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Cytokinins and coconut water promoted abnormalities in zygotic embryo culture of oil palm

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Songklanakarin J. Sci. Technol. 33 (6), 653-657, Nov. - Dec. 2011 http://www.sjst.psu.ac.th Original Article Cytokinins and coconut water promoted abnormalities in zygotic embryo culture of oil palm Komgrit Inpeuy, Suhaimine Chaemalee and Sompong Te-chato* Department of Plant Science, Faculty of Natural Resources, Prince of Songkla University, Hat Yai, Songkhla, 90112 Thailand. Received 9 April 2011; Accepted 4 October 2011 Abstract Induction of adventitious shoot formation from mature zygotic embryo of oil palm was carried out in liquid MS medium supplemented with various types of cytokinins. Kinetin (KN) alone at concentration of 0.5 mg/l gave the highest adventitious shoot formation at 13.4%. However, abnormal shoots in form of inflorescence-like structure (ILS) were obtained in 5 mg/l KN containing medium. For coconut water a big ILSs were formed at 10.6%. Histological studied revealed that those inflorescences had no clear floral organs. Keywords: oil palm, zygotic embryo culture, abnormality, cytokinin, coconut water 1. Introduction Several studies have been conducted to commercialize in vitro propagation of oil palm that could help to overcome the limitations associated with conventional asexual propagation techniques and to increase the number of plants produced in a short time. Two main sources of explants were chosen for the in vitro culture; young leaf (Ahee et al., 1981; Pannetier et al., 1981) and zygotic embryos (Teixeira et al., 1993). In these two explants, embryo explants are more convenient because fruit are readily available, have a high degree of physiological uniformity, and can be shipped to a long distances. Recently, secondary somatic embryogenesis (SSE) was reported to be an efficient technique for plant propagation from both sources of explants (Hilae and Techato, 2007). Multiple shoot formation in in vitro culture is a disadvantage by using single shoot in this palm. Induction of embryo-derived shoots (EDS) through somatic embryogenesis is now recognized as a useful technique for propagation and in vitro conservation of oil palms. The whole * Corresponding author. Email address: stechato@yahoo.com processes of culture oil palms are no longer need cytokinin for shoot development from EDS or germination of somatic embryo (SE). Aberlence-Bertossi et al. (1999) observed that cultivating the cell suspensions for one month in a large quantity of liquid hormone-free medium, followed by plating the cells on BA-enrich medium, promoted the growth of proembryos, which then developed into globular and bipolar stage embryos. Flowering involves complex developmental and physiological mechanisms and it is sensitive to environmental factors. The ability of explants to produce flowers in vitro depends upon various factors such as internal and external ones, as well as chemical and physical factors, which cannot be predicted. In terms of chemical factors, plant growth regulators play an important role in flowering. There have been some reports on in vitro flowering of orchids but it was species-dependent. Most of in vitro flowering orchids were stimulated by cytokinin (Kostenyuk et al., 1999). Benzyladenine (BA) at 20 M was effective for the promotion of flowering in the endangered species Kniphofia leucocephala Baijnath compared with isopentenyl adenine (2i-P) and zeatine (ZEA) (Taylor et al., 2005; Nguyen et al., 2006). Coconut water (CW) was found to be essential to trigger the formation of transitional shoot apical meristem and was found 654 K. Inpeuy et al. / Songklanakarin J. Sci. Technol. 33 (6), 653-657, 2011 to enhance inflorescence initiation and flower bud formation (Sim et al., 2007). In case of rose cv. “First Prize”, sucrose was reported to be the key factor in floral morphogenesis, while cytokinin increased the flowering percentage and helped the normal development of floral buds (Nguyen et al., 2006). So far, floral induction in vitro in oil palm tissue culture was not documented. Te-chato (2009) reported that flowering of oil palm was observed from tissue culturederived plants at nursery stage. This event suggests that plant growth regulator (PGR) used for the tissue culture might affect the differentiation of floral organ after acclimatization to soil. Only few authors reported in vitro floral induction in date palm (Ammar et al., 1987; Masmoudi-Allouche et al., 2009). In these cases the authors indicated that photoperiod was a key factor in inducing both male and female flowers on 5-month-old seedlings. This paper reports the effects of BA, kinetin (KN) and CW in culture medium on abnormality of plantlet regeneration in vitro of oil palm. 2. Materials and Methods Mature fruits of open pollinated oil palm were collected from various numbers of hybrid tenera (Dura x Pisifera; D x P) trees at Surat Thani Estate. The fruits were brought to the laboratory and mesocarp was completely removed from the fruits. The seeds were gently cracked and zygotic embryos surrounded by kernel were carefully removed using a sharp scalpel. The embryos with kernel were again trimmed to form a small cube of size 5x5x8 mm and used as explants for culture. The explants were surface sterilized by 70% ethyl alcohol for one minute and 20% Clorox for 20 minutes. Surface sterilant was removed from the explant by successive washing with sterile distilled water 3-5 times in a laminar flow station. The embryos were aseptically removed from kernel and cultured on culture medium without plant growth regulators. 2.1 Germination, adventitious shoot formation, and detection of flowering in vitro Single shoots obtained by culturing mature zygotic embryo (MZE) on hormone-free MS medium for two months were decapitated and separated longitudinally into half segments. Each half was cultured in liquid MS medium supplemented with 3% sucrose and either 5 mg/l benzyl adenine (BA), 5 mg/l kinetin (KN), 0.5 mg/l thidiazuron (TDZ) or 15% CW. Each cytokinin or CW was used singly or in combination. All the liquid media were adjusted to pH 5.7 prior to autoclaving at 1.07 kg/cm2, 120°C for 15 min. The cultures were maintained on rotary shaker at 100 rpm at 27±2°C under a 14–hr photoperiod with fluorescent lamps at 20 mmol/m2/ sec. After two months of culture viability and germination of ZE, multiple shoot formation, and flowering were recorded at monthly intervals. 2.2 Histological analysis ILSs developed in liquid MS medium supplemented with 15% CW, 0.5 mg/l BA and 0.5 mg/l KN were collected and fixed in FAA II solution (formalin:glacial acetic acid:70% ethanol 5:5:90 v/v), dehydrated in ethanol-tertiary butanol series for 48 hrs and embedded in Parafin (Paraplast). Embedded tissues were sectioned with rotary microtome at 6-8 µm. The sections were stained with ‘Fast Green’ and Saffranin, and mounted with Permount on slide glass. Histological observation was carried out under blight field illumination of compound microscope. 2.3 Data analysis For experimental design and statistical analysis, CRD with 4 replicates (each treatment was replicated twice and each replicate consist of 10 embryos/explants) was performed. The percentage of cultures that produced adventitious shoots or floral organ from different cross combinations was recorded every month after four months. The data were analyzed using analysis of variance (ANOVA) and mean among treatments was separated by Duncant’s multiple range test (DMRT). 3. Results Each shoot half cultured on solidified MS medium with all types and concentrations of PGR could not produce multiple shoots after three month of culture. Only one shoot was obtained from a half shoot explant (Figure 1). Different genotypes gave different responses. D174xP206 cultured with 5 mg/l BA or 5 mg/l KN survived at 100%, which was significantly different (p<0.05) from the other two genotypes (Table 1). Survived half shoot produced only one shoot with one to two leaves. Cultured half shoot in PGR-free medium turned brown at the highest percentage in all genotype tested (see Table 1). However, a slightly higher number of roots (0.25 root/shoot) was observed in this medium. Genotype D366xP110 gave the best response in shoot development with average leaf number of 2.1 leaves/explant when cultured Figure 1. Development of single shoot (A) from cultured half shoot in solidified and adventitious shoots formation (B) in liquid MS medium for three months. (bar=1cm). 655 K. Inpeuy et al. / Songklanakarin J. Sci. Technol. 33 (6), 653-657, 2011 Table 1. Effect of PGRs on development of cultured half shoot on MS medium supplemented with 3% sucrose and 0.65% agar for three months. Crosses PGR (mg/l) Survival rate (%) No. of leaves/ shoot No. of roots/ shoot Browning percentage D174XP206 PGR-free BA(5) KN (5) TDZ (0.5) CW (150)1 61.9bc 100.0a 100.0a 54.3bc 79.1ab 1.3bc 1.4bc 1.6abc 1.0c 2.1a 0.0b 0.1ab 0.0b 0.0b 0.0b 49.5a 18.1bc 31.4abc 29.5abc 18.1bc D366XP110 PGR-free BA(5) KN (5) TDZ (0.5) CW (150)1 68.9abc 87.8ab 88.9ab 61.1bc 74.4ab 1.4bc 1.2bc 1.5bc 1.0c 2.1a 0.3a 0.0b 0.0b 0.0b 0.0b 48.9a 42.2ab 11.1c 31.1abc 17.8bc D865XP110 PGR-free BA(5) KN (5) TDZ (0.5) CW (150)1 65.6bc 56.7bc 67.8abc 37.8c 77.8ab 1.2bc 1.1c 1.3bc 1.0c 1.7ab 0.1b 0.0b 0.0b 0.0b 0.0b 48.9a 41.1ab 37.8abc 35.6abc 23.2abc * 24.5 * 21.3 * 312.6 * 43.4 F-test C.V. (%) 1 ml/l; * Significant difference at p<0.05; Mean sharing the same letters in common within column is significant difference by DMRT. on CW-containing medium. The medium supplemented with 15% CW resulted in low frequency of browning percentage in average (Table 1). By culturing half shoot in liquid medium of the same components supplemented with 15% CW, 0.5 mg/l BA and 0.5 mg/l KN for four months (subcultured at monthly intervals) adventitious shoot formation was obtained at 2.5 shoots/cultured half shoot (Figure 1). In addition, abnormalities of shoots characterized by the developed small or big size of inflorescent-like structure (ILS) were also found. A large number of small sized ILS (75%) was observed at 5 mg/l KN whereas big sized ILS (10.6%) was found in CW containing medium. Even though MS medium containing all the PGRs and CW resulted in the highest frequency of adventitious shoot formation (13.4%), they also caused ILS of both sizes (Table 2). Both sizes of ILS developed after two months of culture and look like hydrilla or water thyme (Figure 2A). After that the branching of ILS was well developed with clusters of floral buds (Figure 2B). 3.1 Histological analysis Histological observation of this structure revealed that floral organs e.g. perianths, ovary occurred at auxiliary branches of inflorescence and apical portion (Figure 2C). Unfortunately, full development of those organs into complete flowers and bloom in vitro was not observed. This pheno- Figure 2. Abnormality of cultured half shoot in liquid MS medium supplemented with 15% CW, 0.5 mg/l BA and 0.5 mg/l KN after 4 months of culture. A: initiation of ILS after two months of culture. B: branching of floral bud on inflorescence axis. C: histology of floral bud revealed different whorl of floral organs. S: sepal, P: petal, O: ovary, D: development of big inflorescence after four months of culture. 656 K. Inpeuy et al. / Songklanakarin J. Sci. Technol. 33 (6), 653-657, 2011 Table 2. Effect of PGRs on ILS and adventitious shoot formation on liquidified MS medium supplemented with 3% sucrose after four months of culture. PGRs (mg/l) PGR-free KN(5) CW(150)1 CW(150)1+BA(0.5)+KN(0.5) F-test C.V. (%) 1 ILS formation (%) Small size Big size 0.0c 75.0a 0.0c 13.4b * 2.9 0.0 0.0 10.6 6.3 ns 102.5 Adventitious No. of shoots/ shoot (%) explant 0.0b 0.0b 5.0ab 13.4a * 73.5 0.0b 0.0b 1.0ab 2.5a * 77.4 ml/l; ns: not significant difference; *: Significant difference at p<0.05; Mean sharing the same letters in common within column is significant difference by DMRT. menon was also observed in a big size of floral bud (Figure 2D). These organs proliferated very well in liquid medium. After they were transferred to culture on agar-solidified medium of the same component with or without activated charcoal (AC), proliferation was arrested and further development of floral organ failed. ILS turned brown and died two months after transfer. 4. Discussion Generally, cytokinin induces adventitious or multiple shoot formation in culturing shoot tips or axillay explants in vitro both in monocots and dicots. Although different plant species responds to different kind and concentration of cytokinin, BA was proved to be the most effective for that purpose (Liu and Li, 2001; Goh et al., 1994). Normally, addition of cytokinin into solidified medium is enough to induce a large number of shoots (Arinaitwe et al., 2000). In case of oil palm, there have been no reports on organogenesis through shoot tip culture. In most case single shoot was induced from both mature (Thawaro and Te-chato, 2009) and immature zygotic embryos (Srisawat and Kanchanapoom, 2005) in either liquid or solid medium. However, shaking culture of the embryos promoted a higher rate of absorption of water and mineral nutrients as well, lead to easy germination and development of seedling (Srisawat and Kanchanapoom, 2005). They also reported that culture of the embryos on solid medium caused the higher browning of the explant. Musgrave (1994) reported that cytokinin could prevent oxidation of the culture tissue giving rise to minimization of browning symptom and delay ripening of the fruits. CW contains cytokinins or cytokinin-like substances, which promote multiple shoot formation and popularly used in clonal propagation of orchid (Te-chato et al., 2009) and banana (Gupta, 1986). In the present study, BA and other cytokinins were not effective in induction of multiple shoots whereas CW at 15% (v/v) promoted a healthy development of shoots with normal leaves. Cytokinin is considered to be one of the most important physiological signals in flowering (Bernier et al., 1993; Bonhomme et al., 2000). In many plant species including orchids, addition of cytokinin to the culture medium was also found to induce early flowering in vitro (Bernier et al., 1988; Peeters et al., 1991). For example, in Arabidopsis, the addition of cytokinin iPA was effective in inducing early bolting and flower bud formation in vitro (He and Loh, 2002). The induction of vegetative shoot apical meristem to inflorescence meristem was observed when Dendrobium Madame Thong-In protocorms were cultured in modified liquid Knudson C medium (Knudson, 1946) containing BA and CW (Sim et al., 2008). BA was reported to be metabolized easily into free radical of riboside which related to flowering in vitro of oil palm (Jones, 1998). Our previous study (Hilae and Te-chato, unpublished data) found that addition of BA at 5 mg/l to SE germination medium of oil palm resulted in an abnormality of shoots. Acknowledgement This work was supported by the Higher Education Research Promotion and National Research University Project of Thailand, Office of the Higher Education Commission, Graduate School of Prince of Songkla University, the Oil Palm Agronomical Research Center (OPARC) of Southern Thailand and the Center of Excellence in Agricultural and Natural Resources Biotechnology. References Ahee, J., Arthuis, P., Cas, G., Duval, Y., Guenin, G., Hanower, J., Lievoux, D., Lioret, C., Malaurie, B., Pannetier, C., Raillot, D., Varechon, C. and Zuckerman, L. 1981. La multiplication vegetative in vitro du palmier a huile par embryogenese somatique. Oleagineux 36,113-125. Bernier, G. 1988. The control of floral evocation and morphogenesis. Annual Review of Plant Physiology and Molecular Biology 39, 175-219 K. Inpeuy et al. / Songklanakarin J. Sci. Technol. 33 (6), 653-657, 2011 Bernier, G., Havelange, A., Houssa, C., Petitjean, A. and Lejeune, P. 1993. Physiological signals that induce flowering. Plant Cell 5, 1147–1155. Bonhomme, F., Kurz, B., Melzer, S., Bernier, G. and Jacqmard, A. 2000. Cytokinin and gibberellin activate SaMADSA, a gene apparently involved in regulation of the floral transition in Sinapis alba. Plant Journal 24, 103-111. Gupta, P.P. 1986. Eradication of mosaic disease and rapid clonal multiplication of bananas and plantains through meristem tip culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 6, 33-39. He, Y.W., Loh, C.S. 2002. Induction of early bolting in Arabidopsis thaliana by triacontanol, cerium and lanthanum is correlated with increased endogenous concentration of isopentyl adenosine (iPAdos). Journal of Experimental Botany 53, 505-512. Jones, L. H. 1998. Metabolism of cytokinins by tissue culture lines of oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) producing normal and abnormal flowering palms. Plant Growth Regulation 17, 205–214. Jones, L. H., Hanke, D. E. and Eeuwens, C. J. 1995. An evaluation of the role of cytokinins in the development of abnormal inflorescences in oil palms (Elaeis guineensis Jacq.) regenerated from tissue culture. Plant Growth Regulation 14,135-142. Knudson, L. 1946. A new nutrient solution for germination of orchid seed. American Orchid Society Bulletin 15, 214-217. Musgrave, M. E. 1994. Cytokinins and oxidative processes. In Cytokinins: Chemistry, Activity, and Function (ed. W. S. M. David and C. M. Machteld). pp. 167-175. United States: CRC Press. Nguyen, H.V., Phan, H.A. and Duong, T.N. 2006. The role of sucrose and different cytokinins in the in vitro floral morphogenesis of rose (hybrid tea) cv. “First Prize”. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 87, 315-320. Nwanko, B. A. and Krikorian, A. D. 1983. Morphogenetic potential of embryo and seedling derived callus of Elaeis guineensis Jacq. var pisifera Becc. Annals of Botany 51, 65-76. 657 Peeters, A.J.M., Gerards, W., Barendse, G.W.M., Wullems, G.J. 1991. In vitro flower bud formation in tobacco: interaction of hormones. Plant Physiology 97, 402408. Ravikumar, R., Ananthakrishnan, G., Kathiravan, K. and Ganapathi, A. 1998. In vitro shoot foram contidos fisicamente em decúbito lateral direito, e as agulhas posicionadas sobre os acupontos (ACs) coração 7 (C-7 – Shenmen), localizado entre o processo estiloide lateral e o osso cárpico acessório, exatamente na dobra da articulação úmero-rádio-ulnar, e pericárdio 6 (PC-6 – Neiguan), localizado entre os tendões do músculo flexor carporradial e do músculo flexor digital superficial (Fig. 1A, 1B e 1C), conforme descrito por Draehmpaehl e Zohmann (1997). Já para a segunda seção, os animais foram novamente posicionados em decúbito lateral direito, e as agulhas inseridas em acupontos falsos (AF), localizados no oitavo e no nono espaço intercostal esquerdo (Figura 1D), onde não há interferência de nenhum outro meridiano, conforme descrito por (Draehmpaehl e Zohmann, 1994). Independentemente da seção, não foi realizada estimulação manual das agulhas, e os acupontos permaneceram estimulados por um período de 30 minutos, respeitando-se o período mínimo de 10 a 20 minutos sugerido por Scott (2001) para que o acuponto possa promover um efeito observável. Figura 1. Localização dos acupontos C-7 (seta em A) e PC-6 (seta em B) no cão (Adaptado de Draehmpaehl e Zohmann, 1997). Em C, acupuntura em cão do experimento acuponto C-7 (seta azul) e acuponto PC-6 (seta laranja). Em D, acupuntura em cão do experimento em acuponto falso. Arquivo pessoal, 2014.  Previamente à aplicação das agulhas nos ACs, foi realizado um registro eletrocardiográfico (ECG) com dois minutos de duração e, após a inserção das agulhas nos ACs, o registro eletrocardiográfico se manteve durante os 30 minutos de acupuntura. Para a realização do eletrocardiograma, foi utilizado um aparelho de eletrocardiografia computadorizada (ECGPC – TEB®), respeitando-se o padrão de fixação de eletrodos descrito por Tilley (1992), com registro das derivações bipolares e unipolares aumentadas e calibração de 25mm/s e 1mV (N). Os dados do ECG foram interpretados de forma comparativa pré e pós-estimulação dos acupontos, sendo os dados pós-estimulação coletados e interpretados em intervalos de cinco minutos até o final da gravação (30 minutos). Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.68, n.1, p.252-256, 2016 253 Silva et al.  Para a análise da VFC, foi utilizada a fórmula disponível em Carareto et al. (2007). A normalidade dos dados obtidos foi verificada pelo teste de Shapiro-Wilk (P>0,05), seguida pelo teste ANOVA com pós-teste de Bonferroni para as variáveis paramétricas e pelo teste de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn (P<0,05) para as variáveis não paramétricas. Foi realizada análise descritiva para as variáveis qualitativas. No presente estudo, 90% dos animais apresentaram arritmia sinusal respiratória, demonstrando maior influência do sistema nervoso simpático, em todos os momentos do grupo ACs, enquanto no grupo AF esse ritmo cardíaco esteve presente em 100% dos animais, em todos os momentos. O ritmo sinusal foi encontrado apenas em 10% dos animais do grupo ACs, sugestivamente por se tratar da primeira exposição dos animais ao experimento, resultando em maior influência parassimpática sobre o sistema cardiovascular. Conforme demonstrado na Tab. 1, houve pequena e irrelevante diferença quando comparada a FC de todos os momentos do grupo ACs com os momentos do grupo AF, o que evidencia, portanto, a ineficácia da estimulação dos acupontos sobre esse parâmetro. Tabela 1. Frequência cardíaca (FC) e variabilidade da frequência cardíaca (VFC) obtidas com a realização dos acupontos verdadeiros (AV) C-7 e PC-6 e do acuponto falso (AF) em diferentes momentos do ECG, expressos em mediana (percentil 25% - percentil 75%) para a FC e média±desvio-padrão para a VFC Momentos FC (bpm) VFC AV AF AV AF 0 minuto 107 (92-130)a 112 (93-129)a 12,79±0,46ab 12,71±0,47b 5 minutos 90 (79-121)a 93 (82-115)a 13,08± 0,48ab 13,09± 0,49ab 10 minutos 94 (79-118)a 88 (70-123)a 13,01± 0,48ab 13,12± 0,53ab 15 minutos 96 (76-120)a 99 (81-115)a 13,04± 0,52ab 13,17± 0,51a 20 minutos 95 (79-120)a 95 (81-112)a 13,13± 0,51ab 13,07± 0,54ab 25 minutos 104 (83-115)a 89 (76-108)a 13,15± 0,45ab 13,17± 0,53a 30 minutos 87 (82-107)a 95 (81-117)a 13,18± 0,46ab 13,11± 0,56ab P = 0,0890 P = 0,0051 Para a FC, valores seguidos por letras distintas diferem entre si (P<0,05) ao teste de Dunn. Para a VFC, valores seguidos por letras distintas diferem entre si (P<0,05) ao teste de Bonferroni. Não foi observada diferença na VFC (Tab. 1) entre os grupos do ACs e AF, exceto quando comparado apenas o momento basal com os momentos 15 e 25 minutos do AF, contudo sem relevância clínica para o estudo. Sabidamente, VFC constitui uma medida simples e não invasiva que avalia os efeitos do sistema nervoso autônomo sobre o coração. Variações nessa variabilidade são normais e esperadas, indicando habilidade do coração em responder a múltiplos estímulos fisiológicos e ambientais. Em síntese, uma alta VFC representa boa adaptação, caracterizando um indivíduo saudável, com mecanismos autonômicos eficientes, enquanto a baixa VFC representa adaptação anormal e insuficiente do SNA (Carareto et al., 2007). Dentre as opções terapêuticas para o tratamento de anormalidades dos mecanismos autonômicos, a acupuntura vem se destacando em vários estudos em animais, entretanto em nenhum desses estudos se objetivou a avaliação do efeito da acupuntura em indivíduos saudáveis, conforme ocorreu no presente estudo, fator limitante à discussão mais aprofundada. Observam-se, na literatura, diversos estudos em que foram observados os efeitos da acupuntura sobre pacientes com diferentes distúrbios cardiovasculares. Syuu et al. (2001) relataram efeitos benéficos da estimulação do acuponto PC-6 em cães anestesiados e sob toracotomia. Nesse estudo, os autores descrevem reduções na pressão arterial média, volume diastólico final, frequência cardíaca, débito cardíaco e pressão sistólica final mediante estimulação do acuponto. O efeito cardiovascular da acupuntura sobre o acuponto PC-6 em cães também foi observado por Jingbi (2004) em modelo de experimental de infarto agudo do miocárdio. Nesse estudo, foi observado que a acupuntura proporcionou redução do segmento ST do eletrocardiograma, além de reduzir as áreas de infarto induzidas pela ligadura coronariana. Entretanto, esses dois 254 Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.68, n.1, p.252-256, 2016 Efeitos da acupuntura estudos diferem do presente pelo fato de as agulhas terem sido estimuladas eletricamente (eletroacupuntura), enquanto no presente estudo estas permaneceram em repouso. Cárdenas (2006) observou que a estimulação dos mesmos acupontos empregados no presente estudo em cavalos sob anestesia geral demonstrou efeitos positivos sobre a taquicardia ventricular induzida por infusão contínua de dopamina, nos quais a estimulação dos ACs C-7 e PC-6 promoveu diminuição do tempo da taquicardia ventricular, demonstrando, assim, a eficácia da estimulação desses acupontos em animais. Um estudo controlado em ratos demonstrou que a estimulação dos acupontos PC-5 e PC-6 reduziu significativamente a incidência de taquiarritmias induzidas experimentalmente pós-oclusão e reperfusão da artéria coronária esquerda (Lujan et al., 2007). Em humanos, a revisão de oito estudos utilizando acupuntura para o tratamento de arritmias cardíacas encontrou cerca de 87 a 100% que foram convertidos ao ritmo sinusal após a estimulação dos acupontos (Xie e Wedemeyer, 2012). estudo não se valeu da estimulação elétrica sobre os acupontos falsos ou verdadeiros (C-7 Shenmen e PC-6 Neiguan). Limitações a este estudo compreendem o fato de que a escolha dos acupontos explorados baseouse nas indicações terapêuticas descritas por Draehmpaehl e Zohmann (1994), em que o acuponto C-7 é indicado em casos de alterações funcionais do coração, e o acuponto PC-6 quando há dores miocárdicas. Ainda segundo os mesmos autores, essa forma de terapia alternativa objetiva normalizar funções orgânicas alteradas e, como no presente estudo foram utilizados animais hígidos, a acupuntura pode não ter promovido influência sobre a VFC nos cães que participaram do experimento. Limita-se, ainda, este estudo quando da observação das recomendações descritas por Scott (2001), quando ele destaca a necessidade de um ou dois tratamentos semanais durante quatro a seis semanas consecutivas, tempo em que se espera que possa haver a resposta desejada à terapia, fato não realizado no presente estudo. Finalmente, Kimura e Hara (2008) desenvolveram um estudo em que foram estudados os efeitos da eletroacupuntura sobre o ritmo do sistema nervoso autônomo em cães. Dentre outras análises, observaram o coeficiente de variação dos intervalos R-R (CVRR) do eletrocardiograma, o qual avalia o índice de atividade nervosa autônoma, de forma semelhante à VFC, a qual também se utiliza do intervalo R-R como unidade de medida. Seus até antes de 12 horas, 24 horas até antes de 72 horas aproximadamente de incubação, os valores foram superestimados. Subestimativas dos valores foram obtidas entre aproximadamente 12 horas às 24 horas e após 72 horas. Em nenhum momento os dados estimados foram iguais aos observados. Nas Fig. 2 e 3, apresentam-se a produção cumulativa de gases obtidos a partir dos dados observados e dos ajustados pelos dois modelos. Para estimativa da produção de gases, tanto o modelo logístico quanto o modelo de Gompertz podem ser utilizados, porém, de acordo com os parâmetros encontrados, o modelo logístico apresentou melhor valor de QME, critério que recomenda o seu uso. Com base nos gráficos de dispersões, pode-se verificar que tanto o modelo logístico como o Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.63, n.1, p.136-142, 2011 139 Farias et al. Tempo de incubação (h) Figura 2. Curvas de produção cumulativa de gases da matéria seca do farelo e da torta de babaçu (Orbignya martiana) a partir da média dos dados observados e dos ajustados pelo modelo de Gompertz. Tempo de incubação (h) Figura 3. Curvas de produção cumulativa de gases da matéria seca do farelo e da torta de babaçu (Orbignya martiana) a partir da média dos dados observados e dos ajustados pelo modelo logístico bicompartimental. Barbosa (2007) obteve melhor ajuste para o modelo logístico em relação ao modelo de Gompertz, ao estudar a faveira e o pau-ferro. Azevedo (2007) encontrou, nos modelos logístico, exponencial e de France, ajuste adequado a todas as etapas do processo fermentativo, descrevendo as características de fermentação do material avaliado, tanto na fase inicial como na final. Na análise gráfica dos resíduos, o modelo logístico subestimou apenas no final da curva e superestimou no início. As curvas de produção de gases caracterizam-se por apresentar forma sigmoidal, podendo ser distinguidas três fases: inicial de baixa produção, fase exponencial de rápida produção e uma fase assintótica de lenta ou inexistente produção de gases (Noguera et al., 2004). Nas primeiras horas de fermentação, uma parte do substrato, geralmente os açúcares solúveis, é fermentada rapidamente, mas isto representa uma pequena porção do total a ser degradado. Na sequência, uma menor quantidade de alimento é hidratada e colonizada pela microbiota, dando origem a degradações distintas, dependendo do substrato, quanto aos constituintes solúveis e estruturais (Beuvink e Kogut, 1993). Giraldo et al. (2006), em estudo sobre a relação entre pressão e volume para a implantação da técnica in vitro de produção de gases, na Colômbia, obtiveram taxas de fermentação mais altas nas primeiras horas de incubação e atribuíram o fato à fermentação dos carboidratos solúveis, e também observaram grande diferença entre os alimentos estudados. Verificaram, ainda, que, entre seis e 12 horas de incubação, houve aumento na taxa de produção de gases, que foi atribuído à fermentação de carboidratos fibrosos ou estruturais. O QME, o R2 e o DMA dos modelos estudados para descrever a produção de gases oriundos da fermentação ruminal da FDN encontram-se na Tab. 3. Quanto ao QME, o modelo logístico bicompartimental foi o que apresentou menor valor. Os valores de R2 foram elevados (0,99) para os dois modelos. Os desvios médios absolutos diferiram entre os modelos, com o de Gompertz apresentando valor mais elevado. Azevedo (2007) obteve valores de R2 baixos para todos os modelos, sendo o menor valor para o de Gompertz. Schofield et al. (1994), ao compararem alguns modelos para descrever a cinética da digestão da fibra, obtiveram valores elevados de R2 para o logístico bicompartimental e o de Gompertz, com menor valor para o primeiro. 140 Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.63, n.1, p.136-142, 2011 Avaliação dos modelos logístico. Tabela 3. Médias do quadrado médio do erro (QME), do coeficiente de determinação (R²) e do desvio médio absoluto (DMA) obtidas a partir dos ajustes dos dados de produção de gases da parede celular com os modelos logístico e de Gompertz Modelo QME R² DMA Logístico 6,39 0,99 1,98 de Gompertz 11,1 0,99 3,21 Nas Fig. 4 e 5, apresentam-se as produções cumulativas de gases obtidos a partir dos dados observados e dos ajustados pelos modelos de Gompertz e logístico bicompartimental para a FDN do farelo e da torta de babaçu. Figura 4. Modelo de Gompertz para o farelo e a torta de babaçu. Azevedo (2007) obteve melhor ajuste para o modelo logístico bicompartimental e exponencial do que para os de France e de Gompertz, no entanto utilizou o modelo de Gompertz, que, apesar de ter apresentado maior dispersão do resíduo, assim como valores mais elevados para QME e DMA, apresentou melhor estimativa para a curva de produção de gases. CONCLUSÕES O modelo logístico bicompartimental estimou os valores de produção de gases melhor do que o modelo de Gompertz. Desse modo, pode ser adotado na estimativa da cinética de fermentação ruminal da matéria seca e fibra em detergente neutro do farelo e da torta de babaçu. AGRADECIMENTOS Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela bolsa de estudo concedida e pelo apoio financeiro necessário à condução da pesquisa. Figura 5. Modelo logístico para o farelo e a torta de babaçu. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AZEVEDO, M.M.R. 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