Feedback

Estudo das comunidades microbianas associadas às infecções endodônticas de dentes decíduos sintomáticos e assintomáticos pelas técnicas do Multiple-Displacement Amplification e Checkerboard DNA-DNA Hybridization

Documento informativo

Universidade Federal de Minas Gerais Faculdade de Odontologia 1 “Estudo das comunidades microbianas associadas às infecções endodônticas de dentes decíduos sintomáticos e assintomáticos pelas técnicas do Multiple-Displacement Amplification e Checkerboard DNA-DNA Hybridization” WARLEY LUCIANO FONSECA TAVARES Belo Horizonte 2008 WARLEY LUCIANO FONSECA TAVARES 2 “Estudo das comunidades microbianas associadas às infecções endodônticas de dentes decíduos sintomáticos e assintomáticos pelas técnicas do Multiple-Displacement Amplification e Checkerboard DNA-DNA Hybridization” Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Odontologia. Área de Concentração – Endodontia Orientador: Prof. Dr. Antônio Paulino Ribeiro Sobrinho Co-orientadoras: Profa. Dra. Maria de Lourdes de A. Massara Profa. Dra. Flávia Teles Belo Horizonte Faculdade de Odontologia da UFMG 2008 3 Dedicatória À força infinita e suprema do meu DEUS, que me fortalece e está sempre presente ao meu lado como guia e fornecendo proteção. À minha mãe Maria Célia, pelo carinho apoio e orações, e ao meu pai Wander Tavares, pelo exemplo de sabedoria e maturidade, peças fundamentais em minha trajetória. Aos meus irmãos Wander Lúcio, Wagner e Wanessa. Aos meus novos sobrinhos Luís, Olívia, Emerson e Isabela, cuja alegria contagiante trouxe força nos momentos difíceis. Á minha namorada Renata pelo carinho, companheirismo, cumplicidade, apoio e compreensão nos momentos de abdicação. 4 Agradecimentos Especiais Ao Prof. Dr. Antônio Paulino Ribeiro Sobrinho, pelas virtudes inerentes. Um professor e orientador amigo, abnegado, conselheiro. Fundamentais foram os seus ensinamentos e incentivos nesta jornada que por aqui não finda. Meu muito obrigado por todo o seu apoio. À Profa Dr a . Maria de Lourdes de Andrade Massara. Sete anos se passaram, e o sonho se tornou realidade. . Lourdinha, muito obrigado por me apoiar desde os primeiros momentos e depositar em mim sua confiança. Sua competência cativante me incentivou durante toda a caminhada. Aos Profs. Dr. Ricardo Palmier Teles e Flávia Teles, por terem acolhido a um desconhecido aluno de Minas Gerais em sua casa. Profissionais únicos, cujo conhecimento, destreza e sabedoria geram inspiração. A amizade nascida durante minha estadia em Boston e o exemplo de competência profissional ficarão marcados para sempre. Aos professores Sigmund Socransky e Anne Hafajje, pelo acolhimento em seu laboratório e pela essencial ajuda na análise dos resultados do trabalho. À Profª. Drª. Maria Guiomar de Azevedo Bahia, pelas críticas e sugestões nos momentos necessários, que servirão de exemplo para meu engrandecimento profissional. Sua trajetória de professora e pesquisadora nos inspira em nossa profissão. Ao meu colega, professor e amigo Prof. Dr. Luiz Carlos, meu mestre. Sua amizade incondicional e seu incentivo constante tornaram a caminhada mais amena. Sua postura profissional e pessoal são exemplos a serem seguidos. “ Se consegui ver ao longe, foi porque me apoiei no ombro de gigantes” Isaac Newton Agradecimentos 5 À colega Luciana Brito, pela colaboração e indispensável ajuda durante este trabalho. Ao colega Ricardo Reis pela amizade e companheirismo. Aos colegas da Endodontia, Marta, Ana Cecília, Evandro, Fabiano e Guilherme Braga, por terem tornado os momentos de trabalho mais alegres. Às alunas do curso de especialização em Odontopediatria, pela ajuda essencial com as crianças e ao Prof. Júlio Noronha pelos ensinamentos e apoio. À Dra Luciana Moura, pelos ensinamentos sobre crianças e por ter sido fundamental com minhas amostras. Às auxiliares Neide e Leo, pela ajuda com os pacientes. Ao Dr. Aloísio Drummond pela colaboração do projeto “Sorria”. Ao The Forsyth Institute e a todos os seus funcionários pelo acolhimento e ajuda com os experimentos. Aos professores da disciplina de endodontia e demais professores do mestrado da Faculdade de Odontologia de Minas Gerais, pela colaboração em vários momentos, sempre facilitando o aprendizado. Ao meu amigo Gustavo, companheiro nesta jornada e à Luciana, meu braço direito. Aos meus amigos e familiares e a todos aqueles que de alguma forma contribuíram para que este sonho se tornasse realidade. A vocês o meu muito obrigado! 6 Sumário RESUMO ABSTRACT INTRODUÇÃO ARTIGO: “Microbial communities associated with asymptomatic and symptomatic deciduous root canal infections Analyzed by MultipleDisplacement Amplification and Checkerboard DNA-DNA Hybridization “ FIGURAS TABELA REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 11 14 17 22 40 46 48 7 RESUMO RESUMO 8 O Mulltiple Displacement Amplification (MDA) tem sido utilizado para amplificação uniforme do genoma de espécies bacterianas em diferentes amostras da cavidade oral. O MDA é particularmente útil em pequenas amostras, visto que o mesmo gera uma quantidade de amostra de DNA abundante para a análise microbiana. O objetivo do presente estudo foi avaliar a microbiota de infecções endodônticas de dentes decíduos. Um total de 35 crianças, de 4 a 10 anos de idade, apresentando dentes com raízes intactas ou menos que 2/3 de rizólise foram envolvidas no estudo. Quarenta amostras foram coletadas e amplificadas pela técnica do MDA. As amostras amplificadas foram analisadas pela hibridização DNA-DNA (Checkerboard) para taxas de 83 espécies bacterianas. Foram computadas as porcentagens de dentes colonizados por cada uma das espécies em diferentes limiares nas amostras amplificadas. Os níveis das espécies bacterianas encontradas em diferentes condições clínicas foram analisados. A significância das diferenças entre as proporções de cada espécie foram determinadas para amostras de canais radiculares de dentes com ou sem câmara pulpar exposta à cavidade oral, fístula, edema, e dor. A significância das diferenças para cada espécie nos diferentes cenários clínicos foi analisada pelo teste Kruskall-Wallis. A quantidade de DNA (± DP) nas amostras antes da amplificação era 5.2 (± 4.7) ng. Após o MDA, as amostras continham, em média, 6.05 (± 2.3) g de DNA. Oitenta das 83 sondas de DNA hibridizaram com uma ou mais amostras. As espécies bacterianas mais prevalentes em níveis > 104 células bacterianas foram Actinomyces naeslundii 1 e Prevotella intermedia, ambas presentes em 93.8% dos dentes analisados. O número médio de espécies (± DPM) detectadas por dente no nível de > 104 foi 20.19 (± 3.27). As espécies mais comumente encontradas neste nível foram Actinomyces naeslundii 1 e Prevotella intermédia. Quando a média de sondas de DNA x 105 (± DPM) foi analisada, as espécies mais abundantes foram A. naeslundii 1 (17.07±3.17), Prevotella nigrescens (1.12 ± 0.55) e P. intermedia (1.01 ± 0.30). Eikenella corrodens, Haemophilus aphrophilus, e Helicobacter pylori não foram detectados em nenhuma das amostras. Em relação à análise da microbiota associada a diferentes sinais e sintomas clínicos, diferenças estatisticamente significantes foram detectadas em algumas situações. Vinte e sete amostras foram estatisticamente significantes ao serem encontradas em maiores 9 contagens em dentes abertos. A. naeslundii 1, Veillonella parvula, Gemella morbillorum. Streptococcus oralis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans e Neisseria mucosa foram estatisticamente significantemente encontradas em maior número em dentes com exposição da câmara pulpar à cavidade oral. P. intermedia, Neisseria mucosa, Streptococcus anginosus, Selenomonas noxia e Streptococcus sanguinis foram detectados em contagens médias mais altas em dentes sem fístula. Não houve diferenças estatisticamente significantes na microbiota associada à presença ou ausência de edema. Dentes com dor apresentaram contagens elevadas de Prevotella nigrescens e Prevotella oris. A microbiota associada a canais radiculares de dentes decíduos demonstra ser mais complexa do que antes imaginado. Em conclusão, os resultados sugerem que espécies selecionadas estão associadas com os sinais e sintomas clínicos detectados em infecções endodônticas de dentes decíduos. Palavras chaves: Bactérias, Dentes decíduos, Hibridização DNA-DNA (“checkerboard”), Infecção endodôntica, “Multiple Displacement Amplification” (MDA). 10 ABSTRACT ABSTRACT 11 “Microbial communities associated with asymptomatic and symptomatic deciduous root canal infections Analyzed by Multiple-Displacement Amplification and Checkerboard DNA-DNA Hybridization “ Multiple Displacement Amplification (MDA) has been used to uniformly amplify the genome from bacterial species in different types of oral samples. MDA is particularly useful in small samples, since it generates abundant target for microbial analysis. The aim of the present study was to combine MDA and Checkerboard DNA-DNA hybridization to evaluate the microbiota of endodontic infections in deciduous teeth A total of 35 children, 4 to 10 years old, having teeth with intact roots or less than 2/3 of physiological root resorption were involved in this study. Forty root canal samples were collected.and amplified. Amplified samples were analyzed by checkerboard DNA-DNA hybridization for levels of 83 bacterial taxa. . Percentages of teeth colonized by each species at different thresholds in amplified samples were computed. Levels of bacterial species present in different clinical conditions were analyzed. Significance of differences between mean proportions of each species were determined for root canal samples taken from teeth with (open tooth) or without (closed tooth) pulp chamber exposure to oral cavity, sinus tract, swelling, and pain. Significance of differences for each species in these clinical scenarios was sought with Kruskall-Wallis test. The mean amount of DNA (± SD) in the samples prior to amplification was 5.2 (± 4.7) ng. After MDA, samples contained, on average, 6.05 (± 2.3) g of DNA. Eighty of 83 DNA probes hybridized with one or more samples. Most prevalent bacterial species at levels > 104 bacterial cells were Actinomyces naeslundii 1 and Prevotella intermedia, both present in 93.8%.of sampled teeth. The mean number of species (± SEM) detected per tooth at the > 104 level was 20.19 (± 3.27).The most commonly detected species at this level were Actinomyces naeslundii 1 and Prevotella intermedia When mean DNA probe counts x 105 (± SEM) were analyzed, the most abundant species were A. naeslundii 1 (17.07±3.17), Prevotella nigrescens (1.12 ± 0.55) and P. intermedia (1.01 12 ± 0.30). Eikenella corrodens, Haemophilus aphrophilus, and Helicobacter pylori were not detected in any of the samples. Upon the analysis of the microbiota associated with the different clinical signs and symptoms investigated, statistically significant differences could be detected in a few of them. Twenty seven species were statistically significantly increased in the open tooth group. A. naeslundii 1, Veillonella parvula, Gemella morbillorum. Streptococcus oralis, Aggregatibacter actinomycetemcomitans and Neisseria mucosa were statistically significant increased in teeth with pulp chamber exposure to oral cavity. P. intermedia, Neisseria. mucosa, Streptococcus anginosus, Selenomonas noxia and Streptococcus sanguinis were detected in higher mean counts in teeth without sinus tract. There were no statistically significant differences in the microbiota associated with presence or absence of swelling. Painful teeth presented increased counts of Prevotella nigrescens and Prevotella oris. The microbiota associated with root canals from deciduous teeth seems to be more complex than previously anticipated In conclusion, results suggest that selected species are associated with the clinical signs and symptoms detected in primary root canal infections. Keywords: Bacteria, checkerboard DNA-DNA hybridization, Endodontic infection, Multiple Displacement Amplification, Primary teeth. 13 INTRODUÇÃO INTRODUÇÃO 14 A manutenção dos dentes decíduos até a sua esfoliação é de fundamental importância para o crescimento e desenvolvimento normais dos arcos dentários, interferindo no posicionamento dos dentes permanentes, na postura da língua, dos lábios e das estruturas dos tecidos moles. Neste contexto, quando se faz necessário, o tratamento endodôntico destes dentes visa não somente preservar a homeostasia da cavidade oral, mas também evitar eventuais danos à formação do dente permanente subjacente (Pazelli et al., 2003; Bijoor & Kohli, 2005; Silva et al., 2006). Os microrganismos presentes na cavidade oral são os principais agentes etiológicos das alterações pulpares e perirradiculares, podendo estar envolvidos, de forma direta ou indireta, no desenvolvimento destas patologias (Kakehashi et al., 1965; Sundqvist, 1976). Ao longo dos anos, demonstrou-se o caráter polimicrobiano das infecções endodônticas na dentição permanente humana. Os estudos destas infecções utilizando cultura microbiológica encontraram um número médio de uma a trinta espécies bacterianas por canal radicular, com o número de células bacterianas variando de 102 a 108 UFC (Sundqvist, 1992, Lanna et al., 2001). Segundo Sundqvist (1992), parece também existir uma correlação entre o tamanho da lesão periapical e o número de espécies e células bacterianas presentes no sistema de canais radiculares (SCR) infectado. Os canais radiculares infectados abrigam uma diversidade de espécies bacterianas, em sua maioria, oriundas da cavidade oral (Siqueira Jr et al., 2000). A microbiota endodôntica é predominantemente anaeróbia obrigatória, com elevada incidência de morfotipos gram-negativos, principalmente aquela localizada no segmento apical do SCR. Uma compreensão mais acurada dos microrganismos presentes nestas infecções se deu com o desenvolvimento das técnicas de coleta, transporte e cultivos dos isolados. Utilizando cultura microbiana, as espécies mais prevalentemente encontradas nestas infecções são o Fusobacterium nucleatum, Eubacterium alactolyticum, Peptostreptococcus anaerobius, Bacteróides sp, Streptococcus sputigena e actinomicetos (Sundqvist, 1994; Lana et al., 2001). 15 Nos anos recentes, os métodos moleculares vêm sendo utilizados, acrescentando informações significativas sobre a microbiologia das infecções orais (Socransky et al., 1994; Siqueira Jr. et al., 2000). Muitas espécies microbianas, que antes não eram identificadas, são hoje detectadas e confirmadas como integrantes desta microbiota (Paster et al., 2001). Como exemplo, a presença de espiroquetas nas doenças infecciosas orais foi considerada como um achado raro durante muitos anos. Atualmente, quatro espécies têm sido amplamente identificadas, inclusive nas infecções dos SCR: Treponema dentícola, T. pectinovorum, T. socransckii e T. vicentii (Dahle et al., 1996; Chan & McLaughlin, 2000; Siqueira et al., 2000 e 2001, 2005; Brito et al., 2007). As técnicas baseadas na detecção do DNA permitem uma melhor descrição do ecossistema microbiano associado às infecções endodônticas, uma vez que podem detectar, inclusive, espécies não cultiváveis. Sabe-se hoje, que aproximadamente 50% das bactérias da cavidade oral permanecem ainda incultiváveis (Paster et al., 2001). Técnicas moleculares, tais como o PCR e o “Checkerboard” vêm sendo utilizadas em diversos estudos microbiológicos. Esta última técnica (“Checkerboard” - DNA-DNA Hybridization) permite analisar múltiplas amostras e múltiplas espécies bacterianas, simultaneamente (Socransky et al., 1994). Nenhum outro método apresenta o mesmo custo-benefício. Por sua vez, sua eficiência depende da viabilidade do DNA para que as sondas sejam preparadas, padronizadas e para que as amostras sejam analisadas. Além do mais, o tamanho da amostra bacteriana pode ser um problema, uma vez que seu nível de detecção está em torno de 104 UFC, o que seria um complicador quando da utilização de amostras recuperadas de canais radiculares infectados devido ao pequeno número de células aí presentes Recentemente esta limitação foi superada, associando-se o “checkerboard” à técnica do ”Multiple Displacement Amplification” (MDA) (Teles et al., 2007; Brito et al., 2007). Esta última técnica permite uma amplificação uniforme do DNA genômico total: amostras com pequenas quantidades de DNA, como por exemplo, aquelas de apenas 1 ng, podem ser amplificadas 1000 vezes. A amplificação alcançada fornece material suficiente para que se realizem várias análises de uma mesma amostra, além de permitir que pequenas amostras possam ser avaliadas alcançando-se os níveis de detecção da técnica de hibridização DNA-DNA. Utilizando-se esta associação de técnicas (MDA e “checkerboard”) em amostras recuperadas de 80 canais radiculares de pacientes atendidos na Faculdade de Odontologia da UFMG e processadas no Departamento de Periodontia do The Forsyth 16 Institute (Boston, USA), pela primeira vez, demonstrou-se uma elevada média de espécies microbianas em canais radiculares de dentes permanentes humanos infectados: aproximadamente 51 espécies. Estes resultados foram similares àqueles observados em amostras recuperadas de bolsas periodontais humanas (Brito et al., 2007). Encontra-se bem estabelecido que a iniciação, formação e persistência das lesões periapicais estão associadas à presença de microrganismos nos canais radiculares e em suas ramificações. Devido ao seu aspecto difuso e organizacional, a completa eliminação da microbiota presente nos SCR infectados ainda é um desafio à pratica clinica (Soares, 2002). A polpa de dentes decíduos reage às infecções bacterianas de maneira semelhante a dos dentes permanentes, ou seja, procura limitar a extensão do dano e iniciar a reparação tecidual Apesar disto, nem sempre os mecanismos de defesa e a tentativa de reparação nestes dentes são eficientes, podendo ocorrer reações inflamatórias irreversíveis, que culminam com a necrose pulpar (Raslan & Wetzel, 2006). Algumas características morfológicas diferenciam equilibrium value of MeCpG steps (,+14 deg.) [31,44]. In comparison, methylation has a significantly lower stability cost when happening at major groove positions, such as 211 and 21 base pair from dyad (mutations 9 and 12), where the roll of the nucleosome bound conformation (+10 deg.) is more compatible with the equilibrium geometry of MeCpG steps. The nucleosome destabilizing effect of cytosine methylation increases with the number of methylated cytosines, following the same position dependence as the single methylations. The multiple-methylation case reveals that each major groove meth- PLOS Computational Biology | www.ploscompbiol.org 3 November 2013 | Volume 9 | Issue 11 | e1003354 DNA Methylation and Nucleosome Positioning ylation destabilizes the nucleosome by around 1 kJ/mol (close to the average estimate of 2 kJ/mol obtained for from individual methylation studies), while each minor groove methylation destabilizes it by up to 5 kJ/mol (average free energy as single mutation is around 6 kJ/mol). This energetic position-dependence is the reverse of what was observed in a recent FRET/SAXS study [30]. The differences can be attributed to the use of different ionic conditions and different sequences: a modified Widom-601 sequence of 157 bp, which already contains multiple CpG steps in mixed orientations, and which could assume different positioning due to the introduction of new CpG steps and by effect of the methylation. The analysis of our trajectories reveals a larger root mean square deviation (RMSD) and fluctuation (RMSF; see Figures S2– S3 in Text S1) for the methylated nucleosomes, but failed to detect any systematic change in DNA geometry or in intermolecular DNA-histone energy related to methylation (Fig. S1B, S1C, S4–S6 in Text S1). The hydrophobic effect should favor orientation of the methyl group out from the solvent but this effect alone is not likely to justify the positional dependent stability changes in Figure 2, as the differential solvation of the methyl groups in the bound and unbound states is only in the order of a fraction of a water molecule (Figure S5 in Text S1). We find however, a reasonable correlation between methylation-induced changes in hydrogen bond and stacking interactions of the bases and the change in nucleosome stability (see Figure S6 in Text S1). This finding suggests that methylation-induced nucleosome destabilization is related to the poorer ability of methylated DNA to fit into the required conformation for DNA in a nucleosome. Changes in the elastic deformation energy between methylated and un-methylated DNA correlate with nucleosomal differential binding free energies To further analyze the idea that methylation-induced nucleosome destabilization is connected to a worse fit of methylated DNA into the required nucleosome-bound conformation, we computed the elastic energy of the nucleosomal DNA using a harmonic deformation method [36,37,44]. This method provides a rough estimate of the energy required to deform a DNA fiber to adopt the super helical conformation in the nucleosome (full details in Suppl. Information Text S1). As shown in Figure 2, there is an evident correlation between the increase that methylation produces in the elastic deformation energy (DDE def.) and the free energy variation (DDG bind.) computed from MD/TI calculations. Clearly, methylation increases the stiffness of the CpG step [31], raising the energy cost required to wrap DNA around the histone octamers. This extra energy cost will be smaller in regions of high positive roll (naked DNA MeCpG steps have a higher roll than CpG steps [31]) than in regions of high negative roll. Thus, simple elastic considerations explain why methylation is better tolerated when the DNA faces the histones through the major groove (where positive roll is required) that when it faces histones through the minor groove (where negative roll is required). Nucleosome methylation can give rise to nucleosome repositioning We have established that methylation affects the wrapping of DNA in nucleosomes, but how does this translate into chromatin structure? As noted above, accumulation of minor groove methylations strongly destabilizes the nucleosome, and could trigger nucleosome unfolding, or notable changes in positioning or phasing of DNA around the histone core. While accumulation of methylations might be well tolerated if placed in favorable positions, accumulation in unfavorable positions would destabilize the nucleosome, which might trigger changes in chromatin structure. Chromatin could in fact react in two different ways in response to significant levels of methylation in unfavorable positions: i) the DNA could either detach from the histone core, leading to nucleosome eviction or nucleosome repositioning, or ii) the DNA could rotate around the histone core, changing its phase to place MeCpG steps in favorable positions. Both effects are anticipated to alter DNA accessibility and impact gene expression regulation. The sub-microsecond time scale of our MD trajectories of methylated DNAs bound to nucleosomes is not large enough to capture these effects, but clear trends are visible in cases of multiple mutations occurring in unfavorable positions, where unmethylated and methylated DNA sequences are out of phase by around 28 degrees (Figure S7 in Text S1). Due to this repositioning, large or small, DNA could move and the nucleosome structure could assume a more compact and distorted conformation, as detected by Lee and Lee [29], or a slightly open conformation as found in Jimenez-Useche et al. [30]. Using the harmonic deformation method, we additionally predicted the change in stability induced by cytosine methylation for millions of different nucleosomal DNA sequences. Consistently with our calculations, we used two extreme scenarios to prepare our DNA sequences (see Fig. 3): i) all positions where the minor grooves contact the histone core are occupied by CpG steps, and ii) all positions where the major grooves contact the histone core are occupied by CpG steps. We then computed the elastic energy required to wrap the DNA around the histone proteins in unmethylated and methylated states, and, as expected, observed that methylation disfavors DNA wrapping (Figure 3A). We have rescaled the elastic energy differences with a factor of 0.23 to match the DDG prediction in figure 2B. In agreement with the rest of our results, our analysis confirms that the effect of methylation is position-dependent. In fact, the overall difference between the two extreme methylation scenarios (all-in-minor vs all-in-major) is larger than 60 kJ/mol, the average difference being around 15 kJ/ mol. We have also computed the elastic energy differences for a million sequences with CpG/MeCpG steps positioned at all possible intermediate locations with respect to the position (figure 3B). The large differences between the extreme cases can induce rotations of DNA around the histone core, shifting its phase to allow the placement of the methylated CpG steps facing the histones through the major groove. It is illustrative to compare the magnitude of CpG methylation penalty with sequence dependent differences. Since there are roughly 1.5e88 possible 147 base pairs long sequence combinations (i.e., (4n+4(n/2))/2, n = 147), it is unfeasible to calculate all the possible sequence effects. However, using our elastic model we can provide a range of values based on a reasonably large number of samples. If we consider all possible nucleosomal sequences in the yeast genome (around 12 Mbp), the energy difference between the best and the worst sequence that could form a nucleosome is 0.7 kj/mol per base (a minimum of 1 kJ/mol and maximum of around 1.7 kJ/mol per base, the first best and the last worst sequences are displayed in Table S3 in Text S1). We repeated the same calculation for one million random sequences and we obtained equivalent results. Placing one CpG step every helical turn gives an average energetic difference between minor groove and major groove methylation of 15 kJ/ mol, which translates into ,0.5 kJ/mol per methyl group, 2 kJ/ mol per base for the largest effects. Considering that not all nucleosome base pair steps are likely to be CpG steps, we can conclude that the balance between the destabilization due to CpG methylation and sequence repositioning will depend on the PLOS Computational Biology | www.ploscompbiol.org 4 November 2013 | Volume 9 | Issue 11 | e1003354 DNA Methylation and Nucleosome Positioning Figure 3. Methylated and non-methylated DNA elastic deformation energies. (A) Distribution of deformation energies for 147 bplong random DNA sequences with CpG steps positioned every 10 base steps (one helical turn) in minor (red and dark red) and major (light and dark blue) grooves respectively. The energy values were rescaled by the slope of a best-fit straight line of figure 2, which is 0.23, to Plano Diretor do Município de Paraguaçu. Projeto de Lei n. 22/2005. Prefeitura Municipal de Paraguaçu, 82 f., [14], Il. Edição fac-similar. ______. Prefeitura Municipal de Paraguaçu; Conselho Municipal do Patrimônio Histórico de Paraguaçu/MG; Memória Arquitetura Ltda. O Patrimônio Cultural de Paraguaçu/MG. Belo Horizonte. 2008. 30 p. Il. ______. Prefeitura Municipal de Paraguaçu; Conselho Municipal do Patrimônio Histórico de Paraguaçu/MG. 2ª Etapa do Inventário de Proteção do Acervo Cultural de Paraguaçu. Belo Horizonte. Julho/2006. 1 CD-ROM. PESEZ, Jean-Marie. A história da cultura material. In: LE GOFF, Jacques; CHARTIER, Roger; REVEL, Jacques (Org.). A Nova História. Coimbra (Portugal): Almedina, 1978. PINHEIRO, Mario Vitor. Avaliação técnica e história das enchentes em Itajubá. Dissertação (Engenharia de Energia) Universidade Federal de Itajubá. Itajubá (MG), 2005. Disponível em: < http://adm-neta.unifei.edu.br/phl/pdf/0029394.pdf> Acesso em 10 abr. 2009. PLANO de Assistência Sanitária à região de Furnas. O Paraguassu. Paraguaçu (MG), 10 abr. 1960. n 767 POLIGNANO, Marcus Vinicius et al. Uma viagem ao projeto Manuelzão e à bacia do rio das Velhas. 3. ed. Belo Horizonte. Maio de 2004. PRADO, Crezo Leite. Descendo o Sapucaí. A Voz da Cidade. Paraguaçu. 17 abr. 1993. 234 PRADO, Cristiano Otoni do. Crônicas dos 90 anos bem vividos. Belo Horizonte: Edições Cuatiara Ltda. 1993. PRADO, Guilherme. Paraguaçu: sua história, sua gente. Enciclopédia Paraguaçuense para Win 98/2000 / XP. Ver. 1.0. 08/2004. 120 MB. I CDROM; PRADO, Oscar. O Sertão dos Mandibóias – Fundação de Paraguaçu-MG. Paraguaçu. [1981?]. 276 p. ______. Os Mandibóias. O Paraguassu. Paraguaçu (MG). 18 set. 1949. PREFEITOS da região reúnem-se em Brasília. A Voz da Cidade. Paraguaçu (MG). 05 jun 1969. p. 1. PRÊMIO OURO AZUL. Informações. Disponível em: . Acesso em: 10 abr. 2010. PROJETO MANUELZÃO. META 2010: Revitalização da Bacia do Rio das Velhas. [Belo Horizonte] [2008?]. 1 folheto PROJETO MARIA DE BARRO. Informações. Disponível em: . Acesso em: 30 mai. 2009. ______. Proteger nossos solos. [Nazareno (MG)?], 2008. il. 1 folheto. QUEIROZ, Renato da Silva. Caminhos que andam: os rios e a cultura brasileira. In: REBOUÇAS, Aldo da Cunha; BRAGA Jr., Benedito P. F.; TUNDISI, J. G. (Org.) Águas doces no Brasil. São Paulo: Escrituras, 1999. QUINTAS, José Silva. Educação ambiental no processo de gestão ambiental. In: BRASIL, Ministério do Meio Ambiente. LAYRANGES, Philippe Pomier (Org.) Identidades da Educação Ambiental Brasileira. Brasília, 2004. Disponível em . Acesso em: 28 abr. 2008. RANCIÈRE, Jacques. O mestre ignorante: cinco lições sobre a emancipação intelectual. Tradução de Lilian do Valle. 2. ed. Belo Horizonte: Autêntica, 2007. 192 p. (Educação: Experiência e Sentido) REBELLO, Ricardo Moreira. O município de Machado até a virada do Milênio. Tomo I e II. Machado (MG), [s.n.] 2006. RENGER, Friedrich Ewald. Recursos minerais, mineração e siderurgia. In: GOULART, Eugênio Marcos Andrade (Org.). Navegando o rio das Velhas das minas aos gerais. Belo Horizonte: Instituto Guaicuy-SOS Rio das Velhas. Projeto Manuelzão UFMG, 2005. v. 2: Estudos sobre a Bacia Hidrográfica do Rio das Velhas. 755 p. Il. p. 265-288. 235 REPRESA de Furnas: baixo nível das águas. A Voz da Cidade. Paraguaçu (MG). 12 set 2000, p. 1. RESENDE, Eliseu. A epopéia de Furnas. O Estado de Minas. Belo Horizonte. 21 mai. 2007. Caderno Economia. p. 9. REZENDE, Roberto Leonel. Rudimentos históricos do município de São Gonçalo do Sapucaí/Minas Gerais. São Gonçalo do Sapucaí: Prefeitura Municipal de São Gonçalo do Sapucaí, 1992. RIBEIRO, Núbia Braga; GOULART, Eugênio Marcos: RADICCHI, Rômulo. A história da ocupação humana na versão do próprio rio. In: GOULART, Eugênio Marcos Andrade (Org.). Navegando o rio das Velhas das minas aos gerais. Belo Horizonte: Instituto Guaicuy - SOS Rio das Velhas. Projeto Manuelzão. UFMG, 2005. v. 2. p. 183-206. ROCHA, José Joaquim da. Mappa da Comarca do rio das Mortes pertencente a Capitania de Minas Gerais. 1777. Disponível em: < http://objdigital.bn.br/acervo_digital/div_cartografia/cart530294.jpg> Acesso em 10. abr. 2010. RODOVIA de Furnas será asfaltada. A Voz da Cidade. Paraguaçu (MG). 25 jun. 1967. p. 1. ROLNIK, Raquel. O que é cidade. São Paulo: Brasiliense, 1995. (Coleção Primeiros Passos) ROMANO FILHO, Demóstenes; SARTINI, Patrícia; FERREIRA, Margarida Maria. Gente cuidando das águas: meia dúzia de toques e uma dúzia de idéias para um jeito diferente de ver, sentir e cuidar da água. Belo Horizonte: Instituto de Resultados em Gestão Social, 2004. ROMEIRO, Adriana; BOTELHO, Ângela Vianna. Dicionário Histórico das Minas Gerais. Belo Horizonte: Autêntica, 2003. SALGADO, João Amilcar. As histórias submersas do rio que não quer morrer. In: GOULART, Eugênio Marcos Andrade (Org.). Navegando o rio das Velhas das minas aos gerais. Belo Horizonte: Instituto Guaicuy-SOS Rio das Velhas. Projeto Manuelzão. UFMG, 2005. v. 2. p. 209-238 SANTILLI, Juliana. Aspectos jurídicos da política nacional de recursos hídricos. [200_]. [Brasília?]. Disponível em: http://www.estig.ipbeja.pt/~ac_direito/Santilli.pdf > Acesso em: 12 out. 2009. SANTOS, Boaventura de Sousa. Um Discurso sobre as ciências. Edições Afrontamento; Porto; 1988. Disponível em: Acesso em: 02 jun. 2010. 236 SANTOS, Milton. Espaço e método. São Paulo: Nobel, 1977 ______. Pensando o espaço do homem. São Paulo: Editora Hucitec, 1982. SATO, Michele. Relações multifacetadas entre as disciplinas. In: BRASIL. Ministério da Educação. Secretaria de Ensino Fundamental. Congresso Brasileiro de Qualidade na Educação. Formação de Professores. Educação Ambiental. Brasília, 2002, v. 3, p. 16-22. SCHAMA, Simon. Paisagem e memória. Tradução de Hildegarde Feist. São Paulo: Companhia das Letras, 1996. SENNA, Nelson de. Annuario histórico chorographico de Minas Geraes, Belo Horizonte: Imprensa Oficial, 1918. SILVA, José Joaquim. Tratado de geografia descritiva especial da província de Minas Gerais. Belo Horizonte: Centro de Estudos Históricos e Culturais. Fundação João Pinheiro, 1997. 196 p. SILVA, Silvestre. Frutas no Brasil. Texto de Helena Tassara. São Paulo: Nobel, 2001. SILVEIRA, Victor (Org.). Minas Geraes em 1925. Bello Horizonte: Imprensa Official, 1926. 155p. il. SISTEMA FEDERAÇÃO DAS INDÚSTRIAS DE MINAS GERAIS. Os caminhos das águas. [Belo Horizonte]; [200-?]. 1 folheto. SOUZA, Luiz Neves de. Os 50 Anos do lago de Furnas. O Estado de Minas. Belo Horizonte. 28 fev. 2007. SOUZA, Washington Peluso Albino de. As lições das vilas e cidades de Minas Gerais In: SEMINÁRIO DE ESTUDOS MINEIROS. Universidade Federal de Minas Gerais. 4. Anais . Belo Horizonte: Universidade Federal de Minas Gerais, 1977. P. 97-241. SUL DE MINAS totalmente asfaltado. A Voz da Cidade. Paraguaçu (MG). 08 out. 1968. p. 1. TEIXEIRA, Eurico. Frutas do Brasil In: SILVA, Silvestre. Frutas no Brasil. Texto de Helena Tassara. São Paulo: Nobel, 2001. TEIXEIRA, Fausto. O Monjolo. Folha de Minas. 22 ago. 1948. Suplemento Literário, p. 2. Belo Horizonte. (fundo da Hemeroteca Pública do Estado de Minas Gerais. Secretaria de Estado da Cultura de Minas Gerais). 237 TEIXEIRA, Sávia Diniz Dumont; VARGAS FILHO, Demóstenes Dumont. ABC do rio São Francisco. Apoio do Instituto de Promoção Cultural (IPC); Ministério da Cultura (MinC). [S.l.]: Marques Saraiva Gráficos e Editores S.A, [1990?]. TELLES, Dirceu D‟Alkmin; COSTA, Regina Helena Pacca Guimarães. Reuso da água: conceitos, teorias e práticas. 1. ed. São Paulo: Editora Blucher, 2007. THOMAS, Keith. O homem e o mundo natural. São Paulo: Companhia das Letras, 1989. TUAN, Yi-fu. Topofilia: um estudo da percepção, atitudes e valores do meio ambiente. Tradução de Livia de Oliveira. São Paulo/Rio de Janeiro: Difel, 1974. VALLADÃO, Alfredo. Campanha da Princeza: estudo histórico. Rio de Janeiro: Typ. da “Revista dos Tribunais”, 1912, 79 p. VEIGA, Bernardo Saturnino da (Org.). Almanack Sul-Mineiro para 1874. Campanha: Typ. do Monitor Sul Mineiro,1874. 460 p. Edição fac-similar. ____. Almanack Sul-Mineiro para 1884. Campanha: Typ. do Monitor Sul Mineiro, 1884. Edição fac-similar. VENANCIO. Renato Pinto. Antes de Minas: fronteiras coloniais e populações indígenas. In: RESENDE, Maria Efigênia Lage de; VILLALTA, Luiz Carlos (Org.). As Minas Setecentistas, 1. Belo Horizonte: Autêntica; Companhia do Tempo, 2007. p. 87-126. VIDA PRESTAÇÃO DE SERVIÇOS EM ENGENHARIA, MEIO AMBIENTE E REFLORESTAMENTO LTDA; COMPANHIA DE SANEAMENTO DE MINAS GERAIS; COMITÊ DA BACIA HIDROGRÁFICA DO RIO SAPUCAÍ; GOVERNO DO ESTADO DE MINAS GERAIS. Plano Diretor de recursos hídricos da bacia do rio Sapucaí. GT. Resumo Executivo. Disponível em: < http://rapidshare.com/files/388829317/Resumo_Executivo.doc.html> Acesso em: 29 jun. 2010.
Estudo das comunidades microbianas associadas às infecções endodônticas de dentes decíduos sintomáticos e assintomáticos pelas técnicas do Multiple-Displacement Amplification e Checkerboard DNA-DNA Hybridization
RECENT ACTIVITIES

Autor

Documento similar

Tags

Estudo das comunidades microbianas associadas às infecções endodônticas de dentes decíduos sintomáticos e assintomáticos pelas técnicas do Multiple-Displacement Amplification e Checkerboard DNA-DNA Hybridization

Livre