Bacia do rio Parauari-Maués-Açu. Aspectos químicos devidos as alterações hidrológicas da Bacia.

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BACIA DO RIO PARAUARI-MAUÊS-AÇU. ASPECTOS QUÍMICOS DEVIDOS ÀS ALTERAÇÕES HIDROLÓGICAS DA BACIA. (*) Sérgio R. B . Bringel (**) Umberto de Menezes Santos (**) Maria de Nazar! Goes Ribeiro (**) Henrique Bergamin Filho (**) RESUMO Ai condiçõzi kidAoquZmicai da bacia do Rio PaAauaAi-Mauéi-Açu, titão eiiudadai a ραΛΧΑΛ dai deteAminaçõei do pH, câtcio, magnésio, iÕdio, potãiiio, ^e/iAo, ctoKetOi, co- ble., zinco e man.ga.nh>, nai di{eh.entei epocai do ano. Varus, i i i o , faiam nealizadai qua- ϋιο excu/uoei e eitab&tecidoi onze. pontoo de. coletai de amoitAcu, de ãgua, ao longo do fiÁ.0 principal e íga/uiph a&tuentei. Ai anaJLUtò moitnahnm cloJuxmznte ^lutuaçoei iazonaii no tiio que comtitui o eixo principal da bacia, o Vafia.uaKÍ-^auêÁ-Açu e era alguni de ieuò piincipaii tAibutántOi, co mo Oò fLioi, Üambi, Araanã e Utupadi. tnai ^lutuaçôei ZitÃo eitnitamente Kelacionaáoi com oi pefCLodoi de cheia, ieca e inte/uneaiÔnioi, moitftando a importância deaa mana de água na movimentação de ioÀA, ao tongo da. bacia. INTRODUÇÃO A bacía d oRio Parauari-Maues-Açu cobre aproximadamente 25.000 K m 2 , e tem como principal formador o Parauari, cominaisou menos ^50 km de extensão, localizado próximos ao paralelo d e 3?*t0'S. Após a foz d o Rio U r u p a d í , n o local denominado Repartimento, esse rio passa a chamar-se Maues-Açu ate ao Paraná do Uraríã, onde finda a bacia. A bacia recebe contribuições de vãrios afluentes, tais como dos rios Nambí, Ama- na e U r u p a d i . (*) - Trabalho inteiramente subvencionado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq. (**) - Instituto Nacional d e Pesquisas d a Amazonia - INPA ACTA AMAZON I CA, 14(1-2):77 - 85 · 1981*. 77 O R i o P a r a u a r i , F i g . l , é* u m r i o d e l e i t o e s t á v e l e d e f r a c a e r o s ã o c o m p r e d o m i n a r ^ cia de siltes, devida ao fato de sua cabeceira localízar-se em uma região geológica pré cambriana, da parte norte do Escudo Brasileiro, Atravessa formações do Paleozóico, e os solos dessa região, d e modo gerai, s ã o d o tipo latossol amarelo, apresentando um relevo levemente ondulado, com escarpas, principalmente na cabeceira do rio. Na região dessa bacia, afloram, ocasionalmente, algumas rochas carbonatadas. MATERIAL Ε MÉTODOS Foram r e a l i z a d a s q u a t r o e x p e d i ç õ e s a b a c i a d o R i o P a r a u a r i - M a u é s - A ç u ; a p r i m e i r a , , no período d e 3 a 17 d e fevereiro d e 197&, coincidindo c o m o auge d a enchente; a segun- da, d e 1 5 a 30 d e d e z e m b r o d e 1 9 7 6 , q u a n d o o r i o e s t a v a c o m nível m í n i m o d e a g u a , a ter- ceira,de 25 de dezembro de 1977a 6 de janeiro d e 1978, correspondendo ao infcio dc p e r í o d o c h u v o s o e s u b i d a d o nível d a ã g u a d o r i o . A q u a r t a , r e a l i z a d a n o p e r í o d o d e 22 d e j a n e i r o a 10. d e f e v e r e i r o d e 1 9 7 9 , o c a s i ã o e m q u e o r i o a p r e s e n t a v a m a i o r n í v e l d e ãgua em termos comparativos c o m a terceira viagem. LOCALIZAÇÃO DOS PONTOS DE COLETAS Os pontos d e a m o s t r a g e m d e água a o longo d a bacia d o R i o Pa r a u a r i - M a u é s - A ç u estão i n d i c a d o s n a F i g . 1. Mo contexto d o sistema fluvial e m estudo, classificamos o Rio Parauari como o principal seguido d o Maués-Açu, e como tributários, temos os rios Nambi e Amana para o Parauari, e o Rio Urupadi para o Maues-Açu. Seguindo o curso d o sistema fluvial desde sua nascente a t é a foz, o primeiro pon- to d e coleta (i) e s t á l o c a l i z a d o e m frente a o igarapé d a P e d e r n e i r a ; o s e g u n d o , próximo' ao igarapé d a Benta Grande e a d e número 2.1 está localizada a 2 k m dentro d o igarapé da Benta Grande. No ponto d e n ú m e r o 3 , a a m o s t r a foi c o l e t a d a n a f o z d o R i o N a m b i ; o 't,próximo ao igarapé d o P a r a c a í ç a r a ; o d e número 5, na f o z d o R i o A m a n ã . Neste rio,foram coletadas d u a s a m o s t r a s , u m a a 5 k m d e d i s t â n c i a d a f o z (.5-1) e a o u t r a a 10 k m ( 5 - 2 ) . A amostra d e numero 6 foi coletada no local d e n o m i n a d o L a r a n j a l , q u e dista 15 km a b a i x o d a f o z d o R i o A m a n ã ; a d e n ú m e r o 7 f o i c o l e t a d a n o i g a r a p é d o C ã o E r a , e a de número 8 , n aV i l a M u c a j ã , 0 p o n t o d e n ú m e r o 9 e s t á l o c a l i z a d o n a c o n f l u ê n c i a d o s rios Parauari e Urupadi. Mo rio U r u p a d i , foram efetuadas duas c o l e t a s , a d e número (9.1) e m frente ao igarapé Traíra e a de número (9.2) em frente ao igarapé da Pedreira. j á n o R i o M a u é s - A ç u e s t á o p o n t o d e n ú m e r o 1 0 , l o c a l i z a d o p r o x i m o a o i g a r a p é do Camarão e a de número 11, em frente ã cidade d e Maués. 78 B r i n g e l et al, M0TODOS A amostras de água foram coletadas na superfície e acondicionadas em frascos de polietileno, f i x a d a s c o m C H C l ^ ( 2 , 5 ml p a r a 500 m l ) p a r a d e t e r m i n a ç õ e s d o p H e c l o r o . Para a s v a r i a s o u t r a s d e t e r m i n a ç õ e s (.500 m l d e a m o s t r a ) a s m e s m a s n ã o f o r a m f i x a d a s . 0 pH foi determinado potenciometricamente utilizando-se aparelho W T W , modelo pH 390. Os teores d e c á l c i o , m a g n é s i o , f e r r o , z i n c o , m a n g a n ê s e cobre foram determinados por e s p e c t r o m e t r i a d e a b s o r ç ã o a t ô m i c a , c o m a p a r e l h o P e r k i n E l m e r , m o d e l o 306 e q u i p a d o com um r e g i s t r a d o r d a R a d i o m e t e r C o p e n h a g e m R E C 61 S e r v o g r a p h . Os teores de sódio e potássio foram determinados e m espectrometria de emissão, utilizando-se aparelho Perkin Elmer, modelo 3 0 6 , equipado c o m u m registrador da Radiome ter C o p e n h a g e m R E C 61 S e r v o g r a p h . Finalmente, o teor de cloro como cloreto, foi determinado por volumetria, segundo o método IBP Hand book n? 8. 1 9 7 1 . RESULTADOS Ε DISCUSSÃO Os resultados d o pH m o s t r a m u m a relação e n t r e p r e c i p i t a ç ã o e volume d e á g u a . Os rios e igarapés c o m m e n o r e s n f v e i s d e á g u a , m a i o r e s s a o o s v a l o r e s d e p H , e p a r a m a i o res níveis d e a g u a , m e n o r e s s ã o o s v a l o r e s d o p H . O s v a l o r e s m é d i o s d o p H p a r a a s q u a t r o e x c u r s õ e s , o s c i l a r a m e n t r e k.S p a r a o ponto d e coleta d e n ú m e r o 2 . 1 a 5.9 n o p o n t o d e n u m e r o 6. £ d e e s p e r a r - s e q u e a região onde afloram rochas c a r b o n í f e r a s , a s á g u a s p o s s u a m m a i o r e s c o n c e n t r a ç õ e s de substâncias tampão, havendo, portanto, m ai or pH„ CÍLCIO Ε MAGNÉSIO Sioli Ü 9 5 6 a ; 1 9 5 6 b ; 1957) e n c o n t r o u v a l o r e s m u i t o b a i x o s d e s s e s T o n s n a s v a r i a s regiões por e l e e s t u d a d a s , Sioli ( l 9 5 6 b ) , B r i n k m a n n & S a n t o s (.1973) a f i r m a m q u e o s c o n t e ú d o s d e c á l c i o e magnésio, nas regiões terciárias da Amazônia Central, s a o relativamente baixos. Esses íons g e r a l m e n t e s e r i a m p r o v e n i e n t e s d a l a v a g e m d a s f o l h a s , c a u l e e t r o n c o , p e l a s á g u a s da chuva. Santos e t 31.(.1978) e Schmidt (1972), trabalhando na região de terra firme da Amazônia Central, também encontraram valores muito baixos para esses íons. No e n t a n t o , a r e g i ã o e m e s t u d o s i t u a d a e m Z o n a C a r b o n í f e r a a p r e s e n t o u teores mais elevados, fato e s t e t a m b é m o b s e r v a d o p o r Sioli (19^*9) p a r a a r e g i ã o d o R i o C u p a r i . Estes teores mais elevados de cálcio e magnésio.podem ser explicados pela presen ça de c a l c á r i o q u e a f l o r a e m v á r i o s p o n t o s d o R i o P a r a u a r i , f a z e n d o c o m q u e o c o r r a u m a variação destes íons, n o s dΐversos pontos estudados da bacia. P o d e m o s o b s e r v a r n a T a b . n ? 1 , a s v a r i a ç õ e s d o s t e o r e s d e c á l c i o , n o s p e r í o d o s e_s tudados no auge d a e n c h e n t e q u e c o r r e s p o n d e 1 e x c u r s ã o d e 3 a 17 d e fevereiro d e 1 9 7 6 , Bacia do r i o Parauari 79 quando foi observado um teor d e 0.l8mg/l de,cãlcío e m frente ao igarapé da Pederneira (l), a t é ao local denominado Laranjal. Deste ponto a t e ã Vila Mucajá (8), estes valores a u m e n t a r a m p a r a Q . 2 7 m g / 1 e a l c a n ç a r a m 0.36mg/l e m f r e n t e à c i d a d e d e M a u é s ( 1 1 ) . Possivelmente, estas oscilações devem seratribuídas ã dissolução do CaCO^ sedimentado no leito da bacia, que é arrastada pela correnteza. Com a bacia no seumais baixo nível, na excursão de 15 a 30 de dezembro de 1976 vindo a corresponder ao início do período chuvoso, verifica-se uma variação do cálcio entre 0.23mg/l na Vila Mucajá (8) a 0.62mg/l e m frente a o igarapé Traíra (9.1). Na excursão de 26-12/77 a 6-10/78, que também corresponde ao início do período chuvoso, aparecem oscilações de cálcio entre 0.27 mg/l no ponto de coleta de números 1 e 3 . a 0.60mg/l n o p o n t o d e número 9.2. Jã na amostragem de 22/1 a 10/2/79, as oscilações crescem sensivelmente ficando entre 0 . 1 8 mg/l no ponto de número 2*1. a 0.71 m g / l nos pontos de números 9.2 e 1 1 . Dos rios que contribuíram para uma maior concentração de cálcio para o sistema Pa rauari-Maués-Açu, estão os rios Amanã e Urupadi bem como a amostragem em frente ao Iga- rapé Cão Era. Os resultados das análises de magnésio estudados, também mostram variações ao longo d e s u a b a c i a . O b s e r v o u - s e no período d e cheia (3 a 1 7 / 1 2 / 7 6 ) , q u e u m m a i o r teor de magnésio encontrado foi na foz do R i oAmanã (5), c o m u m valor de 0.97 mg/1, enquanto que a amostragem do ponto 11, em frente à cidade de Maués, apresentou a menor concentra ção de íon, 0.^3 mg/l, indicando uma tendência de concentração ã medida que se aproxima da foz, Para o período de seca, a concentração de magnésio nao sofre variação acentuada, observando-se a mesma tendência de diminuir a concentração ã medida que se aproxima da foz. As maiores concentrações foram observadas em frente ao igarapé da Pederneira em frente ã V i l a M u c a j á c o m 0,3*t mg/l c a d a . e Semelhantes aos resultados do período de seca, os resultados ocorridos no início do período chuvoso variam muito pouco para todo o sistema Parauari-Maués-Açu. Estes valores oscilam entre 0.26 mg/1 a 0.16 mg/l. Com a continuação da subida d'agua, a bacia do rio Parauari-Maués-Açu aumenta seu teor de magnésio e a maior concentração observadas nessa época (22/1 a 10/2/79), foi em frente ao igarapé da Pederneira com 0.65mg/l. Daí em diante, a bacia passa a apre- sentar flutuações em conseqUência das aguas que o rio recebe de seus tributários, oca- sionando um aumento ou diminuição de magnésio, dependendo, contudo do teor de magnésio com queesses afluentes contribuem. SÕDIO Ε POTÁSSIO Podemos observar na Tab. 1 queos teores de sódio são superiores aos de potássio, e estes nos deram uma média de 0.66mg/I para potássio. Ε bem possível que esses sais minerais sejam provenientes da decomposição de rochas silicatas e de material vegetal. As maiores concentrações de sódio para o sistema Parauari-Maués-Açu, em média, fo ram observadas emfrente ao Igarapé de Pederneira c o m 0.80mg/l, e no R i o Amana com 80 B r i n g e l et al. 0.80 mg/l, e no Rio Amana com 1,13 mg/l. Para os teores de potássio foram o Rio Nambi com 1.05 mg/l e Rio Amana com 0,80 mg/l. CLORETOS 0 cloro em forma de cloretos e introduzido nos sistemas de drenagem pelas águas, pela reminera1ização das substâncias das florestas, e ainda pela possfvel ocorrência de depósitos de salgema na região. Em análise feita nas águas de chuva, no período da excursão de 15 a 3 0 / 1 2 / 7 6 foi constatada uma concentração de 0.7'* mg/l. Sabe-se porém, que essa concentração é muito variável, não sõ de época, como também entre chuvas consecutivas, tornando-se difícil uma conclusão sobre a verdadeira influencia deste ãnion nessa região. Anon (.1972) observou uma nítida diferença nas concentrações de cloretos entre as estações seca e chuvosa, sendo que no período de seca as concentrações são mais elevadas, porém como a continuidade das precipitações são mais elevadas, o cloreto tende a diminuir de concentração nas aguas da chuva. Considerando a amostragem de 15 a 30 de 1 2 / 7 6 com o rio apresentando menor nível de ãgua, a mesma nos deu uma média de cloretos para todo o sistema de 1 . 3 3 mg/l de cloro, e na amostragem de 3 a 1 7 / 1 2 / 7 6 com o auge da enchente, a média foi de 0.65mh/l de cloro. Isto nos mostra muito bem que a bacia do Parauari-Maués-Açu sofre uma diluição de 50¾ nos teores de cloro, provocada pelas precipitações. FERRO Siolí (19^9) observou que a quantidade de ferro na água depende do terreno e do meio ambiente. Parece ser proveniente do subsolo e das camadas superiores, mostrando so mente variações insignificantes e não determinadas, em correlação com as estações do ano. Segundo Anon ( 1 9 7 2 ) , as águas de precipitações fornecem ao sistema (Rio Negro) 2 kg de ferro ha. ano 0 ferro encontrado nas águas da bacia do Parauari-Maués-Açu, é, provavelmente, in_ troduzido no meio ambiente pelas lavagens que sofre o solo, lavagens devidas â alta plu^ viosidade na região (2787mm Κ Dos pontos de coleta, os rios que contribuíram com as maiores concentrações de ferro para o sistema foram: em frente ao igarapé da Benta Grande com 0.57 mg/l e Rio Amanã com 0.28 mg/l. o Comparando os resultados de ferro com os encontrados por outros autores que traba_ lharam na Região Amazônica, os mesmos são considerados elevados. ZINCO Ε COBRE Semelhante ao ferro, estes aparecem no período seco (15 a 30/12/76) com valores elevados, merecendo um maior numero de amostragem nesse período, principalmente no Rio Amana e no igarapé do Cao Era, Para elucidarem-se estas altas concentrações é melhor intensificar a pesquisa. Bacia do rio Parauari 81 Para o cobre, os resultados também mostram altas concentrações, no período e o igarapé do Cao Era é o que aparece com maior valor. seco, MANGANÊS Semelhantes ao ferro, estão os resultados de manganês, quando as maiores concen - trações aparecem no Rio Amana, e são consideradas normais para a Região Amazônica. CONCLUSÕES Os resultados obtidos na bacia do Rio Parauari-Mauês-Açu, levam-nos às seguintes conclusões: a composição química das aguas da bacia do Rio Parauari-Mauês-Açu I nitida- mente influenciada pelas estações do ano, com variações sazonais, de acordo com as alterações do nível das aguas e ocorrências climáticas. Os maiores valores de pH ocorrem quando os rios e igarapés estão com menores ηΓ- ve i s de água. No inverno, os teores de cálcio são estáveis, sofrendo variações entre a Vila Macujá e a cidade de Mauês, jã próximo ãfoz, No período de seca e intermediário, ocorre um aumento na concentração desse ele- mento As maiores concentrações de magnésio ocorre quando o rio está com maior n"vel de águas, t bem possível que a lixiviação nas rochas carbonatadas carreie primeiramente o magnésio, cujas concentrações medias nos mostram, Na 0.66 m g / l , Κ 0.62 mg/l, Ca 0.37 mg/l e Mg 0.32 mg/l. Os teores de ferro são considerados normais para aguas da Amazônia em uma de 0,29 mg/l para a bacia estudada. média As concentrações de cloro em forma de cloreto sao maiores no período de menor nf- vel de agua. Os resultados de manganês são considerados normais para as águas amazônicas. Os resultados de cobre e zinco merecem melhores observações principalmente no igarapé Cio Era. SUMMARY The chemical ckanactehÁj>tta, oi the ?cuimaAÍ-ttau.fa>-kçu. Kivvt Ea&in wojie examined. itiateA &leò weAe collected dojiing &ουΛ difávttnt excuMion* at zleven point* alon$ the mainòtKean and PiibutafU&A . Sample* we&e analysed fan. ptí, calcium, magnesium, 6odium, potaA&ium, i/ion, chlonide, zapped, zinc, and manganeiz. The tioAoltt, demomtKote a. cXeaA. àeoAonal ^lmtxuvUon in the PcuíauofU-Haaíò-Aça and òome oá Üà principal thÂhtáJxxieò. Jheòe {luctu-ationí, one dViectly delated to vantationÁ in the fiive/ι hidnogiaph showing the importance oi thiò uiatzA maò& in the movement ofa iolute-i along the baòin. 82 Br i nge! e t a I . Referencias bibliográficas Anon. - 1972. Regenwasseranalysen aus Zentrallamazonien, ausgefuhre in Manaus, Amazo­ nas, Brail ien, von Dr . Herald Ungemach. Amazoniana, Kiel, 3(2):186-198. Brinkmann, W.L.F. & Santos, A. dos - 1973. Natural waters in Amazonia VI. Solube Cal­ cium Properties. Acta Amazônica, 3(3):33-40. Santos, A. dos; Bringel, S R.B.; Ribeiro, J.S.B. - 1978, Hidroquimica da Amazonia Cen­ C tral I, Perdas de elementos nutritivos no ecossistema Campina Amazônica. In: 1., Simpósio Nacional de Ecologia, Curitiba, 1978. Schmidt, Η. - 1972. Chemical properties of same waters in the tropical rain-forest region of Central Amazonia along the new road Manaus-Caracarai. Amazonian;], Kiel, I 3(2):199-207. Sioli, H. - 1949. 0 Rio Cupari, Topografia e Hidrografia. B o i . Teen. Inst. Agron. do Korte, Belem, ¢17):1-54. - 1956a. 0 rio Arapiuns - Estudo limnologico de um corpo d'agua do Terciário plioceno das barreiras do Baixo Amazonas. Boi. Teen. lost. Agron. do cells expressing FLAGSEPT4 with AnnH31 and AnnH75 resulted in a concentration-dependent decrease of intensity of the slower migrating band and a concomitantly increased signal of the lower band (Fig 5A). Consistent with the IC50 values determined in the in vitro-assays (Table 1), AnnH31 reduced SEPT4 phosphorylation more potently than AnnH75. As a third cell-based assay of DYRK1A inhibition, we measured the phosphorylation of the microtubule-associated protein tau by DYRK1A. The phosphorylation of tau (gene symbol MAPT) by DYRK1A has been considered potentially relevant in the early Alzheimer’s disease- PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0132453 July 20, 2015 8 / 18 Novel β-Carboline DYRK1A Inhibitors Fig 4. Inhibition of SF3B1 phosphorylation by DYRK1A in HeLa cells. HeLa cells expressing GFP-SF3B1-NT were treated with the indicated compounds for 18 h. The phosphorylation state of SF3B1 was determined by immunoblotting with pT434 antibody, and the results were normalized to the total amount of SF3B1 immunoreactivity. A, Representative western blots. AnnH79 is a harmine analogue that does not inhibit DYRK1A and was used as negative control. The vertical line indicates where irrelevant lanes were deleted from the final image. B, The column diagram summarizes the quantitative evaluation of 3–6 experiments for each compound (means + SD). doi:10.1371/journal.pone.0132453.g004 like neurodegeneration in Down syndrome and in spontaneous Alzheimer’s disease [10]. In this assay, AnnH75 inhibited DYRK1A activity with an IC50 of 1 μM (Fig 5B and 5C). The higher value as compared to the inhibition of SEPT4 phosphorylation (0.36 μM) may be due to the overexpression of DYRK1A in this assay. AnnH31, L41 and 5-iodotubercidin were the best inhibitors in this assay, whereas INDY reduced tau phosphorylation less efficiently. Low cellular potency of INDY has previously been observed in assays of tau phosphorylation and reporter gene activity [30]. Similarly, two other DYRK1A inhibitors with excellent potency and selectivity in biochemical assays require ~1000 higher concentrations to inhibit tau phosphorylation in cellular assays [35–36]. Taken together, our results provide evidence that AnnH31 and AnnH75 can be used as chemical probes to confirm the participation of DYRK1A in cellular phosphorylation events. PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0132453 July 20, 2015 9 / 18 Novel β-Carboline DYRK1A Inhibitors Fig 5. Inhibition of SEPT4 and tau phosphorylation by DYRK1A. A, HeLa cells transiently expressing FLAG-SEPT4 were treated with AnnH31 or AnnH75 for 5 h before cells were lysed and analysed by immunoblotting with a FLAG-tag antibody. 5-iodotubercidin (IoT) served as positive control. Relative SEPT4 phosphorylation was calculated as the ratio of the intensities of the phosphorylated upper band and the lower band. B, HEK293 cells with constitutive expression of GFP-tau and regulatable expression of GFP-DYRK1A were treated with doxycyclin and the indicated inhibitors for 18 h. Phosphorylation of tau on Thr212 was detected with a phosphospecific antibody. Expression levels of GFP-tau and GFP-DYRK1A were assessed with a GFP antibody. For quantitative evaluation of DYRK1A inhibition, the basal pT212 signal in control cells not treated with doxycyclin (Ctrl) was subtracted from all values. C, Quantitative evaluation of three experiments each for SEPT4 and tau. All data were standardized to the level of phosphorylation in cells untreated with inhibitors. Error bars indicate SEM. doi:10.1371/journal.pone.0132453.g005 AnnH75 inhibits tyrosine autophosphorylation of DYRK1A Tyrosine kinase activity of DYRKs has been postulated to exhibit different inhibitor sensitivity than serine/threonine phosphorylation [7]. Therefore we investigated if AnnH75 is a selective inhibitor of the serine/threonine kinase activity of mature DYRK1A or whether AnnH75 also interferes with tyrosine autophosphorylation during translation. To address this question, we used a coupled in vitro-transcription-translation system and monitored at the same time the effect of the inhibitor on the tyrosine autophosphorylation of DYRK1A and the phosphorylation of Thr434 in the substrate protein SF3B1 (Fig 6). Under these conditions, AnnH75 inhibited tyrosine autophosphorylation of DYRK1A at concentrations >1 μM. Slightly higher concentrations of AnnH75 were required for the inhibition of threonine phosphorylation in SF3B1. The higher IC50 value for SF3B1 phosphorylation as compared to the peptide assay is due to the fact that kinase activity in the in vitro-translation mix cannot be assayed under conditions of substrate saturation (as discussed previously [9]). In conclusion, AnnH75 inhibits both the immature and mature form of DYRK1A. Conclusions Chemical probes serve as invaluable small molecule tools to functionally annotate signalling proteins, to understand their role in physiological and pathological processes and to validate them as potential drug targets. Here we report the evaluation of new harmine analogs with regard to their suitability as chemical probes for the protein kinase DYRK1A. To support the conclusion that AnnH31 and AnnH75 meet the key requirements of a useful tool for this purpose, we discuss our results with respect of the “fitness factors” of chemical probes that were proposed by Workman & Collins [6]: selectivity, potency, chemistry and context. PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0132453 July 20, 2015 10 / 18 Novel β-Carboline DYRK1A Inhibitors Fig 6. AnnH75 inhibits both threonine and tyrosine kinase activity of DYRK1A. A DYRK1A construct with an N-terminal StrepTag 2 (ST2-DYRK1Acat) was expressed in a cell-free E. coli-derived expression system. Coupled in vitro transcription and translation reactions were incubated for 1 h in the presence of recombinant SF3B1-NT-His6 and AnnH75. Phosphorylation of tyrosines in DYRK1A and of Thr434 in SF3B1 was determined by immunoblotting with a phosphotyrosine-specific antibody (pTyr) and a pThr434-specific antibody. A, Representative western blots. The asterisks mark unidentified bands. B, Quantitative evaluation. Results were normalized to the total amount of DYRK1A or SF3B1, respectively, and are plotted relative to the phosphorylation in the untreated control samples (means +/- SEM, n = 3). doi:10.1371/journal.pone.0132453.g006 Selectivity A key criterion for the use of a kinase inhibitor as a chemical probe is that its selectivity profile is well defined [4,6]. The kinase selectivity profile of AnnH75 compares favourably with that of other DYRK1A inhibitors that have been profiled against an informative panel of kinases (Table 2). However, the cross-reactivity for CLK1/4 and haspin clearly requires consideration when this DYRK1A inhibitors is used in experiments addressing splicing regulation or cell cycle control. Regarding off-targets outside the protein kinase family, we reached the goal of eliminating the MAO-A inhibitory activity of harmine. AnnH31 displays already 40 fold selectivity for DYRK1A over MAO-A and complies with the requirements for a high quality chemical probe [6]. AnnH75 has no residual effect on MAO-A and is better suited in all applications potentially susceptible to monoamine effects. The availability of inactive analogs and active probes from a different chemical class can help to prove target-dependency in a biological experiment [4,6]. When AnnH75 is used as a probe to confirm a hypothetical function of DYRK1A or DYRK1B, AnnH79 can serve as a structurally related inactive control compound (Fig 4) and L41 as a potent inhibitor with a different chemotype. PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0132453 July 20, 2015 11 / 18 Novel β-Carboline DYRK1A Inhibitors Biochemical and cellular potency Several mechanisms can account for discrepancies between inhibitor potency in biochemical and in the cellular context [3,48]. Many DYRK1A inhibitors with adequate potencies in biochemical assays (< 100 nM, as proposed by Workman & Collins [6]) have been described [14], but only few have been shown to inhibit the phosphorylation of a cellular target in a concentration-dependent manner with a practicable potency (< 1–10 μM according to Workman & Collins [6]). In particular, the only known inhibitors with significant selectivity for DYRK1A over CLK1 require micromolar concentrations for half-maximal effects in cellular assays, in spite of low nanonmolar potencies in biochemical assays [35–36]. We verified the cellular efficacy of AnnH75 with three different substrates of DYRK1A and provide direct comparisons with established DYRK1A inhibitors. Taken together, the concentration-dependent effects of the chemical probes (AnnH31 or AnnH75) support the hypothesis that a molecular mechanism depends on a certain target (in this case DYRK1A). Chemistry (structure, solubility, stability, permeability) The procedures for the synthesis and the structural characterization of the new β-carboline Plano Diretor do Município de Paraguaçu. Projeto de Lei n. 22/2005. Prefeitura Municipal de Paraguaçu, 82 f., [14], Il. Edição fac-similar. ______. Prefeitura Municipal de Paraguaçu; Conselho Municipal do Patrimônio Histórico de Paraguaçu/MG; Memória Arquitetura Ltda. O Patrimônio Cultural de Paraguaçu/MG. Belo Horizonte. 2008. 30 p. Il. ______. Prefeitura Municipal de Paraguaçu; Conselho Municipal do Patrimônio Histórico de Paraguaçu/MG. 2ª Etapa do Inventário de Proteção do Acervo Cultural de Paraguaçu. Belo Horizonte. Julho/2006. 1 CD-ROM. PESEZ, Jean-Marie. A história da cultura material. 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