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Expressão de marcadores de células-tronco em carcinoma espontaneo de mama em cadelas e sua correlação com o grau de agressividade nos diferentes subtipos de tumores

Documento informativo
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CAMPUS DE BOTUCATU EXPRESSÃO DE MARCADORES DE CÉLULAS-TRONCO EM CARCINOMA ESPONTANEO DE MAMA EM CADELAS E SUA CORRELAÇÃO COM O GRAU DE AGRESSIVIDADE NOS DIFERENTES SUBTIPOS DE TUMORES FERNANDA CARMELLO FIGUEIROA BOTUCATU – SP 2012 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CAMPUS DE BOTUCATU EXPRESSÃO DE MARCADORES DE CÉLULAS-TRONCO EM CARCINOMA ESPONTANEO DE MAMA EM CADELAS E SUA CORRELAÇÃO COM O GRAU DE AGRESSIVIDADE NOS DIFERENTES SUBTIPOS DE TUMORES FERNANDA CARMELLO FIGUEIROA Tese apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária para obtenção do título de Doutor. Orientadora: Livre Docente Noeme Sousa Rocha Co-Orientador: Prof. Dr. Alfredo Ribeiro da Silva FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE Figueiroa, Fernanda Carmello. Expressão de marcadores de células-tronco em carcinoma espontâneo de mama em cadelas e sua correlação com o grau de agressividade nos diferentes subtipos de tumores / Fernanda Carmello Figueiroa. – Botucatu : [s.n.], 2012 Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Orientador: Noeme Sousa Rocha Coorientador: Alfredo Ribeiro Silva Capes: 50503022 1. Cão – Doenças. 2. Mamas – Câncer. 3. Câncer em cão. 4. Células-tronco. 5. Tumores. Palavras-chave: Cadelas; Câncer de mama; Células-tronco tumorais; Subtipos de tumores de mama; Tissue microarray. iii Co m i ssã o Ex a m i n a d o r a iv Nome do Autor: Fernanda Carmello Figueiroa Título: EXPRESSÃO DE MARCADORES DE CÉLULAS-TRONCO EM CARCINOMA ESPONTANEO DE MAMA EM CADELAS E SUA CORRELAÇÃO COM O GRAU DE AGRESSIVIDADE NOS DIFERENTES SUBTIPOS DE TUMORES COMISSÃO EXAMINADORA ___________________________________________________________ Profª Livre Docente Noeme Sousa Rocha Presidente e Orientadora Departamento de Clínica Veterinária – Serviço de Patologia Animal FMVZ – UNESP - Botucatu ___________________________________________________________ Profª. Livre Docente Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga Membro Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ – UNESP - Botucatu ___________________________________________________________ Profª. Ass. Drª. Carla Adriene da Silva Franchi Membro Departamento de Patologia FMB – UNESP – Botucatu ___________________________________________________________ Prof. Dr. Luis Fernando Barbisan Membro Departamento de Morfologia IBB – UNESP – Botucatu ___________________________________________________________ Prof. Dr. Rafael Malagoli Rocha Membro Departamento de Anatomia Patológica Hospital do Câncer de São Paulo – Fundação Antônio Prudente – São Paulo Data da Defesa: 23 de novembro de 2012. v D ed i ca t ó r i a vi D ed i co . A D eu s, po r a b en ço a r m i n h a vi d a , i l u m i n a r m eu s ca m i n h o s e m e d a r fo r ça s pr a co n t i n u a r ! vii Ao s m eu s a m a d o s pa i s, Ca r l o s Ed u a r d o e I o l a n d a , pel a d ed i ca çã o e a m o r i n co n d i ci o n a l , po r m e en si n a r em o s ver d a d ei r o s va l o r es d a vi d a e m e a po i a r em em t o d a s a s h o r a s. À B ea t r i z , m i n h a i r m ã qu er i d a , pel o a po i o , pel a t o r ci d a , po r t o d a a a ju d a e po r sem pr e est a r pr esen t e. Às m i n h a s ca ch o r r a s já fa l eci d a s, T i n a , Ci n d y e Bo n eca , po r t a d o r a s d e câ n cer d e m a m a . Vo cês fi z er a m pa r t e d a m i n h a vi d a e m e i n spi r a r a m a est u d a r m a i s a fu n d o essa d o en ça . viii Às m i n h a s ca ch o r r a s Ph o eb e, M eg , Pi t u k a e N i n a . Pel o co m pa n h ei r i sm o , a m o r e po r t o d o s o s m o m en t o s d e a l eg r i a . A t o d o s o s a n i m a i s qu e seja m po r t a d o r es o u qu e ven h a m a d esen vo l ver câ n cer d e m a m a . Qu e est e est u d o a ju d e a g u i a r n o vo s ca m i n h o s, m el h o r a r o d i a g n ó st i co , pr o g n ó st i co , t r a t a m en t o e a qu a l i d a d e d e vi d a ! ix Ag r a d eci m en t o s x Ser ei et er n a m en t e g r a t a . À Pr o fesso r a Li vr e D o cen t e N o em e So u sa Ro ch a , minha qu er i d a o r i en t a d o r a . Ag r a d eço pel a d i spo n i b i l i d a d e em m e o r i en t a r , pel o s en si n a m en t o s, pel o s “ pu x õ es” d e o r el h a , pel a pa ci ên ci a , a po i o e pel a g r a n d e a m i z a d e. Ao Pr o fesso r D r . A l fr ed o Ri b ei r o d a Si l va , d a Fa cu l d a d e d e M ed i ci n a d e Ri b ei r ã o Pr et o , U SP, o b r i g a d a po r ser m eu co o r i en t a d o r e m e a cei t a r co m o est a g i á r i a n o SERPAT/ H C/ Ri b ei r ã o Pr et o / SP e n o La b o r a t ó r i o d e On co pa t o l o g i a d o D epa r t a m en t o d e Pa t o l o g i a e M ed i ci n a Leg a l – FM RP/ U SP/ Ri b ei r ã o Pr et o / SP. Ag r a d eço pel a o r i en t a çã o , pel a s su g est õ es, i n cen t i vo e a ju d a n a i n t er pr et a çã o d o s d a d o s. À t écn i ca d e l a b o r a t ó r i o A n a M a r i a An sel m i D or i g a n , po r m e r eceb er Pr et o / SP e m e en si n a r a ( h i b r i d i z a çã o i n no SERPAT/ H C/ Ri b ei r ã o t écn i ca d e CI SH e FI SH si t u ) , a l ém d e m e a u x i l i a r n a m a r ca çã o i m u n o i st o qu í m i ca d e a l g u n s m a r ca d o r es. xi À t écn i ca d e l a b o r a t ó r i o D ei sy M a r a d a Si l va , po r m e r eceb er n o La b o r a t ó r i o d e On co pa t o l o g i a , d o D epa r t a m en t o d e Pa t o l o g i a FM RP/ U SP/ Ri b ei r ã o e M ed i ci n a Pr et o / SP, po r Leg a l t od os – os en si n a m en t o s, pel o s m o m en t o s d e d esco n t r a çã o , pel a pa ci ên ci a pr est a d o e nas a m i z a d e. m a r ca çõ es Ag r a d eço pel o a u xíli o i m u n o i st o qu í m i ca s das cél u l a s- t r o n co t u m o r a i s. Vo cê fo i fu n d a m en t a l n esse t r a ba l h o! À equ i pe d o Ser vi ço d e An a t o m i a Pa t o l ó g i ca d o H o spi t a l A. C. Ca m a r g o / Sã o Pa u l o / SP, d a Fu n d a çã o An t ô n i o Pr u d en t e, em especi a l a o Pr o f. D r . R a fa el Ma l a g ol i Ro ch a e ao Ca r l o s Na sci m en t o pel a co n fecçã o d o TM A. À M á r ci a M o l et a Co l o d el pel o a u x í l i o n a co l et a e pr o cessa m en t o d a s a m o st r a s. Gr a ça s a su a d ed i ca çã o co n seg u i m o s m a t er i a l su fi ci en t e pa r a n o ssa s t eses. Ao B r en o So u z a Sa l g a d o , a g r a d eço pel a a ju d a nas m a r ca çõ es i m u n o i st o qu í m i ca s i n t er pr et a çã o d o s d a d o s. e na xii Ao s fu n ci o n á r i o s da pó s- g r a d u a çã o em M ed i ci n a Vet er i n á r i a – FM VZ/ U NESP/ Bo t u ca t u / SP J o sé Ro b er t o d e La l l a Jú n i o r , M a r i a Apa r eci d a D i a s d e Al m ei d a M a n o el , Pa t r í ci a Lu ci a n e So u z a Ra m o s, pel a a t en çã o e a ju d a . À U n i ver si d a d e Est a d u a l Pa u l i st a “ Jú l i o de M esqu i t a Fi l h o ” – U NESP e à Fa cu l d a d e d e M ed i ci n a Vet er i n á r i a e Zo o t ecn i a – FM VZ/ U NESP/ Bo t u ca t u / SP, pel a o po r t u n i d a d e d e d esen vo l ver esse pr o jet o ; a o Pr o g r a m a de Pó s- Gr a d u a çã o em M ed i ci n a Vet er i n á r i a , po r t o d o a u x í l i o , a o D epa r t a m en t o d e Cl í n i ca Vet er i n á r i a e ao Ser vi ço de Pa t o l o g i a Vet er i n á r i a pel a a co l h i d a . Ao Pr o fesso r Ad ju n t o J o sé Ed u a r d o Co r r en t e, pel o a u x í l i o pr est a d o n a a n á l i se est a t í st i ca . À Pr o fesso r a R eg i n a Ki o m i Ta k a h i r a , po r m e a u x i l i a r n a i n t er pr et a çã o d o s d a d o s est a t í st i co s. Ao s a m i g o s d e pó s- g r a d u a çã o da Pa t o l o g i a Vet er i n á r i a : I sa b el l e, L u ci a n o , M a r i a n a , M a r cel a . Em especi a l a o Pa u l o Ri ca r d o , pel a g r a n d e a m i z a d e, xiii a u xí l i o, a po i o , co m pa n h ei r i sm o e m o m en t o s d e d esco n t r a çã o . Ao s pó s- g r a d u a n d o s do D epa r t a m en t o de Pa t o l o g i a e M ed i ci n a Leg a l d a FM RP/ U SP/ Ri b ei r ã o Pr et o / SP, em especi a l à J u l i a n a d a Si l va Za n et t i , pel a a m i z a d e, co l a b o r a çã o , a u x í l i o , a po i o e m o m en t o s d e d esco n t r a çã o . Ao s a m i g o s e co l eg a s d a CEF, Ag . Vi l a d os La vr a d o r es e Ag . M a r i l i a , em especi a l à Pa t r i ci a , Ro sâ n g el a , Ar n a l d o, Fer n a n d o , Di og o, Vi t o r e M a r co s. Ob r i g a d a po r m e a po i a r em , su pr i r m i n h a s a u sên ci a s e t o r cer em pel a fi n a l i z a çã o d est e t r a ba l h o. Ao s m eu s a m i g o s- i r m ã o s, Bol i n h a , Ba n a n a , Bet i n h o , L el l o , Sa m a n t h a , T h a í s, Fl á vi a , o br i g a d a po r t od a co m pr een sã o , a po i o , a m i z a d e, cu m pl i ci d a d e, m o m en t o s d e d esco n t r a çã o . A vi d a é m u i t o m a i s fel i z co m vo cês a o m eu l a d o . xiv A t od os per m i t i r a m os qu e p r o pr i et á r i o s o t eci d o qu e g en t i l m en t e n eo pl á si co r et i r a d o ci r u r g i ca m en t e d e su a s ca d el a s fo sse est u d a d o . A t o d o s qu e, d e a l g u m a fo r m a , co n t r i b u í r a m pa r a a r ea l i z a çã o d essa pó s- g r a d u a çã o e d esse pr o jet o d e pesqu i sa . M eu s si n cer o s a g r a d eci m en t o s! ! ! M u i t o Ob r i g a d a ! ! ! xv Li st a d e Ta b el a s xvi LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Anticorpos (Ac) utilizados nas marcações imunoistoquímicas: Diluição, fabricante, clone utilizado e ponto de corte para avaliar a positividade de cada marcador. 31 Tabela 2 - Teste qui-quadrado (x2) para diferença de proporções e para a associação entre os subtipos para cada marcador de células-tronco nos carcinomas simples e complexo. 44 xvii Li st a d e Fi g u r a s xviii LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Figura 2 - Figura 3 - Figura 4 - Sistemas de células-tronco: Tecido normal descende de uma célulatronco central que cresce e se diferencia para criar células progenitoras e células maduras. As características chave das células-tronco normais são a habilidade de auto-renovação (indicada pela seta curva), potencial de multi-diferenciação (indicada pelas células de diferentes cores) e sua capacidade proliferativa extensa. As células-tronco tumorais surgem a partir de mutações nas células-tronco normais ou nas progenitoras, que crescem e se diferenciam para produzir o tumor primário. Assim como as células-tronco normais, as células-tronco tumorais podem se autorenovar, dar origem a uma população heterogênea de células filhas e se proliferar incessantemente (Modificado de Jordan et al., 2006) . 18 Cenários envolvendo células-tronco tumorais: A- Mutação de célulatronco normal pode criar célula-tronco tumoral, a qual irá gerar um tumor primário. B- Tumor primário tratado com quimioterápicos pode ter maioria das células destruída, mas se alguma célula-tronco tumoral não for erradicada o tumor tornará a crescer causando recidiva local. CCélulas-tronco tumorais decorrentes do tumor primário podem emigrar para sítios distantes e criar lesões metastáticas (Modificado de Jordan et al., 2006). 24 A) Marcação nuclear para receptores de estrógeno em carcinoma simples de mama, 200X. B) Marcação membranar para HER-2 em carcinoma simples de mama, positivo 3+, marcação completa de membrana, IHQ – Novolink®, 200X. 36 A) Marcação nuclear para p63 em carcinoma complexo de mama, evidenciando células mioepiteliais, 200X. B) Marcação membranar para CK5 em carcinoma complexo de mama, IHQ – Novolink®, 200X. 37 Figura 5 - Marcação citoplasmática para CD10 em carcinoma simples de mama, IHQ – Novolink®, 400X. Figura 6 - Marcação citoplasmática para BMI-1 em carcinoma simples de mama, IHQ – Novolink®, 400X. Figura 7 - Marcação citoplasmática para CD24 em carcinoma simples de mama, IHQ – Novolink®, 400X. Figura 8 - Marcação membranar para ESA em carcinoma simples de mama, IHQ – Novolink®, 400X. Figura 9 - Marcação citoplasmática para MUC-1 em carcinoma simples de mama, IHQ – Novolink®, 400X. Figura 10 - Marcação membranar para CD44 em carcinoma simples de mama, IHQ – Novolink®, 400X. 39 40 40 41 41 42 xix Su m á r i o xx SUMÁRIO RESUMO. ABSTRACT. 1. INTRODUÇÃO. 2. REVISÃO DA LITERATURA. 2.1 Câncer de mama. 2.2 Subtipos tumorais. 2.3 Tissue microarray (TMA). 2.4 Células-tronco. 2.5 Células-tronco tumorais. 2.6 Células-tronco tumorais em câncer de mama. 2.7 Alvos terapêuticos contra células-tronco tumorais. 3. OBJETIVOS. 4. MATERIAL E METODOS. 4.1 Regulamentação do estudo. 4.2 Seleção das amostras. 4.3 Diagnóstico histopatológico. 4.4 Construção do Tissue microarray (TMA). 4.5 Imunoistoquímica. 4.6 Leitura das lâminas. 4.7 Classificação imunoistoquímica das amostras. 4.8 Análise estatística. 5. RESULTADOS. 5.1 Classificação histopatológica. 5.2 Classificação em subtipos. 5.3 Marcação das células-tronco tumorais. 5.4 Análise estatística. 6. DISCUSSÃO. 6.1 Subtipos de tumores de mama. 6.2 Marcadores de células-tronco tumorais. 7. CONCLUSÃO. 8. REFERÊNCIAS. 9. TRABALHO CIENTÍFICO. ANEXOS. Anexo I. Anexo II. 1 3 5 9 10 11 14 14 16 18 23 25 27 28 28 28 29 30 31 33 33 34 35 35 38 42 45 46 47 53 55 70 83 84 85 1 Resu m o 2 FIGUEIROA, F.C. Expressão de marcadores de células-tronco em carcinoma espontâneo de mama em cadelas e sua correlação com o grau de agressividade nos diferentes subtipos de tumores. Botucatu, 2012. 105p. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. RESUMO Por ser a maior causa de morte entre as fêmeas caninas, o câncer de mama desperta o interesse da comunidade científica, pois sua apresentação e evolução clínica são muito semelhantes aos casos de câncer de mama na mulher. No intuito de permitir a continuação dos estudos comparativos entre os tumores de cadelas e os das mulheres, foram realizadas as marcações imunoistoquímicas para receptores de estrógeno (RE), HER-2, p63 e CK5, a fim de classificar os tumores de acordo com sua expressão, nos diferentes subtipos. Além disso, foram utilizados os marcadores para CD10, BMI-1, CD44, CD24, ESA e MUC-1 por meio da imunoistoquímica em lâminas resin-dentin bond components. Dent Mater 2005;21:232-41. 20. Chersoni S, Acquaviva GL, Prati C, Ferrari M, Gardini, S; Pashley DH, Tay FR. In vivo fluid movement though dentin adhesives in endodontically treated teeth. J Dent Res 2005;84:223-7. 21. Braga RR, César PF, Gonzaga CC. Mechanical properties of resin cements with different activation modes. J Oral Rehabil 2002;29:257– 66. 22. Melo RM, Bottno MA, Galvã RKH, Soboyejo WO. Bond strengths, degree of conversion of the cement and molecular structure of the adhesive–dentine joint in fibre post restorations. J Dent 2012;40:286-94. 23. Ho Y, Lai Y, Chou I, Yang S, Lee S. Effects of light attenuation by fibre posts on polymerization of a dual-cured resin cement and microleakage of post-restored teeth. J Dent 2011;39:309-15. 24. Anusavice KJ. Phillips RW. Science of dental materials. 11th, 2003. 25. Lui JL. Depth of composite polymerization within simulated root canals using lighttransmitting posts. Oper dent 1994;19:165-8. 27 4 ARTIGOS CIENTÍFICOS 4.2 ARTIGO 2 28 Title: Influence of light transmission through fiber posts on the microhardness and bond strength Authors: Morgan LFSA, Gomes GM, Poletto LTA, Ferreira FM, Pinotti MB, Albuquerque RC. Abstract Introduction: The aim of this study was to investigate the influence of light transmission through fiber posts in microhardness (KHN) and bond strength (BS) from a dual cured resin cement. Methods: Five fiberglass posts of different types and manufacturers represent a test group for the analysis of KHN (N=5) and BS and their displacement under compressive loads (N = 8). For the analysis of KHN a metallic matrix was developed to simulate the positioning of the cement after the cementation process intra radicular posts. The resistance to displacement, which will provide data of BS was measured using bovine incisors. After cementation, cross sections of the root portion of teeth in space led to post 1mm discs that have been tested for BS. The values were statistically analyzed by ANOVA, followed by Tukey's (P
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