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Identificação de genes associados com a eficiência na aquisição de fósforo em milho, com foco nos genes PSTOL1, STR1 e STR2

Documento informativo

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA TESE DE DOUTORADO Identificação de genes associados com a eficiência na aquisição de fósforo em milho, com foco nos genes PSTOL1, STR1 e STR2 DOUTORANDO: Gabriel Corradi Azevedo ORIENTADORA: Dra. Cláudia Teixeira Guimarães CO-ORIENTADORA: Dra. Sylvia Morais de Sousa BELO HORIZONTE Fevereiro/2015 GABRIEL CORRADI AZEVEDO Identificação de genes associados com a eficiência na aquisição de fósforo em milho, com foco nos genes PSTOL1, STR1 e STR2 Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Genética do Departamento de Biologia Geral do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Genética. Orientadora: Dra. Cláudia Teixeira Guimarães Co-orientadora: Dra. Sylvia Morais de Sousa BELO HORIZONTE Fevereiro/2015 2 i3ii Dedico esta tese aos meus pais Henrique e Zólvia, À Guilherme e Gabriela, pelo amor, confiança e compreensão. i4v AGRADECIMENTOS Ao programa de Pós-Graduação em Genética e à Universidade Federal de Minas Gerais pela oportunidade de formação profissional. A CAPES pela concessão da bolsa. A Embrapa Milho e Sorgo por me dar todas as condições de exercer, com o máximo de excelência, meu trabalho; Aos meus orientadores, família, amigos e pessoas especiais que estiveram presentes e contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho. Acima de tudo, agradeço a Deus. 5v “O todo sem a parte não é todo, A parte sem o todo não é parte, Mas se a parte o faz todo, sendo parte, Não se diga, que é parte, sendo todo.” Gregório de Matos Guerra (1636-1696) v6i SUMÁRIO RESUMO . 14 ABSTRACT. 15 DELINEAMENTO DA TESE. 16 INTRODUÇÃO GERAL. 17 A cultura do milho . 17 A importância do fósforo na produção agrícola . 17 Mecanismos para aumento da eficiência de aquisição do fósforo em plantas. 18 Interação com fungos micorrízicos arbusculares. 20 Mapeamento de QTLs relacionados com morfologia radicular e associação micorrízica em milho . 22 O gene responsável pela tolerância à deficiência de P em arroz (PSTOL1) . 23 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS . 25 OBJETIVOS. 33 Objetivo geral. 33 Objetivos específicos . 33 CAPÍTULO 1. 34 QTL mapping and gene expression analyses reveal that PSTOL candidate genes are associated with root morphology and phosphorus acquisition in maize . 34 Abstract. 35 Background. 35 Results. 37 Transgressive segregation of phenotypic traits in RILs . 37 Surface area is an important root trait contributing to seedling dry weight and P content . 37 Two distinct QTL mapping strategies reveal complementary results . 38 ZmPSTOL predicted proteins share a conserved serine/threonine kinase domain with OsPSTOL1 . 39 ZmPSTOL candidate genes have distinct expression patterns. 40 Discussion . 40 Complex inheritance of root traits, seedling dry weight and P content in maize. 40 Coincidence of QTLs for root morphology in the seedling stage with QTLs for grain yield . 41 ZmPSTOL genes may be involved with root morphology and/or P content in maize . 42 Conclusions . 44 Material and methods. 44 7vii Mapping population. 44 Quantitative analysis of root traits, seedling biomass accumulation and P content using a paper pouch system. 45 Linkage map . 46 QTL mapping . 46 Identification of maize PSTOL1 homologs. 48 Mapping candidate genes . 48 Gene expression analysis . 49 References . 51 FIGURES. 58 TABLES . 63 ADDITIONAL FILES. 70 CAPÍTULO 2. 74 Análise funcional de homólogos aos genes STR1 e STR2, relacionados à associação micorrízica, em milho . 74 INTRODUÇÃO. 74 MATERIAL E MÉTODOS. 75 Avaliação dos domínios proteicos dos STR1 e STR2 de milho, sorgo, arroz e M. truncatula . 75 Experimento de inoculação em casa de vegetação . 75 Avaliação quantitativa e qualitativa da colonização micorrízica. 76 Determinação do conteúdo de fósforo nos tecidos da planta . 77 Extração de RNA e síntese de cDNA. 77 Análise da expressão gênica . 78 RESULTADOS E DISCUSSÃO . 79 Conservação de domínios entre STR1 e STR2 de milho, sorgo, arroz e M. truncatula . 79 Produção de matéria seca e acúmulo de P nos tecidos das linhagens de milho contrastantes para o uso de fósforo . 79 Avaliação da colonização radicular e do desenvolvimento dos arbúsculos de R. irregularis . 83 Análise temporal e espacial da expressão dos genes STR1 e STR2 em milho e de outros genes relacionados a associação micorrízica . 87 CONCLUSÃO . 91 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS . 92 MATERIAL SUPLEMENTAR . 96 CONCLUSÃO GERAL E PERSPECTIVAS FUTURAS . 101 v8iii ANEXO . 102 i9x LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO 1 Figure 1 Frequency distribution of traits evaluated in 145 maize RILs grown in low-P (2.5 µM). The P-efficient (L3) and the P-inefficient (L22) parental lines are indicated by arrows. 58 Figure 2 QTLs identified for root traits, seedling dry weight and P content using single and multiple traits MIM analyses. The markers are represented as vertical traces along the horizontal lines, which represent the chromosomes and are numbered in centiMorgans. The candidate genes are depicted below the red vertical traces. QTL profiles for single trait MIM are shown as colored lines according to the legend for root length (RL), root average diameter (RD), root surface area (SA), surface area of fine roots (SA2), root:shoot ratio (R:S), total seedling dry weight (TDW) and total P content (Pcont). Multi trait QTL profiles are shown as black line. The QTL peaks are depicted with an inverted triangle colored according to the legend followed by the bin. The confidence interval (95%) for each QTL is represented by a horizontal line above the chromosomes colored according to the legend. . 59 Figure 3 Phylogenetic tree of predicted serine/theronine receptor-like kinases from maize, rice and Arabidopsis thaliana. The rice PSTOL1, the six maize proteins sharing more than 55% sequence identity to OsPSTOL1, PR5K and SNC4 from Arabidopsis thaliana were grouped separately from other rice kinases, and are highlighted. Numbers on branches are bootstrap values for the percentage of coincidence (%) inferred from 1,000 replicates. Only percentage values higher than 80% are shown. 61 Figure 4 Expression profiles of the ZmPSTOL genes. The expression of the maize candidate genes are presented as relative gene expression (RQ) evaluated in roots and shoots of maize seedlings of the two parental lines L3 (P-efficient) and L22 (P-inefficient) grown under two levels of P (2.5 and 250 µM) after 13 days of treatment. Error bars indicate the standard errors of three technical replicates composed of three seedlings each. . 62 ADDITIONAL FIGURES Figure S1 Alignment of the OsPSTOL1 and six maize serine/theronine receptor-like kinases highlighting the predicted domains. Letters in green indicate the glycosil hydrolase domain and in red, the transmembrane domain. The kinase domain is represented by a gray background, whereas the ATP-binding site is highlighted with black background with white letters and the Serine/Threonine protein kinase active site with yellow background. . 72 1x0 CAPÍTULO 2 Figura 1. Produção de matéria seca da (A) raiz e da (B) parte aérea em L3 e L22 com e sem inoculação de Rhizophagus irregularis. A biomassa foi medida 10, 20, 30, 40 e 50 dias após o transplantio. As barras de erro indicam a DMS (diferença mínima significativa) considerando cinco repetições biológicas. L3 - linhagem eficiente no uso do P; L22 linhagem ineficiente no uso do P. 80 Figura 2. Razão da massa seca da raiz em relação à massa seca da parte aérea para L3 e L22 com e sem inoculação por Rhizophagus irregularis. A biomassa foi medida 10, 20, 30 e 40 dias após o transplantio. As barras de erro indicam a DMS (diferença mínima significativa) para cinco repetições biológicas. L3 - linhagem eficiente no uso do P; L22 linhagem ineficiente no uso do P. 81 Figura 3. Conteúdo de P na (A) raiz e na (B) parte aérea de L3 e L22 com e sem inoculação de Rhizophagus irregularis. O conteúdo de P foi medido aos 10, 20, 30, 40 e 50 dias após o transplantio, multiplicando a massa seca pela concentração de P de cada tecido da planta. Barras de erro indicam a DMS (diferença mínima significativa) para cinco repetições biológicas. L3 - linhagem eficiente no uso do P; L22 - linhagem ineficiente no uso do P. 83 Figura 4. Colonização micorrízica nas raízes das linhagens L3 e L22 coradas com Trypan blue. (A) e (B) Vesículas (v) nas raízes da L22; (C) Arbúsculos (Ar) e vesículas (v) na L3; (D) Arbúsculos (Ar) e hifa (Hf) na L3; (E) colonização total, de arbúsculos e vesículas em diferentes épocas de coleta. Barras de erro indicam a DMS (diferença mínima significativa) para cinco repetições biológicas. L3 - linhagem eficiente no uso do P; L22 - linhagem ineficiente no uso do P. 84 Figura 5. Imagens do microscócopio confocal de arbúsculos de R. irregularis corados com WGA-AlexaFluor488 em células corticais de L3 e L22. (A), (C), (E) e (G) arbúsculos visualizados em raízes de L3 coletadas aos 20, 30, 40 e 50 dias após o transplantio (dat), respectivamente; (B), (D), (F) e (H) arbúsculos visualizados em raízes de L22 coletadas aos 20, 30, 40 e 50 dat, respectivamente. Setas brancas indicam os arbúsculos. L3 - linhagem eficiente no uso do P; L22 - linhagem ineficiente no uso do P. 85 Figura 6. Análise de box plot representando a distribuição do tamanho dos arbúsculos nas linhagens L3 e L22 aos 20, 30, 40 e 50 dias após o transplantio. L3 - linhagem eficiente no uso do P; L22 - linhagem ineficiente no uso do P. 87 Figura 7. Análise da expressão relativa dos genes STR1 e STR2 em milho. A expressão foi analisada por PCR em tempo real nas raízes de duas linhagens de milho contrastantes para a eficiência no uso do P, L3 (eficiente) e L22 (ineficiente), aos 20 e 50 dias após o transplantio. A inoculação foi realizada com 500 esporos de R. irregulares e o tratamento 1x1i controle não recebeu inoculação. As barras de erro indicam o desvio padrão para três repetições biológicas. 88 Figura 8. Análise da expressão relativa dos genes ZmAM3 e RiEF em milho. A expressão foi analisada por PCR em tempo real nas raízes de duas linhagens de milho contrastantes para a eficiência no uso do P, L3 (eficiente) e L22 (ineficiente), aos 20 e 50 dias após o transplantio. A inoculação foi realizada com 500 esporos de R. irregulares e o tratamento controle não recebeu inoculação. As barras de erro indicam o desvio padrão para três repetições biológicas. 89 Figura 9. Análise da expressão relativa dos genes ZmPT3 e ZmPT6 em milho. A expressão foi analisada por PCR em tempo real na parte aérea (somente para ZmPT3) e raízes de duas linhagens de milho contrastantes para a eficiência no uso do P, L3 (eficiente) e L22 (ineficiente), aos 20 e 50 dias após o transplantio. A inoculação foi realizada com 500 esporos de R. irregulares e o tratamento controle não recebeu inoculação. As barras de erro indicam o desvio padrão para três repetições biológicas. . 90 MATERIAL SUPLEMENTAR Figura suplementar 1. Alinhamento do STR1 de milho, sorgo, arroz e Medicago truncatula. O domínio ABC é destacado em amarelo. . 97 Figura suplementar 2. Alinhamento do STR2 de milho, sorgo, arroz e Medicago truncatula. O domínio ABC é destacado em amarelo. . 99 Figura suplementar 3. Raízes de milho coletadas a 40 dias após o transplantio. (A) L3 inoculada com R. irregularis; (B) L3 sem inoculação; (C) L22 inoculada com R. irregularis e (D) enfocar la importancia de la producción mediática de los niños en su descubrimiento del mundo, sobre todo utilizando el periódico escolar y la imprenta. Asimismo las asociaciones de profesores trabajaron en esta línea e incluso la enseñanza católica se comprometió desde los años sesenta realizando trabajos originales en el marco de la corriente del Lenguaje Total. Páginas 43-48 45 Comunicar, 28, 2007 En el ámbito de los medios, también desde el principio del siglo XX hay ciertas corrientes de conexión. Pero es a lo largo de los años sesenta cuando se constituyeron asociaciones de periodistas apasionados por sus funciones de mediadores, que fomentaron la importancia ciudadana de los medios como algo cercano a los jóvenes, a los profesores y a las familias. Así se crearon la APIJ (Asociación de Prensa Información para la Juventud), la ARPEJ (Asociación Regional de Prensa y Enseñanza para la Juventud), el CIPE (Comité Interprofesional para la Prensa en la Escuela) o la APE (Asociación de Prensa y Enseñanza), todas ellas para la prensa escrita Estas asociaciones fueron precedidas por movimientos surgidos en mayo de 1968, como el CREPAC que, utilizando películas realizadas por periodistas conocidos, aclaraba temas que habían sido manipulados por una televisión demasiado próxima al poder político y realizaba encuentros con grupos de telespectadores. cipio del siglo XX, y nos han legado textos fundadores muy preciados, importantes trabajos de campo y muchos logros educativos y pedagógicos. La educación en medios ha tenido carácter de oficialidad de múltiples maneras, aunque nunca como una enseñanza global. Así la campaña «Operación Joven Telespectador Activo» (JTA), lanzada al final de los años setenta y financiada de manera interministerial para hacer reflexionar sobre las prácticas televisuales de los jóvenes, la creación del CLEMI (Centro de Educación y Medios de Comunicación) en el seno del Ministerio de Educación Nacional en 1983, la creación de la optativa «Cine-audiovisual» en los bachilleratos de humanidades de los institutos en 1984 (primer bachillerato en 1989) y múltiples referencias a la educación de la imagen, de la prensa, de Internet. La forma más visible y rápida de evaluar el lugar de la educación en medios es valorar el lugar que se le ha reservado en los libros de texto del sistema educa- 2. Construir la educación en los medios sin nombrarla El lugar que ocupa la edu- La denominación «educación en medios», que debería cación en los medios es muy ambiguo, aunque las cosas están cambiando recientemente. entenderse como un concepto integrador que reagrupase todos los medios presentes y futuros, es a menudo percibida En principio, en Francia, co- por los «tradicionalistas de la cultura» como una tendencia mo en muchos otros países, la educación en los medios no es hacia la masificación y la pérdida de la calidad. una disciplina escolar a tiempo completo, sino que se ha ido conformado progresivamente a través de experiencias y reflexiones teóricas que han tivo en Francia. Una inmersión sistemática nos permi- permitido implantar interesantes actividades de carác- te constatar que los textos oficiales acogen numerosos ter puntual. Se ha ganado poco a poco el reconoci- ejemplos, citas, sin delimitarla con precisión. miento de la institución educativa y la comunidad es- colar. Podemos decir que ha conquistado un «lugar», 3. ¿Por qué la escuela ha necesitado casi un siglo en el ámbito de la enseñanza transversal entre las dis- para oficilializar lo que cotidianamente se hacía en ciplinas existentes. ella? Sin embargo, la escuela no está sola en esta aspi- Primero, porque las prácticas de educación en me- ración, porque el trabajo en medios es valorado igual- dios han existido antes de ser nombradas así. Recor- mente por el Ministerio de Cultura (campañas de foto- demos que no fue hasta 1973 cuando aparece este grafía, la llamada «Operación Escuelas», presencia de término y que su definición se debe a los expertos del colegios e institutos en el cine ), así como el Minis- Consejo Internacional del Cine y de la Televisión, que terio de la Juventud y Deportes que ha emprendido en el seno de la UNESCO, definen de esta forma: numerosas iniciativas. «Por educación en medios conviene entender el estu- Así, esta presencia de la educación en los medios dio, la enseñanza, el aprendizaje de los medios moder- no ha sido oficial. ¡La educación de los medios no apa- nos de comunicación y de expresión que forman parte rece oficialmente como tal en los textos de la escuela de un dominio específico y autónomo de conocimien- francesa hasta 2006! tos en la teoría y la práctica pedagógicas, a diferencia Este hecho no nos puede dejar de sorprender ya de su utilización como auxiliar para la enseñanza y el que las experiencias se han multiplicado desde el prin- aprendizaje en otros dominios de conocimientos tales Páginas 43-48 46 Comunicar, 28, 2007 como los de matemáticas, ciencias y geografía». A pe- mente en todas las asignaturas. Incluso los nuevos cu- sar de que esta definición ha servido para otorgarle un rrículos de materias científicas en 2006 para los alum- reconocimiento real, los debates sobre lo que abarca y nos de 11 a 18 años hacen referencia a la necesidad no, no están totalmente extinguidos. de trabajar sobre la información científica y técnica y En segundo lugar, porque si bien a la escuela fran- el uso de las imágenes que nacen de ella. cesa le gusta la innovación, después duda mucho en Desde junio de 2006, aparece oficialmente el tér- reflejar y sancionar estas prácticas innovadoras en sus mino «educación en medios» al publicar el Ministerio textos oficiales. Nos encontramos con una tradición de Educación los nuevos contenidos mínimos y las sólidamente fundada sobre una transmisión de conoci- competencias que deben adquirir los jóvenes al salir mientos muy estructurados, organizados en disciplinas del sistema educativo. escolares que se dedican la mayor parte a transmitir Este documento pretende averiguar cuáles son los conocimientos teóricos. La pedagogía es a menudo se- conocimientos y las competencias indispensables que cundaria, aunque los profesores disfrutan de una ver- deben dominar para terminar con éxito su escolaridad, dadera libertad pedagógica en sus clases. El trabajo seguir su formación y construir su futuro personal y crítico sobre los medios que estaba aún en elaboración profesional. Siete competencias diferentes han sido te- necesitaba este empuje para hacerse oficial. nidas en cuenta y en cada una de ellas, el trabajo con Aunque el trabajo de educación en los medios no los medios es reconocido frecuentemente. Para citar esté reconocido como disciplina, no está ausente de un ejemplo, la competencia sobre el dominio de la len- gua francesa definen las capa- cidades para expresarse oral- La metodología elaborada en el marco de la educación en mente que pueden adquirirse con la utilización de la radio e, medios parece incluso permitir la inclinación de la sociedad incluso, se propone fomentar de la información hacia una sociedad del conocimiento, como defiende la UNESCO. En Francia, se necesitaría unir el interés por la lectura a través de la lectura de la prensa. La educación en los medios las fuerzas dispersas en función de los soportes mediáticos y orientarse más hacia la educación en medios que al dominio adquiere pleno derecho y entidad en la sección sexta titulada «competencias sociales y cívi- técnico de los aparatos. cas» que indica que «los alum- nos deberán ser capaces de juz- gar y tendrán espíritu crítico, lo que supone ser educados en los las programaciones oficiales, ya que, a lo largo de un medios y tener conciencia de su lugar y de su influencia estudio de los textos, los documentalistas del CLEMI en la sociedad». han podido señalar más de una centena de referencias a la educación de los medios en el seno de disciplinas 4. Un entorno positivo como el francés, la historia, la geografía, las lenguas, Si nos atenemos a las cifras, el panorama de la las artes plásticas : trabajos sobre las portadas de educación en medios es muy positivo. Una gran ope- prensa, reflexiones sobre temas mediáticos, análisis de ración de visibilidad como la «Semana de la prensa y publicidad, análisis de imágenes desde todos los ángu- de los medios en la escuela», coordinada por el CLE- los, reflexión sobre las noticias en los países europeos, MI, confirma año tras año, después de 17 convocato- información y opinión rias, el atractivo que ejerce sobre los profesores y los Esta presencia se constata desde la escuela mater- alumnos. Concebida como una gran operación de nal (2 a 6 años) donde, por ejemplo, se le pregunta a complementariedad (2000) Structure and mechanism of the aberrant ba3-cytochrome c oxidase from Thermus thermophilus. EMBO J 19: 1766–1776. 9. Hunsicker-Wang LM, Pacoma RL, Chen Y, Fee JA, Stout CD (2005) A novel cryoprotection scheme for enhancing the diffraction of crystals of recombinant cytochrome ba3 oxidase from Thermus thermophilus. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 61: 340–343. 10. 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