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Estudos estruturais com fosfolipases A2 isoladas de venenos de serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus

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Documento informativo
Universidade Estadual Paulista – Júlio de Mesquita Filho Instituto de Biociências de Botucatu Estudos estruturais com fosfolipases A2 isoladas de venenos de serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus Carlos Alexandre Henrique Fernandes Orientador: Prof. Titular Marcos Roberto de Mattos Fontes Co-orientador: Dra. Débora Colombi Tese apresentada ao Instituto de Biociências de Botucatu como requerimento para obtenção do título de doutorado em Ciências Biológicas Área de Concentração: Genética Botucatu 2013 Aos meus pais, Manuel e Maria Lucia, pela enorme carinho e aprendizado que me proporcionaram. Ao meu filho Heitor, pelo seu sorriso que me põe de pé todos os dias. Agradecimentos Ao meu orientador, Marcos Fontes. E aqui dispenso o uso de sua titulação, porque meus agradecimentos vão além da orientação e dos conhecimentos transmitidos. Esses anos de trabalho em conjunto me fizeram crescer uma admiração e respeito pela sua pessoa inigualáveis. À Dra. Débora Colombi, pelos valiosos conhecimentos acerca da expressão heteróloga de proteínas recombinantes e do uso da técnica de mutação sítio dirigida. À Fundação de Auxílio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) que financiou o presente projeto de pesquisa. Ao Prof. Dr. Andreimar Martins Soares (Instituto Osvaldo Cruz – Rondônia), ao Dr. Salomon Huancahuire-Veja (Instituto de Biologia – UNICAMP) e à Dra. Consuelo L. Fortes-Dias (Fundação Ezequiel Diaz) por fornecer as amostras estudadas. Ao LNLS (Laboratório Nacional de Luz Síncroton) pelo apoio de suas instalações técnicas para coleta de dados de difração de raios X. Ao Prof. Dr. Cristiano Luis Pinto de Oliveira (IF-USP) pelo apoio técnico para a coleta de dados de espalhamento de raio X no equipamento NANOSTAR, em seu laboratório. Ao Prof. Dr. Amando S. Ito (FFCLRP-USP) pelo apoio técnico para a coleta de dados de espectroscopia de fluorescência em seu laboratório. Ao Prof. Dr. Roberto Morato Fernandez (Depto de Física e Biofísica – IBB-UNESP) pelo apoio e colaboração nos experimentos de espalhamento de raios X a baixo ângulo e espectroscopia de fluorescência. Ao Prof. Dr. Mario de Oliveira Neto (Depto de Física e Biofísica – IBB-UNESP) pela revisão do trabalho e pelos preciosos conhecimentos acerca da técnica de espalhamento de raios X a baixo ângulo. Ao Edson Comparetti, cujo trabalho de iniciação cientifica pude co-orientar e junto a ele, gerar excelentes resultados. Aos meus colegas de laboratório Agnes, Andrea, Ângelo, Guilherme, Fábio, Frey, Lino, Natália, Rafael e Walter pelo companheirismo nesses anos. A ajuda no dia a dia do laboratório, as nossas discussões científicas e a companhia de todos vocês foram essenciais para a realização desse trabalho. Ao pessoal do LBBC, Guilherme (às nossas memoráveis discussões de futebol), ao Luís Gustavo (às pescarias e às valorosas ajudas computacionais), ao Marcio (à nossa amizade e aos nossos devaneios científicos) e à Letícia (pelas ajudas, pela companhia e amizade e pelas risadas da hora do almoço). À Beatriz Troncone, a melhor irmã que alguém poderia ter. E é claro, à ela, Amanda Marcolino, por fazer continuamente meu mundo parar e nascer de novo. E cada vez mais bonito. “O começo de todas as ciências é o espanto das coisas serem o que são.” Aristóteles 1 Estudos estruturais com fosfolipases A2 isoladas de veneno de serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus Ainda nos dias de hoje, o envenenamento ofídico é um problema de saúde pública, afetando sobretudo, regiões de clima tropical, subtropical e áreas rurais de países da África, Ásia, Oceania e América Latina. No Brasil, os gêneros de serpentes Bothrops e Crotalus são responsáveis por quase 90% dos acidentes ofídicos, sendo que os acidentes provocados por este último apresentam relativa alta taxa de mortalidade. O veneno das serpentes do gênero Bothrops possuem uma classe de fosfolipases A2, as Lys49-PLA2s, que não possuem atividade catalítica, mas são capazes de induzir a mionecrose por uma mecanismo não catalítico que não é totalmente conhecido. Com relação às fosfolipases A2 veneno das serpentes do gênero Crotalus, o complexo crotoxina, formado pela crotoxina A (não catalítica) e a crotoxina B (catalítica) pode constituir até cerca de 60% do veneno desses animais, como no caso da subespécie Crotalus durissus terrificus, e é uma potente neurotoxina que provoca um grande bloqueio da transmissão neuromuscular. Neste trabalho, utilizando diversas técnicas teóricas e experimentais, sobretudo cristalografia de raios X, são apresentados diversos resultados que visam aprofundar o conhecimento acerca do funcionamento destas proteínas. Com relação à crotoxina, é apresentado a estrutura cristalográfica da crotoxina B de Crotalus durissus colillineatus, a expressão heteróloga da isoforma CBa2 da crotoxina B de Crotalus durissus terrificus para a posterior produção de formas mutantes sítio-dirigidas e resultados da análise do espalhamento de raios X a baixo ângulo da crotoxina e de suas subunidades isoladas, gerando informações relevantes e inéditas acerca da oligomerização destas proteínas. No caso das Lys49-PLA2s isoladas do veneno botrópico, são apresentadas duas novas estruturas cristalográficas dessa classe de proteínas isolada da serpente amazônica B. brazili. A análise destas duas estruturas e a comparação estrutural delas com outras Lys49-PLA2s gerou novas informações acerca da posição de aminoácidos hidrofóbicos na porção C-terminal, levando-se a proposição de um novo mecanismo de ação para estas proteínas. Também são apresentadas a análise funcional e a estrutura cristalográfica da PrTX-I isolada do veneno de B. pirajai complexada com dois inibidores diferentes que revelam novos modos de inibição da atividade miotóxica destas proteínas. São apresentados também diversos resultados provenientes de diferentes técnicas biofísicas que mostram que a MjTX-I, isolada do veneno de B. moojeni, é uma Lys49-PLA2 bastante peculiar, que pode formar diversas conformações oligoméricas. Por fim, são apresentados resultados teóricos e experimentais acerca da estrutura oligomérica de dois inibidores de origem proteica de fosfolipases A2 isolados do plasma sanguíneo de serpentes (αBaltMIP e CNF) cuja análise forneceu inéditas informações acerca da estrutura quaternária destas proteínas e de como ocorre a sua conjugação com as fosfolipases A2. Palavras-chave: Venenos de serpentes; fosfolipases A2, Bothrops, Crotalus, biologia molecular estrutural. 2 Structural studies with phospholipases A2 isolated from Bothrops and Crotalus genus snake venoms Snakebite is a very serious public health problem still today, affecting tropical and subtropical countries, especially the rural areas of Africa, Asia, Oceania and Latin America. In Brazil, Bothrops and Crotalus snake genus are responsible of almost 90% of snakebites. The venoms of Bothrops snakes have a class of phospholipases A2, known as Lys49-PLA2s, which do not have catalytic activity. However, they are able to induce myonecrosis by a non-catalytic mechanism that is not fully understood. In the venom of Crotalus snakes, a phospholipase A2, known as crotoxin constitutes about 60% of the venom from these animals. This protein is a potent neurotoxin that causes a large block of neuromuscular transmission formed by complexation of crotoxin A (non-catalytic) and crotoxin B (catalytic). In this work, it was used several theoretical and experimental techniques, in particular X-ray protein crystallography, to generate information to extend the knowledge of the action of these proteins. Regarding to crotoxin, the crystal structure of crotoxin B isolated from Crotalus durissus colillinetaus was solved and the heterologous expression of isoform CBa2 of crotoxin B from Crotalus durissus terrificus was performed, in order to, subsequently, produce site-directed mutants. Furthermore, it is presented small angle X-ray scattering experiments with the crotoxin and its isolated subunits that provided intriguing and novel information about the oligomerization of these proteins. Regarding to Lys49-PLA2s from Bothrops snakes, it is presented two new crystal structures of this class isolated from Amazonian snake B. brazili. The analysis of these structures and the structural comparison to other Lys49-PLA2s crystallographic structures generated new information about the position of hydrophobic residues in C-terminal portion of these proteins. This information led us to a new proposition of the mechanism of action of these proteins. It is also presented the functional analysis and the crystal structure of PrTX-I, isolated from B. pirajai, complexed with two different inhibitors. These structures showed new ways of inhibition of the myotoxicity induced by these proteins. Furthermore, it is also showed, using several different biophysical techniques, that MjTX-I, isolated from B. moojeni, is a unique Lys49-PLA2 that can form several different oligomeric conformations. Finally, it is presented theoretical and experimental results about the oligomeric conformation of two inhibitors of phospholipases A2 isolated from the blood plasma of snakes (αBaltMIP and CNF). The analyses of these results in novel information about quaternary structure of these proteins as well as about their complex with phospholipases A2. Keywords: Snake venom, phospholipases A2, Bothrops, Crotalus, Structural Molecular Biology. 3 Sumário 1. Capítulo 1: Introdução geral ao ofidismo________________________________ 16 1.1 Fosfolipases A2 (PLA2s): componentes protéicos de elevado interesse científico encontrados em venenos botrópicos e crotálicos . 20 2. Capítulo 2: Técnicas utilizadas ________________________________________ 26 2.1 Cristalografia de proteínas . 27 2.1.1 Cristalização ____________________________________________________________ 28 2.1.2 Coleta de dados de difração de raios X _______________________________________ 33 2.1.3 Substituição molecular, modelagem e refinamento da estrutura tridimensional ________ 36 2.2 Espalhamento de Luz Dinâmico . 38 2.3 Espalhamento de raios X a baixo ângulo . 39 2.4 Espectroscopia de dicroísmo circular . 42 2.5 Espectroscopia de fluorescência . 43 2.6 Estudos filogenéticos . 45 2.7 Modelagem computacional teórica e simulações de dinâmica molecular . 46 3. Capítulo 3: Material e Métodos ________________________________________ 48 3.1 Obtenção das amostras . 49 3.2 Expressão heteróloga da crotoxina B de Crotalus durissus terrificus . 49 3.3 Ensaios de cristalização, coleta e processamento de dados . 51 3.3 Espalhamento de luz dinâmico . 53 3.4 Cromatografia analítica de exclusão molecular . 53 3.5 Espalhamento de raios X a baixo ângulo . 54 3.6 Medidas de espectroscopia de dicroísmo circular . 55 3.7 Medidas de espectroscopia de fluorescência . 56 3.8 Estudos filogenéticos . 57 3.9 Modelagem teórica computacional e simulações de dinâmica molecular . 57 3.10 Estudos funcionais . 58 4. Capítulo 4: Crotoxina: potente neurotoxina isolada do veneno de Crotalus durissus ___________________________________________________________ 61 4.1 Resultados e discussão . 67 4.1.1 Cristalização da crotoxina B de Crotalus durissus collilineatus nativa e complexada com inibidores vegetais ____________________________________________________________ 67 4.1.2 Expressão heteróloga e experimentos de mutação sítio dirigida com a crotoxina B de Crotalus durissus terrificus _____________________________________________________ 70 4.1.3. Experimentos de raios X à baixo ângulo e espectroscopia de fluorescência ___________ 73 5. Capítulo 5: Lys49-PLA2s – Miotoxinas desprovidas de atividade catalítica ____ 85 5.1 Resultados e discussão . 95 4 5.1.1 Estruturas cristalográficas da BbTX-II e MTX-II, duas Lys49-PLA2s isoladas do veneno de Bothrops brazili – Proposta de um novo mecanismo de ação das Lys49-PLA2s botrópicas. ___ 95 5.1.2 Estruturas cristalográficas da PrTX-I complexada com inibidores vegetais (ácido caféico e ácido aristolóquico) – Explorando novos modos de inibição das Lys49-PLA2s botrópicas. ___ 108 5.1.3 Estudos estruturais com a Moojenitoxina-I (MjTX-I) isolada do veneno de Bothrops moojeni – uma Lys49-PLA2 que pode adotar diferentes conformações oligoméricas. _______ 115 6. Capítulo 6: Inibidores plasmáticos de PLA2s____________________________ 128 6.1 Resultados e Discussão . 130 6.1.1 αBaltMIP, um inibidor de fosfolipase A2 isolado do plasma sanguíneo de Bothrops alternatus __________________________________________________________________ 130 6.1.2 Crotalus neutralization factor (CNF), um γ-PLI isolado do plasma sanguíneo de Crotalus durissus terrificus ____________________________________________________________ 133 7. Capítulo 7: Conclusões finais_________________________________________ 147 8. Referências bibliográficas ___________________________________________ 151 9. Anexos ___________________________________________________________ 164 5 Lista de Figuras Figura 1: Esquema comparativo dos dois modelos de mecanismo catalítico das fosfolipases A2. O single-water mechanism tem apenas um intermediário, chamado de E*T1 e o assistingwater mechanism possui dois, chamados de E*T1 e E*T2. Adaptado de Bahnson (2005). . 23 Figura 2: Representação esquemática do enovelamento de uma sPLA2 do grupo IIA, gerada a partir do monômero da BthA-I-PLA2s de Bothrops jararacussu (PDB ID 1U73). 25 Figura 3: Etapas para resolução de uma estrutura protéica por cristalografia de proteínas de maneira . 27 Figura 4: Representação esquemática de um diagrama de fase bidimensional da solubilidade de uma proteína (Kobe et al., 1999). . 29 Figura 5: Diagrama das etapas de montagem do método de cristalização por difusão de vapor, sistema hanging drop. 31 Figura 6: Representação gráfica de um cristal. O centro da cela unitária é indicado por um ponto ( ) e cada molécula de proteína está representada por meias-luas ( ) (Souza et al., 2000). . 32 Figura 7: Difração de raios-X por um cristal. 34 Figura 8: Conjunto de planos (234) e a respectiva intersecção com a cela unitária. Este conjunto corta a face a em duas partes (h=2), b em 3 partes (k=3) e c em 4 partes (l=4). . 34 Figura 9: a. Aparato que sustenta o loop, b. Figura esquemática do modo em como o monocristal é preso ao loop, onde em (1) o cristal na gota, (2) como cristal é colocado no aparato com o loop e em (3) o cristal preso ao loop, c. detalhe do cristal preso ao loop. . 35 Figura 10: Imagem de difração de raios X. (Miotoxina – I [MjTX-I] do veneno de B. moojeni). . 35 Figura 11: Intensidade de espalhamento (Iq) e função de distribuição de distâncias (p(r)) de objetos de diferentes formas geométricas. Figura adaptada a partir de Svergun & Koch (2003) e gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Mario de Oliveira Neto. . 41 Figura 12: (a) Luzes circularmente polarizadas à esquerda e à direita que incidem sobre a amostra em um experimento de dicroísmo circular (CD); (b) Transformação da luz circularmente polarizada para uma elipticamente polarizada por conta da absorção diferencial das luzes circularmente polarizadas à esquerda e à direita pela amostra. A elipse é caracterizada por uma diferença do tamanho de seus eixos, cuja razão do menor para o maior fornece a tanθ, sendo θ a elipcidade. Figura adaptada de Hofmann, 2010. . 42 Figura 13: Representação em cartoon da estrutura da crotoxina de Crotalus durissus terrificus formada pelas subunidades CA2-CBb. A subunidade CBb é mostrada em azul e a cadeias α, β e γ da subunidade CA2 é mostrada em laranja, verde e vermelho, respectivamente. Adaptada de Faure et al. resin-dentin bond components. Dent Mater 2005;21:232-41. 20. Chersoni S, Acquaviva GL, Prati C, Ferrari M, Gardini, S; Pashley DH, Tay FR. In vivo fluid movement though dentin adhesives in endodontically treated teeth. J Dent Res 2005;84:223-7. 21. Braga RR, César PF, Gonzaga CC. Mechanical properties of resin cements with different activation modes. J Oral Rehabil 2002;29:257– 66. 22. Melo RM, Bottno MA, Galvã RKH, Soboyejo WO. 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Methods: Five fiberglass posts of different types and manufacturers represent a test group for the analysis of KHN (N=5) and BS and their displacement under compressive loads (N = 8). For the analysis of KHN a metallic matrix was developed to simulate the positioning of the cement after the cementation process intra radicular posts. The resistance to displacement, which will provide data of BS was measured using bovine incisors. After cementation, cross sections of the root portion of teeth in space led to post 1mm discs that have been tested for BS. The values were statistically analyzed by ANOVA, followed by Tukey's (P <0.05) between groups for KHN and BS. Results: The results showed no statistical differences for the different posts in KHN. For BS, the sum of thirds, a translucent post showed the highest values. Comparative analysis between the thirds of each post also showed statistically significant differences when comparisons of the same post-thirds showed no differences. Conclusion: For the cement used, the amount of light transmitted through the post did not influence the KNH nor the BS significantly, among the different posts and thirds evaluated. Key Words: light transmission, dental posts, microhardness, bond strength. 29 Introduction The use of pre-fabricated posts in the reconstruction of endodontically treated teeth, whose main objective is to retain the material reconstruction and minimize the occurrence and complexity of fractures, is well established in the literature (1). Clinically, the mechanical and chemical characteristics of fiber posts justify their usage (2). In relation to resin cements, three options regarding the method of polymerization are available: self-polymerizing, light-cured or dual polymerization (dual). Understanding the mechanism of polymerization of these systems (3) the choice of materials that do not depend on light seems to be more reliable for cementing intra radicular fiber posts. To investigate the capability of transmitting light by translucent post is the target of several recent authors (4-9). Most studies point to the decrease in light intensity (LI) by increasing the root depth. Quantitative assessments of LI, hardness, elastic modulus and degree of conversion can be found in these works. Undesirable effects of incomplete polymerization of the resin cements are of biological (10-12) due to toxicity, and mechanical (8,9,13-15), due to low bond strength values are described in the literature. The aim of this study is to investigate the effect of light transmission through fiber posts in Knoop microhardness number (KHN) and bond strength (BS) of a dual resin cement. The null hypothesis is that there is no statistically significant difference in KHN and BS for different depths evaluated for the dual resin cement following cementation of translucent posts. Material e Methods Five different fiber posts of two types and one resin cement were involved (Table 1). 30 Table 1 – Description of the posts and cement used. Post Manufacturer/Lote Type Quimical composition FGM Produtos Odontológicos Glass Fibers (80% ± 5), epoxy resin (20% ± 5), silica, silane and T1 Translucent (Brazil)/140410 polymerising promoters. Bisco, INC T2 Translucent (EUA)/0800007811 Glass Fibers (55%), Epoxy (45%). TetraethyleneglycolDimethacrylate (7.6%), Urethane Ivoclar-Vivadent Dimethacrylate (18.3%), Silicium Dioxide (0.9%), Ytterbium T3 Translucent (Liechtenstein)/M72483 Fluoride (11.4%), catalysers and stabilisers (<0.3%). Glass Fibers. C1 Ângelus (Brazil)/14818 Conventional Glass Fibers (87%), Epoxy resin (13%). C2 Ângelus (Brazil)/14874 Conventional Carbon Fibers (79%), Epoxy Resin (21%). Resin Cement Rely-X Unicem 3M ESPE (USA)/372990 Self-etch/ Dual Cure Powder: glass particles, initiators, sílica, substituted pyrimidine, calcium hidroxide, peroxide composite and pigment; liquid: metacrylate phosphoric acid Ester, dimethacrylate, acetate, stabilizer and initiator. White Post DC (FGM, Joinville, SC-Brazil), DT Light Post (Bisco, Inc, Schaumburg, ILUSA) and FRC Postec Plus (IvoclarVivadent, Liechtenstein) with similar compositions but with different amounts of chemical components, represent translucent (T) type, T1, T2 and T3 respectively. Exacto and Reforpost Carbon Fiber (Both Ângelus, Londrina, Pr-Brazil) with different compositions but opaque, represent conventional (C) type, C1 and C2 respectively. The posts were cut to standard height of 16 mm for both analysis, KHN and RA. KHN measurements The assessments targeted three different depths, namely: cervical third (CT), at a 4.1 to 6.8mm depth; middle third (MT), at an 8.8 to 11.5mm depth; and apical third (AT), at a 13.5 to 16mm depth. 31 A metallic apparatus matrix was designed and manufactured to support the posts, resin cement, and the tip of a curing light unit. Such a metallic apparatus consisted of four parts as showed in figure 1. Figure 1. Metallic matrix: (a) a frame, which contained the posts (e), (b) a support to standardize the position and volume of resin cement, (c) a support to standardize the length of each three third deep post regions and stabilize the set, (d) and an external cylinder, which holds the other part as well as incorporates the tip of curing light unit (f) at the top and also obstructs the influence of external sources of light. Patented CTIT/UFMG (BR 20 2012 015542 2). The frames were manufactured in the exact dimensions of each post by means of an electro erosion machining. Aimed at standardizing the quantitative radial light transmission, each third of the posts contained a 120-degree lateral side opening. The three thirds, were supposed to be assessed simultaneously. The measurement of all thirds, one at a time, was possible because the matrix allowed the removal of the resin cement blocks, separately, after polymerization, without destroying them. The matrix’s internal structure provided an adequate separation of each 32 third, which permitted their accurate evaluation. Each one was 1,6mm wide and 2,70 mm length. The major concern about this matrix was that the cement was inserted directly in projected spaces, in order to minimize the formation of bubbles. The posts were isolate from cement by a polyester strip. The time of light exposure was 40 seconds, and the LI remained above 420mW/cm2. The light curing unit used was Curing Light 2500(3M ESPE, USA). The set consisting of the curing light unit, the matrix, the post and the resin cement remained still throughout the assessments. After ten minutes, including 40s photopolymerization, the specimens were removed from the matrix and were immediately included in pre-molds (Buehler, USA) with crystal resin with black pigment and were poured into the device by using a Cast N’vac (Buehler, USA). After the cure of crystal resin, the specimens were removed from the pre-molds and stored dry, out of reach of light during 7 days. The surface to be analyzed was sequentially polished with # 320 to 1200-grit SiC papers and felt with diamond polish paste (Buehler, USA). A control group, using T1, was made of the same method but without a photopolymerization. KHN measurement was performed by a Micromet 5104(Buehler, Japan) using a static load of 50g for 10s. Sequentially, three indentations were performed for each third of each group. The values were obtained from the reading of the average of three indentations oriented long axis of the Kim, J.; Saito, K.; Sakamato, A.; Inoue, M.; Shirouzu, M.; Yokoyama, S. Crystal structure of the complex of the human Epidermal Growth Factor and receptor extracellular domains. Cell, v. 110, p. 775-787, 2002. Ortega, A.; Pino, J.A. Los constituyentes volátiles de las frutas tropicales. II. Frutas de las especies de Carica. Alimentaria. Revista Tecnología Higiene Alimentos, v. 286, p. 27-40, 1997. Oshima, J.; Campisi, J. Fundamentals of cell proliferation: control of the cell cycle. J. Dairy Sci., v. 74, p. 2778-2787, 1991. Ossovskaya, V.S.; Bunnett, N.W. Protease-activated receptors: contribution to physiology and disease. Physiol. Rer., v. 84, p. 579-621, 2004. Pardee, A. B. G1 events and regulation of cell proliferation. Science, v. 246, p. 603-608, 1989. Pardee, A. B.; Blagosklonny, M. The Restriction Point of the Cell Cycle. Cell Cycle, v. 1, p. 103-110, 2002. 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