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Estudo da heterogeneidade de monócitos de cães infectados ou não por Leishmania infantum

Documento informativo

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS Programa de Pós-Graduação em Patologia Vítor Silva Barbosa ESTUDO DA HETEROGENEIDADE DE MONÓCITOS DE CÃES INFECTADOS OU NÃO POR Leishmania infantum Belo Horizonte 2013 Vítor Silva Barbosa ESTUDO DA HETEROGENEIDADE DE MONÓCITOS DE CÃES INFECTADOS OU NÃO POR Leishmania infantum Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Patologia Geral da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito para a obtenção do título de Mestre em Patologia Investigativa. Orientador: Dr. Ricardo Gonçalves Coorientador: Dr. Wagner Luiz Tafuri Belo Horizonte 2013 Vítor Silva Barbosa ESTUDO DA HETEROGENEIDADE DE MONÓCITOS DE CÃES INFECTADOS OU NÃO POR Leishmania infantum Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Patologia Geral da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito para a obtenção do título de Mestre em Patologia Investigativa. Orientador: Dr. Ricardo Gonçalves ___________________________________________ Ricardo Gonçalves (Orientador – UFMG) ___________________________________________ Liz Ribeiro do Valle Antonelli – CPqRR/FIOCRUZ ___________________________________________ Ricardo Toshio Fujiwara - UFMG ___________________________________________ Wagner Luiz Tafuri - UFMG Belo Horizonte, 17 de dezembro de 2013. . Dedico essa dissertação à minha esposa Marta, ao meu filho Pedro, aos meus pais e irmãos e, in memorian, meus avós Martinho e Bernadete AGRADECIMENTOS Agradeço, Primeiramente a Deus pela oportunidade de chegar até aqui, mesmo que por caminhos árduos, que me talharam, tornando-me uma pessoa melhor. Aos meus pais e avós que me conduziram, apoiaram, consolaram nos momentos difíceis e deram força e incentivo para que eu concluísse essa etapa de minha vida. À minha esposa Marta que me apoiou, ajudou e acreditou na possibilidade de realização desse projeto de vida, juntamente com meu filho querido que me alegra pela sua coragem e força de vencer e superar os obstáculos que estão à sua frente. Duas pessoas que hoje são o meu mundo. Aos colegas do Laboratório de Patologia das Leishmanioses; Ao Professor Wagner Tafuri pelo acolhimento; Ao Professor Ricardo Gonçalves, pelo apoio, paciência e dedicação; À Dra. Lis Antonelli pelas colaborações tão essenciais; Ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico); E a todos que ajudaram direta ou indiretamente no desenvolvimento desse trabalho. Muito obrigado! Questionaram Mahatma Gandhi quais os fatores que destroem a humanidade. E ele respondeu: - A Política sem princípios, o Prazer sem compromisso, a Riqueza sem trabalho, a Sabedoria sem caráter, os Negócios sem moral, a Ciência sem humanidade e a Oração sem caridade. RESUMO Monócitos do sangue periférico compõem o maior grupo de células progenitoras circulantes. Suas funções vêm sendo reveladas com o estudo de suas subpopulações, especialmente em humanos e camundongos, em processos patológicos provenientes de doenças crônicas não infecciosas ou infecciosas transmissíveis. Dentre essas doenças estão as leishmanioses, das quais a mais grave é a forma visceral, caudadas por protozoários do gênero Leishmania. Esses são parasitos intracelulares obrigatórios em células do sistema fagocítico mononuclear do hospedeiro mamífero, como monócitos, macrófagos e células dendríticas. O cão (Canis familiares) representa o principal reservatório desse parasito, tendo papel central na transmissão a humanos. No Brasil, o parasito Leishmania (Leishmania) chagasi (sin. L. infantum) é o principal causador da leishmaniose visceral canina (LVA). Esse estudo objetivou caracterizar subpopulações de monócitos do sangue periférico de cães naturalmente infectados ou não infectados por L. infantum e comparar seus aspectos fenotípicos e funcionais. Amostras de sangue periférico foram colhidas de cães de diferentes grupos: não infectados (n=5) e infectados (assintomáticos (n=5) e sintomáticos (n=5). As células foram marcadas por anticorpos contra as moléculas: CCR2, CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD44, CD45RO, CD56, CD62L, CD80, CX3CR1 e MHC-II e analisadas por citometria de fluxo. Células CD14+ constituem cerca de 4% da população de leucócitos totais e quando avaliamos essas células observamos duas populações distintas de acordo com a expressão de CD14: uma com alta expressão de CD14 (CD14hi), constituindo cerca de 90% dos monócitos, apresentando núcleo basofílico em forma de ferradura, com maior capacidade fagocítica; e outra com baixa expressão de CD14 (CD14lo), constituindo cerca de 10% dos monócitos, com núcleo de aspecto menos basofílico em forma de rim. Na análise das demais moléculas de superfície observou-se diferenças na expressão entre as populações. Em cães com LV não há diferença de frequência entre as populações, todavia há aumento da frequência de células CD14+ totais em cães infectados. Notamos também acentuada redução da expressão de moléculas relacionadas à ativação dos monócitos como CCR2, CD11c, CD45RO, CD62L e MHCII, principalmente no grupo de cães sintomáticos, indicando possível inibição de sua ação no controle da doença. Palavras-chave: Monócitos, Cão, Leishmaniose, L. infantum. ABSTRACT Peripheral blood monocytes are the largest group of circulating progenitor cells. Its functions have been revealed through the study of their subpopulations, especially in humans and mice in pathological processes from infectious or noninfectious chronic diseases. Among the studied infectious diseases there is the leishmaniasis, which the most severe is the visceral leishmaniasis. Protozoa of the genus Leishmania are obligate intracellular parasites in cells of the mononuclear phagocyte system of the mammalian host, as monocytes, macrophages and dendritic cells. The dog (Canis familiar) is the main reservoir of this parasite, having a central role in the transmission to humans. In Brazil, the parasite Leishmania (Leishmania) chagasi (syn. L. infantum) is the main cause of the canine visceral leishmaniasis. This study aimed to characterize subpopulations of peripheral blood monocytes from uninfected or L. infantum naturally infected dogs and compare their phonotypical and functional aspects. Blood samples were collected from dogs from different groups: uninfected (n=5) and infected (asymptomatic (n=5) and symptomatic (n=5) with L. infantum. Cells were labeled by antibodies against the molecules: CCR2, CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD44, CD45RO, CD56, CD62L, CD80, CX3CR1 e MHC-II and the samples were obtained by flow cytometry. CD14+ cells represented about 4% of the total leucocytes and when analyzing those cells, it was observed two distinct populations according to CD14 expression: a population with high expression of CD14 (CD14hi), constituting about 90% of the monocytes showing basophilic and horseshoeshaped nucleus with greater phagocytic capacity, and another with low expression of CD14 (CD14lo), constituting about 10% of monocytes, showing less basophilic and kidney-shaped nucleus. The analysis of the other molecules showed different levels of expression between the two populations. In dogs with visceral leishmaniasis no difference in frequency was observed between populations, however there is an increase of CD14+ cells in infected dogs. We also noticed marked reduction of the expression of molecules related to the activation of monocytes (CCR2, CD11c, CD45RO, CD62L and MHC-II), especially in the group of symptomatic dogs, indicating a possible inhibition on the capacity of these cells to control the disease. Keywords: Monocytes, Dog, Leishmaniasis, L. infantum. LISTA DE ILUSTRAÇÕES FIGURA 1 - Estratégia de seleção (gating strategy) adotada para caracterização das populações. A) aquisição de células (1x106 eventos) em função do tempo; B) Para avaliar os leucócitos foi realizada a seleção das células de interesse após exclusão de doublets; C) Seleção de leucócitos; D) Células CD14+; E) seleção CD14+/SSC e F) em vermelho CD14hiSSChi; em azul CD14hiSSClo e em alaranjado CD14loSSClo. Dotsplot representativos de um animal não infectado. G) média da porcentagem de monócitos sobre leucócitos totais de cães do grupo Controle. FIGURA 2 FIGURA 3 FIGURA 4 - FIGURA 5 FIGURA 6 - Imagens representativas da expressão dos receptores através da média da intensidade de fluorescência e suas respectivas analises estatísticas, comparadas entre as populações de monócitos CD14hiSSChi, CD14hiSSClo, CD14loSSClo. A)CD14; B) MHC-II; C) CX3CR1; D) CD62L; E) CD11a; F) CD11b; G) CD56; H) CD16; I) CCR2; J) CD11c; K) CD80; L) CD44 e M) CD45RO. Imagens representativas da aquisição pós-sorting, representando as três populações de células CD14+. A) CD14hiSSClo (gate P4); B) CD14loSSClo (gate P5) e C) CD14hiSSChi (gate P6). Fotomicrografia das células obtidas por sorting e coradas por Panótico. Em aumento de 1000x: A) monócito CD14hi; B) monócito CD14lo; C-D) setas verdes indicando monócitos CD14lo e setas vermelhas indicando monócitos CD14hi; E) seta verde indicando monócito CD14lo e seta alaranjada indicando neutrófilo. Em aumento de 400x: F) seta verde indicando monócito CD14lo, seta vermelha indicando monócito CD14hi e setas alaranjadas indicando neutrófilos. Imagem representativa das populações de monócitos caninos de acordo com a expressão de CD14 e granulosidade. Monócitos CD14lo constituindo cerca de 10% e monócitos CD14hi constituindo cerca de 90%. Monócitos CD14hiSSClo e CD14loSSClo apresentaram capacidade fagocítica de formas promastigotas de L. infantum. A) porcentagem de monócitos CD14hiSSClo com formas promastigotas aderidas; B) porcentagem de monócitos CD14loSSClo com formas promastigotas aderidas; C e E) monócitos CD14loSSClo com formas promastigotas aderidas; B e F) monócitos CD14hiSSClo com formas promastigotas aderidas. FIGURA 7 FIGURA 8 - Imagens representativas do aumento de monócitos caninos em cães infectados de acordo com a expressão de CD14 e da porcentagem de monócitos sobre o total de eventos analisados. Em A (Controle), B (Assintomático) e C (Sintomático), aumento da população CD14+ representado pela quantidade e intensidade dos dots em vermelho. D) monócitos representam cerca de 4% no grupo Controle; E) monócitos representam cerca de 7% no grupo Assintomático; F) monócitos representam cerca de 9% no grupo Sintomático. G) gráfico de comparação da porcentagem de monócitos entre cães do grupo Controle (cor roxa), Assintomático (cor verde) e Sintomático (cor amarela). Imagens representativas da expressão dos receptores através da média da intensidade de fluorescência e suas respectivas análises 34 36 39 39 40 41 42 44 FIGURA 9 - estatísticas, comparadas entre os grupos de cães Controle (cor roxa), Assintomáticos (cor verde) e Sintomáticos (cor amarela). A) CD14 B)CCR2; C) CD11b; D) CD11a; E) CD62L e F) MHC-II. Imagens representativas da expressão dos receptores através da média da intensidade de fluorescência e suas respectivas análises estatísticas, comparadas entre os grupos de cães Controle (cor roxa), Assintomáticos (cor verde) e Sintomáticos (cor amarela). A) CD11c; B) CD80; C) CD44; D) CD45RO; E) CD56; F) CD16 e G) CX3CR1. Letras diferentes significam diferença estatística. 45 LISTA DE SIGLAS APC - Antigen Presenting Cells (Célula Apresentadora de Antígenos) APC - Allophicocyanin BSA - Bovine Serum Albumin (Albumina Sérica Bovina) CCR2 - C-C Chemokine Receptor Type 2 (Receptor de quimiocina tipo 2) CCZ - Centro de Controle de Zoonoses CD - Cluster of Differentiation (Grupamento de Diferenciação) CEUA - Comissão de Ética no Uso de Animais CX3CR1 - CX3C Chemokine Receptor 1 (Receptor 1 de quimiocina ) DAB - Diaminobenzidin DNA - Deoxyribonucleic Acid (Ácido Desoxirribonucléico) EDTA - Ácido Etileno Diamino Tetraacético ELISA - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (Ensaio Imunoenzimático) EUA – Estados Unidos da América FACS - Fluorescence Activated Cell Sorter FITC - Fluorescein Isothiocyanate (Isotiocianato de Fluoresceína) FSC - Foward Scatter (Dispersão Frontal) Foxp3 - Fator forkhead box P3 g – Gravidade Gp63 - Glicoproteína 63 HE - Hematoxilina e Eosina HLA-DR - Human Leukocyte Antigen (Antígeno Leucocitário Humano) H2O2 - Peróxido de Hidrogênio ICB – Instituto de Ciências Biológicas IHQ – Imuno-histoquímica IFN-γ - Interferon Gamma Ig – Imunoglobulina IL - Interleucina Kg – Quilograma LPG – Lipofosfoglicano LPL – Laboratório de Patologia das Leishmanioses LPS - Lipopolissacarídeo LSA - Leishmania Soluble Antigen (Antígeno Solúvel de Leishmania) LV - Leishmaniose Visceral LVC - Leishmaniose Visceral Canina M – Molar MFI – Mean of Fluorescence Intensity (Média de Intensidade de Fluorescência) MG – Minas Gerais MHC - Major Histocompability Complex (Complexo Maior de Histocompatibilidade) mg - Miligrama mL – Mililitro mRNA – Ribonucleic Acid Messenger (Ácido ribonucléico mensageiro) ng - Nanograma NO - Nitric Oxide (Óxido Nítrico) OMS - Organização Mundial de Saúde PAMP - Pathogen-Associated Molecular Patterns (Padrões Moleculares Associados a Patógenos) PBS - Phosphate Buffered Saline (Solução de Fosfato Tamponada) PCR - Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase) PE – R-Phycoerythrin Fluorescent Protein (Proteína Fluorescente R-Ficoeritrina) pH – potencial de Hidrogênio PPD - Purified Protein Derivative of Tuberculin RIFI - Reação de Imunofluorescência Indireta RPM – Rotações por Minuto SFM – Sistema Fagocítico Mononuclear SSC – Side Scatter (Dispersão lateral) TGF-Β - Transforming Growth Factor Beta (Fator de Crescimento Transformante Beta) Th – T helper (T auxiliar) TNF - Tumor Necrosis Factor (Fator de Necrose Tumoral) TLR - Toll Like Receptor (Receptor do Tipo Toll) UFMG – Universidade Federal de Minas Gerais WHO - World Health Organization LISTA DE ABREVIATURAS et al. - et alii (e outros) L. - Leishmania Lu. – Lutzomyia min. – minuto(s) sin./syn. (sinonímia/synonymy) SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 2 REVISÃO 2.1 Leishmaniose visceral canina 2.1.1 Ciclo biológico da Leishmania infantum 2.1.2 Resposta Imune 2.2 Monócitos 2.2.1 Funções dos monócitos 2.2.2 Monócitos e seus principais marcadores 2.2.3 Heterogeneidade dos monócitos 2.2.3.1 Diferenças funcionais entre as subpopulações 2.3 Monócitos caninos 3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral 3.2 Objetivos Específicos 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Comitê de ética 4.2 Grupos experimentais 4.2.1 Grupo Controle - Cães não infectados 4.2.2 Grupo infectado - Cães naturalmente infectados 4.3 Exame clínico 4.4 Testes sorológicos - ELISA e RIFI 4.5 Testes parasitológicos 4.5.1 Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase chain reaction - PCR) 4.5.2 Imuno-histoquímica (IHQ) 16 18 18 19 19 21 21 22 23 25 26 27 27 27 28 28 28 28 28 29 29 29 29 30 4.6 Análise fenotípica por citometria de fluxo 4.7 Sorting e avaliação citológica (cytospin) 4.8 Teste de fagocitose 4.9 Análise estatística 5. RESULTADOS 5.1 Caracterização dos monócitos (Avaliação quantitativa e qualitativa de subpopulações de monócitos) 5.1.1 Expressão de CD14 5.1.2 Análise fenotípica 5.2 Morfologia celular 5.3 Teste de fagocitose dos monócitos CD14hiSSClo e CD14loSSClo 5.4 Monócitos na Leishmaniose visceral canina 6 DISCUSSÃO 7 CONCLUSÕES REFERÊNCIAS ANEXOS 30 31 31 32 33 33 33 35 38 41 42 47 55 56 66 1. INTRODUÇÃO 16 Monócitos do sangue periférico compõem o maior grupo de células progenitoras circulantes. São capazes de migrar para os tecidos diferenciando-se em macrófagos e células dendríticas (DCs – Dendritic Cells) e desempenham importante papel na inflamação, reparo tecidual, imunidade e homeostase (Gordon e Taylor, 2005; Auffray, Sieweke e Geissmann, 2009; Yona e Jung, 2010). Assim como linfócitos, os monócitos apresentam heterogeneidade, mostrando singularidades quanto à sua diferenciação, fenótipo e destino. Suas funções vêm sendo reveladas com o estudo de suas subpopulações, principalmente em humanos e camundongos, em processos patológicos provenientes de doenças infecciosas transmissíveis ou não e doenças crônicas não transmissíveis (Strauss-Ayali, Conrad e Mosser, 2007; Cros et al., 2010; Saha e Geissmann, 2011; Appleby et al., 2013). Dentre as doenças infecciosas estudadas estão as leishmanioses, causadas por protozoários digenéticos, do gênero Leishmania, ordem Kinetoplastidae (Ross, 1903). Esse gênero está distribuído pela Ásia, Europa, Oriente Médio e Américas causando as diversas formas da doença (Figueiredo et al., 2013), das quais a mais grave é a leishmaniose visceral que leva a maioria dos indivíduos infectados à morte no período de dois anos, caso não sejam tratados (WHO, 2011). No Brasil, o parasito Leishmania (Leishmania) chagasi (sin. L. infantum) é o principal causador da leishmaniose visceral canina (LVC) e o flebótomo hematófago Lutzomyia longipalpis é o principal vetor dessa zoonose. O cão (Canis familiares) representa importante reservatório desse parasito, tendo papel central na transmissão a humanos, principalmente em regiões de degradação ambiental associadas à migração humana e ao processo de urbanização, representando sério problema de saúde pública (Deane, Deane e Alencar, 1955; Pinto et al., 2011; Figueiredo et al., 2013). Protozoários do gênero Leishmania são parasitos intracelulares obrigatórios de células do sistema fagocítico mononuclear (SFM) do hospedeiro mamífero, dentre eles os monócitos. Órgãos como linfonodos, baço, medula óssea, fígado, trato gastrointestinal e pele, pelo fato de terem quantidade considerável dessas células, estão associados às lesões histopatológicas clássicas observadas na LVC, (Anosa e Idowu, 1983; Keenan et al., 1984; Tafuri et al., 1996; Silva et al., 2013). Monócitos e macrófagos estão relacionados também à eliminação da Leishmania spp. através da síntese de citocinas, das quais, TNF-α (Tumor Necrosis Factor-alpha) e IFN-γ (Interferon-Gamma) desempenham papel central, induzindo formação e liberação de espécies reativas do oxigênio e óxido nítrico (ROS - Reactive Oxygen Species e NO - 17 Acesso em: 17 jul. 2009) 65 O Marechal Castelo Branco assumiu a Presidência da República em 15.04.1964. 116 A denominação do bairro remete à figura de Francisco dos Santos, o Chico dos Santos, dono de um rancho às margens do rio Machado onde ele administrava um entreposto de mercadorias, uma venda e uma pousada para os viajantes que comercializavam produtos através da estação de Fama (1896) da Estrada de Ferro Muzambinho e do barco que ia de Fama até a Cachoeira (ainda existente no rio Machado e próxima ao bairro). Segundo um de seus descendentes, Sr. João Esmeraldo Reis, nascido em 1932, figura de destaque no bairro, quando da construção de Furnas, a expectativa dos moradores é que a energia elétrica chegasse ao bairro. Até então apenas os moradores mais abastados do bairro eram sócios de uma pequena usina elétrica, inaugurada em 12 de abril de 1951.66 Em seu depoimento à pesquisadora, em estudo prévio sobre a comunidade atendida pela Fundamar, em 1994, Sr. João Esmeraldo relembrou as várias pontes construídas sobre o rio Machado, interligando o bairro do Chico dos Santos ao bairro do Coroado no município vizinho de Alfenas. Antes da construção da primeira ponte a travessia era de barco e para o gado era na água. Segundo o depoente, quando a primeira ponte foi construída, em torno de 1920, só aqueles que contribuíram para a obra tinham livre acesso. Os demais tinham que pagar para atravessar ou se valerem dos préstimos do barqueiro, Chiquinho Cordeiro. Depois que o rio Machado foi represado por Furnas, no bairro Chico dos Santos (1965?) a terceira ponte foi construída pela comunidade com ajuda de ambas prefeituras – Paraguaçu e Alfenas. O Sr. João Esmeraldo 66 O jornal “O Paraguassu”, Paraguaçu (MG), n. 496 de 15 abr. 1951 traz a notícia: “Inauguração da Luz Eletrica no Bairro Chicos dos Santos”. Segundo Sr. João Esmeraldo, eram vinte e dois sócios envolvidos na construção da usina de energia elétrica, captando as águas do ribeirão que deságua no rio Machado, no bairro Chico dos Santos. O responsável pela usina era Geraldo de Abreu, de Alfenas. 117 participou da construção da ponte de madeira amarrada com cipó, a base era de pedra e sua extensão era de 22m. Foi construída entre 25 de julho e 25 de agosto de 1967. Edição de “A Voz da Cidade” de 1º de outubro de 1967 confirma a informação de nosso depoente. Furnas só viria construir a ponte sobre o rio Machado, em substituição à antiga, já interditada, em 1981. O jornal “A Voz da Cidade” de 28 de março de 1981 refere-se a um convênio entre a Prefeitura Municipal de Paraguaçu e Furnas – Centrais Elétricas S/A para construção de obras para evitar o ilhamento de alguns produtores rurais, cujas propriedades localizam-se nas margens do lago de Furnas. Refere-se ainda à construção da nova ponte do rio Machado, de interesse direto dos moradores do Bairro dos Santos (bairro Chico dos Santos, em Paraguaçu) e do Coroado, no município de Alfenas, a ser executada diretamente por Furnas. Raro exemplo de publicação de memórias sobre um bairro rural do município de Paraguaçu, o livro “Memórias do Chico dos Santos”, de autoria de Edson Vianei Alves (1949-2002), sobrinho materno do depoente João Esmeraldo, registra suas lembranças sobre o rio Machado, ao tempo de seu pai, Joaquim Felipe: “No rio Machado, ele [o pai] pescava dourado, curimba, tubarana, piapava, mandi, bagre e lambari.” (ALVES, 2000, p. 34) Sr. José Cavaleiro, mais conhecido por Tonico Cavaleiro (1933), também nascido e ainda morador no bairro Chico dos Santos, lembra-se também das boas pescarias no rio Machado. Mas afirma que o represamento do rio facilitou muito a vida, pela facilidade de captação d‟água para a lavoura, 118 principalmente do alho, principal atividade do bairro na década de 50 a 60.67 Sr. Hélio Meirante, nascido em 1935, também nascido e ainda residente nas mesmas terras que foram de seus pais, às margens do rio Machado, lembra-se que seu pai perdeu três alqueires de terra e foi indenizado pelo valor nominal das mesmas. Seu irmão, Ademir de Souza Meirante, nascido em 1953, calcula em dez alqueires as terras perdidas por seu pai para Furnas. A chegada dos técnicos de Furnas no bairro é rememorada pelos irmãos Meirante: Foi uma coisa. Da moda que a gente nem esperava. Que antes a gente via passar, fazer a marcação, e ficava abismado de ver aquelas condução no meio do pasto. Que era para fazer a marcação, onde a água ia atingir. [.] Eles não explicava nada. Eles entrava [sic] no meio do pasto, com aqueles jipes, com aqueles aparelhos, marcando tudinho. Eles nunca veio [sic] aqui. (Depoimento do Sr. Hélio Meirante, 2009) Foi enchendo e foi acabando tudo. Se não vendesse [para Furnas] já perdia tudo. Lá no retiro, pra baixo do Matão, o rapaz não quis vender a casa, o terreno, de jeito nenhum. Não vendeu. Eu vi a casa, o terreno foi subindo, sumiu tudo. Perdeu tudo. [.] Que nem eles falou [sic]: „aqui tando cheio é nossa, tando seco é seu‟. (Depoimento do Sr. Ademir Meirante, 2009) Sr. Tonico Cavaleiro, quando indagado sobre a reação da população do bairro à chegada de Furnas, disse: “o povo achou bão [sic] e é bão [sic] até hoje”.68 67 O almanaque “O Sul-Mineiro Ilustrado” em reportagem intitulada “O Desenvolvimento de Paraguassú e a Administração Cristiano Otoni do Prado”, datado de 1941, informa sobre a cultura de alho no município, cuja produção “figura em primeiro logar no Brasil”. 68 Os depoimentos desses moradores ribeirinhos foram filmados por um grupo de educadores da Fazenda-Escola Fundamar, em 2009. Fragmentos de seus depoimentos foram incorporados a uma apresentação em PowerPoint integrante do instrumento de capacitação dos educadores, objeto dessa dissertação. 119 6.9. CINQUENTENÁRIO DE FURNAS: DUAS VERSÕES DISTINTAS Em 2000, a denúncia sobre as péssimas condições sanitárias do lago de Furnas era objeto do jornal “A Voz da Cidade”, em 1º de setembro. À época a preocupação era com o baixo nível das águas do lago, que prejudicava o turismo, principal fonte de renda da população lindeira. O jornal faz um paralelo entre os prejuízos daquele momento e aqueles sofridos à época da constituição do lago. E especula sobre as causas do rebaixamento do nível das águas, entre elas, a rivalidade entre o então presidente Fernando Henrique Cardoso e o governador Itamar Franco69, sobre a privatização de Furnas. Segundo essa versão, frente às ameaças do governador contra a privatização, o Presidente teria pedido à direção da empresa para esvaziar o lago. O jornal ainda noticia uma reunião de representantes da Associação dos Municípios do Lago de Furnas (ALAGO) com a diretoria da empresa em 28.11.2000, para encontrar soluções para as agressões ambientais que a represa vinha sofrendo, bem como recuperar o passivo que a empresa tinha com os municípios lindeiros: Diariamente são despejados no local, dejetos sanitários, industriais e agrotóxicos. A falta de infra-estrutura e a de uma política de utilização do Lago vem comprometendo o desenvolvimento da região, que aposta no turismo como uma das ferramentas para reverter a estagnação econômica. (A VOZ DA CIDADE, 12 set. 2000, p. 1) Em 2007, ano do cinqüentenário de Furnas, o jornal Estado de Minas, de Belo Horizonte, trouxe dois artigos sobre o evento, que evidenciam opiniões distintas sobre os impactos gerados pelo empreendimento. 69 O governador Itamar Franco e o Presidente Fernando Henrique Cardoso assumiram seus respectivos cargos em 1999. O Presidente iniciava então seu segundo mandato. 120 Luiz Neves de Souza, mestre em turismo e meio ambiente, em artigo intitulado “Os 50 Anos do Lago de Furnas”, denuncia a ausência de políticas públicas que canalizassem esforços voltados à preservação ambiental e também de projetos consistentes e objetivos para o fomento e desenvolvimento do turismo na região. E reclama: Basta percorrer as 34 cidades do Lago de Furnas e observar, em todas elas, toneladas de rejeitos em esgoto e lixo, além de defensivos agrícolas que são despejados em diversas regiões que se dizem próprias para o turismo e para a prática de esportes náuticos, para não falar da situação caótica da rede viária local. (SOUZA, 2007) O senador Eliseu Resende, no artigo intitulado “A Epopéia de Furnas” em “homenagem evocativa ao cinqüentenário”, imagina que sem a energia elétrica e a Petrobrás, o Brasil estaria hoje nos mesmos níveis de muitos países da África. Durante esse tempo [desde 1957] construímos nossos portos e modernizamos outros; instalamos a indústria química de base; desenvolvemos a produção de veículos e de navios; e entramos, firmes, na aeronáutica. Para tudo isso contribuiu a energia de Furnas e a que ela transporta e distribui, pelo principal sistema de interligação das grandes geradoras nacionais (RESENDE, 2007, p. 9). Ambos pontos de vista refletem faces distintas de um mesmo fato histórico. A percepção do ganho pela geração de energia para o desenvolvimento industrial nacional versus os prejuízos Kim, J.; Saito, K.; Sakamato, A.; Inoue, M.; Shirouzu, M.; Yokoyama, S. Crystal structure of the complex of the human Epidermal Growth Factor and receptor extracellular domains. Cell, v. 110, p. 775-787, 2002. Ortega, A.; Pino, J.A. Los constituyentes volátiles de las frutas tropicales. II. Frutas de las especies de Carica. Alimentaria. Revista Tecnología Higiene Alimentos, v. 286, p. 27-40, 1997. Oshima, J.; Campisi, J. 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