Ron EZ. Extensive gene diversity in septicemic Escherichia coli strains. J Clin Microbiol. 2005;43(1):66-73. 2. Dho-Moulin M, Fairbrother JM. Avian pathogenic Escherichia coli APEC. Vet Res. 1999; 30(2-3):299-313. Okamoto AS et al. Evaluation of the antimicrobian resistance of Escherichia coli isolated of healthy hens (Gallus gallus). Vet. e Zootec. 2012 jun.; 19(2): 218-221. ISSN Impresso 0102 -5716 ISSN Eletrônico 2178-3764 Veterinária e Zootecnia 221 3. Ferreira AJP, Knöbl T. Colibacilose aviária. In: Berchieri Junior A, Macari M. Doenças das aves. Campinas: Facta; 2000. p.197-207. 4. Blanco JE, Blanco M, Mora A, Blanco J. Prevalence of bacterial resistance to quinolones and other antimicrobials among avian Escherichia coli strains isolated from septicemic and healthy chickens in Spain. J Clin Microbiol. 1997;35(8):2184-5. 5. Wegner HC, Bager F, Aarestrup FM. Surveillance of antimicrobial resistance in humans, food stuffs and livestock in Denmark. Euro Surveill. 1997;3(2):17-9. 6. Smith JL, Drum DJV, Dai Y, Kim JM, Sanchez S, Maurer J, et al. Impact of antimicrobial usage on antimicrobial resistance in commensal Escherichia coli strains colonizing broiler chickens. Appl Environ Microbiol. 2007;73(5):1404-14. 7. Bauer AW, Kirby WM, Sherris JC, Turck M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. 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Vet. e Zootec. 2012 jun.; 19(2): 218-221. foram contidos fisicamente em decúbito lateral direito, e as agulhas posicionadas sobre os acupontos (ACs) coração 7 (C-7 – Shenmen), localizado entre o processo estiloide lateral e o osso cárpico acessório, exatamente na dobra da articulação úmero-rádio-ulnar, e pericárdio 6 (PC-6 – Neiguan), localizado entre os tendões do músculo flexor carporradial e do músculo flexor digital superficial (Fig. 1A, 1B e 1C), conforme descrito por Draehmpaehl e Zohmann (1997). Já para a segunda seção, os animais foram novamente posicionados em decúbito lateral direito, e as agulhas inseridas em acupontos falsos (AF), localizados no oitavo e no nono espaço intercostal esquerdo (Figura 1D), onde não há interferência de nenhum outro meridiano, conforme descrito por (Draehmpaehl e Zohmann, 1994). Independentemente da seção, não foi realizada estimulação manual das agulhas, e os acupontos permaneceram estimulados por um período de 30 minutos, respeitando-se o período mínimo de 10 a 20 minutos sugerido por Scott (2001) para que o acuponto possa promover um efeito observável. Figura 1. Localização dos acupontos C-7 (seta em A) e PC-6 (seta em B) no cão (Adaptado de Draehmpaehl e Zohmann, 1997). Em C, acupuntura em cão do experimento acuponto C-7 (seta azul) e acuponto PC-6 (seta laranja). Em D, acupuntura em cão do experimento em acuponto falso. Arquivo pessoal, 2014.  Previamente à aplicação das agulhas nos ACs, foi realizado um registro eletrocardiográfico (ECG) com dois minutos de duração e, após a inserção das agulhas nos ACs, o registro eletrocardiográfico se manteve durante os 30 minutos de acupuntura. Para a realização do eletrocardiograma, foi utilizado um aparelho de eletrocardiografia computadorizada (ECGPC – TEB®), respeitando-se o padrão de fixação de eletrodos descrito por Tilley (1992), com registro das derivações bipolares e unipolares aumentadas e calibração de 25mm/s e 1mV (N). Os dados do ECG foram interpretados de forma comparativa pré e pós-estimulação dos acupontos, sendo os dados pós-estimulação coletados e interpretados em intervalos de cinco minutos até o final da gravação (30 minutos). Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.68, n.1, p.252-256, 2016 253 Silva et al.  Para a análise da VFC, foi utilizada a fórmula disponível em Carareto et al. (2007). A normalidade dos dados obtidos foi verificada pelo teste de Shapiro-Wilk (P>0,05), seguida pelo teste ANOVA com pós-teste de Bonferroni para as variáveis paramétricas e pelo teste de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn (P<0,05) para as variáveis não paramétricas. Foi realizada análise descritiva para as variáveis qualitativas. No presente estudo, 90% dos animais apresentaram arritmia sinusal respiratória, demonstrando maior influência do sistema nervoso simpático, em todos os momentos do grupo ACs, enquanto no grupo AF esse ritmo cardíaco esteve presente em 100% dos animais, em todos os momentos. O ritmo sinusal foi encontrado apenas em 10% dos animais do grupo ACs, sugestivamente por se tratar da primeira exposição dos animais ao experimento, resultando em maior influência parassimpática sobre o sistema cardiovascular. Conforme demonstrado na Tab. 1, houve pequena e irrelevante diferença quando comparada a FC de todos os momentos do grupo ACs com os momentos do grupo AF, o que evidencia, portanto, a ineficácia da estimulação dos acupontos sobre esse parâmetro. Tabela 1. Frequência cardíaca (FC) e variabilidade da frequência cardíaca (VFC) obtidas com a realização dos acupontos verdadeiros (AV) C-7 e PC-6 e do acuponto falso (AF) em diferentes momentos do ECG, expressos em mediana (percentil 25% - percentil 75%) para a FC e média±desvio-padrão para a VFC Momentos FC (bpm) VFC AV AF AV AF 0 minuto 107 (92-130)a 112 (93-129)a 12,79±0,46ab 12,71±0,47b 5 minutos 90 (79-121)a 93 (82-115)a 13,08± 0,48ab 13,09± 0,49ab 10 minutos 94 (79-118)a 88 (70-123)a 13,01± 0,48ab 13,12± 0,53ab 15 minutos 96 (76-120)a 99 (81-115)a 13,04± 0,52ab 13,17± 0,51a 20 minutos 95 (79-120)a 95 (81-112)a 13,13± 0,51ab 13,07± 0,54ab 25 minutos 104 (83-115)a 89 (76-108)a 13,15± 0,45ab 13,17± 0,53a 30 minutos 87 (82-107)a 95 (81-117)a 13,18± 0,46ab 13,11± 0,56ab P = 0,0890 P = 0,0051 Para a FC, valores seguidos por letras distintas diferem entre si (P<0,05) ao teste de Dunn. Para a VFC, valores seguidos por letras distintas diferem entre si (P<0,05) ao teste de Bonferroni. Não foi observada diferença na VFC (Tab. 1) entre os grupos do ACs e AF, exceto quando comparado apenas o momento basal com os momentos 15 e 25 minutos do AF, contudo sem relevância clínica para o estudo. Sabidamente, VFC constitui uma medida simples e não invasiva que avalia os efeitos do sistema nervoso autônomo sobre o coração. Variações nessa variabilidade são normais e esperadas, indicando habilidade do coração em responder a múltiplos estímulos fisiológicos e ambientais. Em síntese, uma alta VFC representa boa adaptação, caracterizando um indivíduo saudável, com mecanismos autonômicos eficientes, enquanto a baixa VFC representa adaptação anormal e insuficiente do SNA (Carareto et al., 2007). Dentre as opções terapêuticas para o tratamento de anormalidades dos mecanismos autonômicos, a acupuntura vem se destacando em vários estudos em animais, entretanto em nenhum desses estudos se objetivou a avaliação do efeito da acupuntura em indivíduos saudáveis, conforme ocorreu no presente estudo, fator limitante à discussão mais aprofundada. Observam-se, na literatura, diversos estudos em que foram observados os efeitos da acupuntura sobre pacientes com diferentes distúrbios cardiovasculares. Syuu et al. (2001) relataram efeitos benéficos da estimulação do acuponto PC-6 em cães anestesiados e sob toracotomia. Nesse estudo, os autores descrevem reduções na pressão arterial média, volume diastólico final, frequência cardíaca, débito cardíaco e pressão sistólica final mediante estimulação do acuponto. O efeito cardiovascular da acupuntura sobre o acuponto PC-6 em cães também foi observado por Jingbi (2004) em modelo de experimental de infarto agudo do miocárdio. Nesse estudo, foi observado que a acupuntura proporcionou redução do segmento ST do eletrocardiograma, além de reduzir as áreas de infarto induzidas pela ligadura coronariana. Entretanto, esses dois 254 Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.68, n.1, p.252-256, 2016 Efeitos da acupuntura estudos diferem do presente pelo fato de as agulhas terem sido estimuladas eletricamente (eletroacupuntura), enquanto no presente estudo estas permaneceram em repouso. Cárdenas (2006) observou que a estimulação dos mesmos acupontos empregados no presente estudo em cavalos sob anestesia geral demonstrou efeitos positivos sobre a taquicardia ventricular induzida por infusão contínua de dopamina, nos quais a estimulação dos ACs C-7 e PC-6 promoveu diminuição do tempo da taquicardia ventricular, demonstrando, assim, a eficácia da estimulação desses acupontos em animais. Um estudo controlado em ratos demonstrou que a estimulação dos acupontos PC-5 e PC-6 reduziu significativamente a incidência de taquiarritmias induzidas experimentalmente pós-oclusão e reperfusão da artéria coronária esquerda (Lujan et al., 2007). Em humanos, a revisão de oito estudos utilizando acupuntura para o tratamento de arritmias cardíacas encontrou cerca de 87 a 100% que foram convertidos ao ritmo sinusal após a estimulação dos acupontos (Xie e Wedemeyer, 2012). estudo não se valeu da estimulação elétrica sobre os acupontos falsos ou verdadeiros (C-7 Shenmen e PC-6 Neiguan). Limitações a este estudo compreendem o fato de que a escolha dos acupontos explorados baseouse nas indicações terapêuticas descritas por Draehmpaehl e Zohmann (1994), em que o acuponto C-7 é indicado em casos de alterações funcionais do coração, e o acuponto PC-6 quando há dores miocárdicas. Ainda segundo os mesmos autores, essa forma de terapia alternativa objetiva normalizar funções orgânicas alteradas e, como no presente estudo foram utilizados animais hígidos, a acupuntura pode não ter promovido influência sobre a VFC nos cães que participaram do experimento. Limita-se, ainda, este estudo quando da observação das recomendações descritas por Scott (2001), quando ele destaca a necessidade de um ou dois tratamentos semanais durante quatro a seis semanas consecutivas, tempo em que se espera que possa haver a resposta desejada à terapia, fato não realizado no presente estudo. Finalmente, Kimura e Hara (2008) desenvolveram um estudo em que foram estudados os efeitos da eletroacupuntura sobre o ritmo do sistema nervoso autônomo em cães. Dentre outras análises, observaram o coeficiente de variação dos intervalos R-R (CVRR) do eletrocardiograma, o qual avalia o índice de atividade nervosa autônoma, de forma semelhante à VFC, a qual também se utiliza do intervalo R-R como unidade de medida. Seus entre os grupos (* p < 0,01). O principal critério de exclusão deste estudo foi idade superior a 74 anos. Um declínio da função neurocognitiva (descrito como podendo chegar a 9%) no período pós‑operatório é muito mais comum e esperado para idades acima daquela. A amostra avaliada neste estudo tinha idade média de 60 anos, que foi relacionada a menor efeito na função neurocognitiva no pós-operatório. Ao se relacionar idade com função cognitiva, apenas o Digit Span Test, que avalia velocidade de coordenação motora visual, mostrou diferença nos escores, que foram menores no Grupo 222. Neste estudo, alguns resultados do comprometimento cognitivo em pacientes submetidos a CRM com BCP diferiram daqueles relatados na literatura. A maioria dos testes neurocognitivos realizados mostrou aumento ou leve redução de escores entre o período pré-operatório e a alta hospitalar no Grupo 2, que foi submetido a mais sessões de fisioterapia. A avaliação da atenção e do sequenciamento alternado através do Trail Making Test, parte A, mostrou nos dois grupos um leve aumento do escore entre o período pré-operatório e a alta hospitalar. No entanto, na parte B do mesmo teste, ao contrário do Grupo 1, o Grupo 2 apresentou aumento do seu escore no mesmo período, sugerindo que a maior estimulação melhorou a função cognitiva. Resultado semelhante foi observado ao se avaliar a memória de curto prazo e a memória verbal imediata usando-se o Subteste de Substituição de Dígitos por Símbolos: o escore do Grupo 1 diminuiu enquanto o do Grupo 2 aumentou. Ao se avaliar a velocidade de coordenação motora visual e memória visual (Teste de Retenção Visual de Benton e Coding Test), observou‑se uma redução nos dois grupos, sendo maior no Grupo 1 (p < 0,01). Há relatos na literatura de que anormalidades neurocognitivas leves podem ocorrer após cirurgia cardíaca16. Para nossa surpresa, alguns testes mostraram aumento nos escores do grupo submetido a fisioterapia três vezes por dia. Até onde sabemos, este é o primeiro estudo a avaliar a influência de fisioterapia na função cognitiva. Na nossa prática clínica, observamos que tanto a função pulmonar quanto a neurocognitiva de pacientes submetidos a CRM evoluem melhor quando aqueles são submetidos a sessões de fisioterapia mais frequentes, enfatizando a interação dinâmica entre corpo e mente. Isso nos levou a planejar este projeto para melhor avaliar tal efeito. O tamanho da amostra foi a limitação mais importante deste estudo. No entanto, mesmo sem um número grande de pacientes e com um protocolo de fisioterapia relativamente simples23, nossos resultados confirmam a hipótese de que pacientes submetidos a maior número de sessões de fisioterapia por dia apresentam melhor recuperação cognitiva até a alta hospitalar. Sugerimos que uma maior intensidade de fisioterapia durante a hospitalização aumente o número de sinapses no sistema cortical aferente e melhore a comunicação neuronal, resultando em minimização ou mitigação dos distúrbios neurocognitivos causados pela cirurgia cardíaca. 396 Arq Bras Cardiol. 2014; 103(5):391-397 Cavalcante e cols. Fisioterapia após cirurgia de revascularização miocárdica Artigo Original Conclusão Como demonstrado neste estudo, a CRM com BCP leva a alterações das funções pulmonar e neurocognitiva no período pós-operatório, podendo comprometer a evolução clínica dos pacientes. A fisioterapia respiratória é uma maneira de minimizar o dano à função pulmonar nessa população. Para nossa surpresa, houve melhora das funções neurocognitivas no grupo submetido a maior número de sessões de fisioterapia respiratória por dia, com melhora de seus níveis peroperatórios, sugerindo que pacientes mais estimulados têm melhor desenvolvimento neurocognitivo. Faltam estudos correlacionando fisioterapia respiratória e função neurocognitiva no pós-operatório de cirurgia cardíaca. Nossos resultados encorajam estudos adicionais sobre esse tópico. Esta nova abordagem abre um caminho de investigação, não apenas para a possibilidade de redução do dano neuropsicológico secundário à cirurgia cardíaca com BCP, mas ainda como uma simples e prática estratégia para prevenir ou minimizar tais alterações. Contribuição dos autores Concepção e desenho da pesquisa: Cavalcante ES, Conforti CA, Carvalho ACC, Buffolo E, Luna Filho B; Obtenção de dados: Cavalcante ES, Magario R; Análise e interpretação dos dados: Cavalcante ES, Magario R, Luna Filho B; Análise estatística: Luna Filho B; Redação do manuscrito: Cavalcante ES, Cipriano Júnior G, Arena R, Luna Filho B; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Cavalcante ES, Conforti CA, Cipriano Júnior G, Carvalho ACC, Buffolo E, Luna Filho B. Potencial conflito de interesse Declaro não haver conflito de interesses pertinentes. Fontes de financiamento O presente estudo não teve fontes de financiamento externas. Vinculação acadêmica Este artigo é parte de Dissertação de Mestrado de Elder dos Santos Cavalcante pela UNIFESP - Escola Paulista de Medicina. Referências 1. van Harten AE, Scheeren, TW, Absalom AR. 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