Feedback

Expressão gênica diferencial em resposta aos efeitos da proteína anti-inflamatória Anexina A1 nas células epiteliais pigmentadas da retina humana

Documento informativo
_____________________________________________________ Laila Toniol Cardin Expressão Gênica Diferencial em resposta aos efeitos da proteína anti-inflamatória Anexina A1 nas células epiteliais pigmentadas da retina humana _____________________________________________________ São José do Rio Preto 2013 Laila Toniol Cardin Expressão Gênica Diferencial em resposta aos efeitos da proteína anti-inflamatória Anexina A1 nas células epiteliais pigmentadas da retina humana Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Genética, junto ao Programa de Pós-graduação em Genética, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Orientadora: Profa. Dra. Flávia Cristina Rodrigues Lisoni Co-orientadora: Profa. Dra. Sonia Maria Oliani São José do Rio Preto 2013 Cardin, Laila Toniol. Expressão diferencial em resposta aos efeitos da proteína anti- inflamatória Anexina A1 nas células epiteliais pigmentadas da retina humana / Laila Toniol Cardin. – São José do Rio Preto: [s.n.], 2013. f.102 : il. , 30 cm. Orientadora: Flávia Cristina Rodrigues Lisoni Co-orientador: Sonia Maria Oliani Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas 1. Inflamação ocular. 2. Anexina A1. 3. Expressão gênica. 4. Cultura de Células. I. Rodrigues-Lisoni, Flávia Cristina. II. Oliani, Sonia Maria. III. Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. IV. Título. CDU – 577.112 Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE Campus de São José do Rio Preto – UNESP Laila Toniol Cardin Expressão Gênica Diferencial em resposta aos efeitos da proteína anti-inflamatória Anexina A1 nas células epiteliais pigmentadas da retina humana Dissertação apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Genética, junto ao Programa de Pós-graduação em Genética, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. Banca Examinadora Profa. Dra. Flávia Cristina Rodrigues Lisoni UNESP – Ilha Solteira Orientadora Profa. Dra. Érika Cristina Pavarino FAMERP – São José do Rio Preto Profa. Dra. Claúdia Marcia Aparecida Carareto UNESP – São José do Rio Preto Profa. Dra. Eny Maria Goloni Bertollo FAMERP – São José do Rio Preto Profa. Dra. Cristiane Damas Gil UNIFESP – São Paulo São José do Rio Preto 25 de fevereiro de 2013 DEDICATÓRIA À minha família, meus pais, José e Maria, e irmãos, Juciene e Pedro, que são meu porto seguro, me ouvindo e aconselhando quando eu não tinha mais esperanças, e meus exemplos de vida, cada um com sua personalidade e dificuldades do dia-a-dia me ensinaram e, são os colaboradores da minha jornada e das minhas conquistas. À minha orientadora, Profª Drª Flávia Cristina Rodrigues Lisoni, pelos ensinamentos, pela amizade, paciência, dedicação de sempre se fazer presente apesar da distância e buscar fornecer as melhores condições para realização do Mestrado. Por ser essa pessoa maravilhosa que me acolheu na sua vida profissional e pessoal. À minha co-orientadora, Profª Drª Sonia Maria Oliani, meu respeito e reconhecimento pela assistência e brilhantismo profissional. Muito obrigada pela oportunidade e confiança, é exemplo de Mestre por quem tenho e terei sempre imensa admiração. AGRADECIMENTOS À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela bolsa concedida de Mestrado. Ao Programa e Professores da Pós-graduação em Genética, por possibilitar a realização do meu Mestrado e pelo conhecimento adquirido. Aos funcionários da Seção de Pós-graduação pela competência e colaboração na resolução de diversos problemas. Ao Departamento de Biologia do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São José do Rio Preto, pela atenção e colaboração quando precisei. À Profa. Dra. Eloiza Tajara, coordenadora do Laboratório de Marcadores Moleculares e Bioinformática Médica, da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto, pelos recursos oferecidos, dos equipamentos e materiais, para realização das técnicas. À aluna de doutorado Bianca da Cunha Rodrigues, Dra. Fernanda Carregaro e ao técnico Tiago Henrique pelo auxiliou prestado no desenvolvimento de técnicas, e pela paciência e solicitude. Ao Prof. Dr. Wilson Araújo da Silva Junior, da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, por me receber em seu laboratório e pelos recursos, equipamentos e materiais oferecidos para realização da Técnica de Hibridização Subtrativa Rápida. A Auxiliar de Pesquisa Científica e Tecnológica Anemari Ramos Dinarte dos Santos, da Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto, pelo ensino da Técnica de Hibridização Subtrativa Rápida, pela acolhida e amizade. E a todos do Hemocentro de Ribeirão Preto que contribuíram com esse trabalho e me receberam tão amigavelmente. À Profa. Dra. Paula Rahal, coordenadora do laboratório GENOMA, do de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São José do Rio Preto, por disponibilizar seu laboratório e recurso para realização desse trabalho. À aluna de doutorado Marina Curado Valsechi, por me auxiliar com os géis de agarose e realização de PCR e ser sempre solícita. À Profa. Dra. Andréia Machado Leopoldino, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, e sua aluna Laís Sobral, pelo auxílio prestado na realização da técnica de migração celular. À Profa. Dra. Claudia Carareto, coordenadora do Laboratório de Evolução Molecular de insetos, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas de São José do Rio Preto, por disponibilizar seu laboratório e recurso para realização desse trabalho. À Dra. Adriana Granzotto, pelo auxilio, técnico e científico, no laboratório, e especialmente pela convivência no dia-a-dia, companheira de apartamento, agradeço pela paciência, amizade, disponibilidade, apoio, conversas, conselhos, enfim, por tudo que me ajudou e melhorou os meus dias, nessa primeira experiência longe de minha família. Aos valiosos companheiros do Laboratório de Imunomorfologia do IBILCE, Alexandre Dantas Gimenes, Aline Camargo Miranda, Ayla Blanco Poltronieri, Caroline de Freitas Zanon, Claudia de Mello Bosnich, Cristiane Damas Gil, Gabriela Franco Bueno, Janesly Prates, Jéssica Zani Lacerda, Kallyne Kioko Mimura, Marina de Paula Silva, Marystela Fávero Oliveira, Poatan da Silva Pinoti, Rafaela Molás, uma equipe a qual é exemplo de trabalho com alegria e entusiasmo, pelos momentos de alegria e companheirismo. Às queridas amigas Ana Paula Girol, Carla Patrícia Carlos e Thaís Santana Gastardelo, exemplos de pessoas, por me ajudar durante o Mestrado, estando sempre prontas e dispostas. À Analice Andreoli, pessoa atenciosa e convicta, pelo seu companheirismo e apoio nos momentos de angustia, pela sua amizade e carinho em todos os outros momentos de minha vida, por me entender, aceitar, pelas conversas e por todo crescimento que me proporcionou desde que conheci. Aos maravilhosos amigos Nathália Martins Sonehara e Rubens de Paula Junior, pessoas atenciosas, carinhosas, solicitas. Agradeço pela companhia na minha vida profissional e pessoal, cada um com seu jeito, obrigada por essa amizade sincera, que ultrapassou os percalços do caminho e me proporcionou um crescimento pessoal inigualável nesses dois anos de convivência. E também por todo auxilio, generosidade, paciência, compreensão, aceitação e companheirismo concedidos nessa primeira aventura longe da minha família. À todos os companheiros da Pós-graduação em Genética, e em especial a Bruna Victorasso Jardim, Gabriela Bottaro Gelaleti, Marcela Alcântara Proença, Maysa Succi. Aos meus tios Iasmara e Valdir, e primas Ana Laura e Maria Claúdia, pela acolhida nos primeiros meses, e pela solicitude em qualquer momento. Obrigada por estarem comigo me ajudando sempre que eu precisei. Ao pessoal da Equipe de jovens de Nossa Senhora, pela companhia nos eventos das equipes, em especial à Bianca Mendicino, Débora Cristina dos Santos, Geovane Prates Ferreira, Grazielle Gouveia e Laís Ramires Mendicino, pela companhia em vários momentos e pela amizade. Às minhas amigas Letícia Rodrigues, Lorraine Stefanini, Pâmela Figueiredo, Talita Rossini e Valquiria Lima, pela amizade sincera, por se fazerem presentes mesmo a distância, pessoas importantes no conjunto que cerca minha vida, pelo apoio e incentivo constantes, amo demais. E acima de tudo eu agradeço a Deus por ter me concedido a vida, e em todos os momentos está ao meu lado me protegendo, guiando e confortando, me ajudando a passar por todas as fases, sejam elas boas ou ruins. “Todo mundo é um gênio. Mas, se você julgar um peixe pela sua capacidade de subir em uma árvore, ele vai gastar toda uma vida acreditando que é estúpido.” Albert Einstein RESUMO INTRODUÇÃO: A inflamação é caracterizada pelo acúmulo de leucócitos nos tecidos oculares, podendo afetar qualquer parte do olho, sendo um processo doloroso, associado à fotofobia e podendo resultar em complicações secundárias. Em geral, no tratamento dessas inflamações intra-oculares, os glicocorticóides são os medicamentos freqüentemente administrados. Porém, devido aos efeitos adversos, existe uma demanda óbvia para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. Entre elas, a proteína anexina A1 (ANXA1) tem mostrado a sua participação ativa nos processos inflamatórios. OBJETIVO: Em função desses dados, foi realizado o presente trabalho que teve como objetivo geral avaliar a influência desse tratamento anti-inflamatório nas células epiteliais pigmentadas da retina humana (ARPE-19), sobre a morfologia, proliferação, migração e na expressão gênica e proteica. MATERIAL E MÉTODOS: As células ARPE-19 foram cultivadas em meio completo e estimuladas pelo Lipopolissacarideo bacteriano (LPS), e em outro experimento foi acrescentado o tratamento com o peptídeo ANXA1Ac2-26, para avaliar o possível efeito anti-inflamatório dessa proteína, nos tempos de 1, 2, 4, 24, 48 e 72 horas sobre a morfologia, proliferação e migração celular. Após análises estatísticas, que evidenciaram o tempo de 72 horas, foi realizado um novo cultivo celular para a extração do RNA e conduzida a técnica de Hibridização Subtrativa Rápida (RaSH). A validação de cinco genes encontrados como diferencialmente expressos foi realizada por RT-qPCR. Além dessas técnicas, também foi analisada a expressão das citocinas anti e pró-inflamatórias pelo ensaio Multiplex. RESULTADOS: O ANXA1Ac2-26 não modificou a morfologia das células ARPE-19, entretanto diminui a proliferação e aumenta a migração celular. Pela tecnologia de RaSH foram encontrados 80 genes diferencialmente expressos após o tratamento com ANXA1Ac2-26. Cinco desses genes (LRAT, CTGF, MAP1B, ALDH1A3 e SETD7), devido às suas funções estarem relacionadas com doenças oculares e/ou inflamatórias, foram validados por RT-qPCR, mas apenas dois deles (LRAT, CTGF) confirmaram a baixa expressão. Também foram interligadas as vias de sinalização celular, das quais a ANXA1 participa, importantes para o processo inflamatório, pelo Ingenuity Sistems©. Em relação à análise da expressão das citocinas, observou-se que o tratamento com ANXA1Ac2-26 diminuiu a expressão de moléculas pró-inflamatórias, na concentração de 100 µg/ml. CONCLUSÃO: As nossas analises in vitro mostram que a proteína ANXA1 pode interagir nas cascatas de sinalização de processos inflamatórios, alterando a proliferação, migração e expressão gênica e proteica nas células. Desse modo, os nossos resultados apontam que as Células do Epitélio Pigmentado da Retina (EPR) são um alvo potencial da atividade da proteína ANXA1, tendo em vista sua possível utilização em terapias inovadoras no tratamento de inflamações oculares. Palavras-chave: Anexina A1, Inflamação ocular, Cultura de células, RaSH, Expressão gênica. ABSTRACT INTRODUCTION: The inflammation is characterized by the accumulation of leukocytes in ocular tissues, and it can affect any part of the eye, been a painful process, associated with photophobia and may result in secondary complications. In general, for the treatment of these intraocular inflammations, the glucocorticoids are the drugs frequently administered. However, due to its side effects, there is an obvious demand for developing new therapeutic strategies. Among them, the protein annexin A1 (ANXA1) has shown its active participation in inflammatory processes. AIM: In the present study we investigated the influence of anti-inflammatory treatment in human retinal pigment epithelial cells (ARPE-19), on the morphology, proliferation, migration and gene and protein expression. MATERIALS AND METHODS: The ARPE-19 cells were cultured in complete medium and stimulated by bacterial lipopolysaccharide (LPS), and in another experiment was added treatment with ANXA1Ac2-26 peptide, to evaluate the possible antiinflammatory effects of this protein, in 1, 2, 4, 24, 48 and 72 hours on the morphology, cell proliferation and migration. After statistical analyzes, which demonstrated that the time 72 hours is the best, was performed a new culture bottles for RNA extraction technique and conducted the Rapid Subtractive Hybridization (RaSH). The validation of five genes founded differentially expressed was done by RT-qPCR. In addition to these techniques was also analyzed the expression of anti and pro-inflammatory cytokines by Multiplex assay. RESULTS: The ANXA1Ac2-26 did not alter the morphology of the ARPE19 cells, however decreased proliferation and increased cell migration. After statistical analysis, it was evident that the time of 72 hours was the best to proceed with the methodology. By RaSH technology, after treatment with the peptide, were found 80 differentially expressed genes. Five of those genes (LRAT, CTGF, MAP1B, ALDH1A3 and SETD7), due its functions are related to eye and/or inflammatory diseases, were validated by RT-qPCR. Also were interconnected the signaling pathways, of which ANXA1 participates, important to the inflammatory process by Ingenuity Sistems©. Regarding the analysis of cytokine expression, we observed that the treatment with ANXA1Ac2-26 diminish the expression of pro-inflammatory molecules at a concentration of 100 µg/ml. CONCLUSSION: Our in vitro analyzes show that the protein ANXA1 can interact in signaling cascades of inflammatory processes, altering proliferation, migration and gene and protein expression in the cells. Thus, our results suggest that the Retinal Pigment Epithelial cells (RPE) are a potential target of the activity of protein ANXA1, considering their potential use in innovative therapies for ocular inflammation’s treatment. Keywords: Annexin A1, Ocular inflammation, Cell culture, RaSH, Gene expression. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1. Análise morfológica da linhagem celular ARPE-19 ___________________ 61 Figura 2. Efeitos dos tratamentos com o peptídeo ANXA1Ac2-26 na proliferação das células ARPE-19. _____________________________________________________ 63 Figura 3. Ensaio de migração com linhagem celular ARPE-19. _________________ 65 Figura 4. Relação dos genes obtidos na subtração das células induzidas pelo LPS (Sub A)._________________________________________________________________ 67 Figura 5. Relação dos genes obtidos na subtração das células tratadas com ANXA1Ac226 (Sub B).___________________________________________________________ 69 Figura 6. Validação da integridade do mRNA e cDNA. ________________________ 71 Figura 7. Expressão gênica por PCR em tempo real. _________________________ 73 Figura 8. Expressão gênica por PCR em tempo real. _________________________ 75 Figura 9. Efeito do peptídeo ANXA1Ac2-26 nos níveis de expressão de citocinas pró e anti-inflamatórias. _____________________________________________________ 77 Figura 10. Efeito do peptídeo ANXA1Ac2-26 nos níveis de expressão de citocinas pró e anti-inflamatórias. _____________________________________________________ 79 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Genes, selecionados por RaSH, expressos na linhagem celular ARPE-19 com expressão aumentada após ativação pela endotoxina e, reduzida nas tratadas com ANXA1Ac2-26. _________________________________________________________ 81 Tabela 2. Genes, selecionados por RaSH, com expressão aumentada na linhagem celular ARPE-19 tratadas com ANXA1Ac2-26 e, reduzida nas ativadas pelo LPS. _____ 82 Tabela 3. Descrição dos genes escolhidos para validação por PCR em tempo real. _ 88 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Pl: microlitros %: porcentagem >: Maior ≤: Menor ou igual °C: Graus célsius µg: microgramas µM: Micromolar ALDH1A3: Família Aldeído Desidrogenase 1, membro 3 AMP: Adenosina monofosfática cíclica ANX: Anexinas ANXA1: Gene da proteína Anexina A1, 28; Proteína Anexina A1 ANXA1Ac2-26: Peptédio da porção N-terminal da proteína ANXA1 ARPE-19: Linhagem celular de Células Epiteliais Pigmentadas da Retina Humana Br: Brasil Ca2+: Íon calcio cDNA: DNA complementar cm2: centímetros quadrados cm3: centímetros cúbicos CO2: Gás carbônico cPLA2: Fosfolipase citosólica A2 CREB: Proteína ligadora do elemento respondedor de AMP cíclico Ct: Cycle threshold CTGF: Fator de Crescimento de Tecido Conjuntivo DMEM: Meio de cultivo Dulbecco Eagle modificado DMRI: Degeneração Macular Relacionada com a Idade DNA: Ácido desoxirribonucleico EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético EGF: Fator de crescimento epidérmico EPR: Epitélio Pigmentado da Retina ERK: Quinase regulada por sinais extracelulares FDEP: Fatores derivados do epitélio pigmentado Fpr-rs: Receptor murino para peptídeos formilados GC: Glicocorticóides GO: Gene Ontology Ham F-12: Mistura de nutrientes para cultura hs: horas IBILCE: Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas IL: Interleucina INF-γ: Interferon gama K/BxN: Soro artritogênico kDa: Kilodalton resin-dentin bond components. Dent Mater 2005;21:232-41. 20. Chersoni S, Acquaviva GL, Prati C, Ferrari M, Gardini, S; Pashley DH, Tay FR. In vivo fluid movement though dentin adhesives in endodontically treated teeth. J Dent Res 2005;84:223-7. 21. Braga RR, César PF, Gonzaga CC. Mechanical properties of resin cements with different activation modes. J Oral Rehabil 2002;29:257– 66. 22. Melo RM, Bottno MA, Galvã RKH, Soboyejo WO. Bond strengths, degree of conversion of the cement and molecular structure of the adhesive–dentine joint in fibre post restorations. J Dent 2012;40:286-94. 23. Ho Y, Lai Y, Chou I, Yang S, Lee S. Effects of light attenuation by fibre posts on polymerization of a dual-cured resin cement and microleakage of post-restored teeth. J Dent 2011;39:309-15. 24. Anusavice KJ. Phillips RW. Science of dental materials. 11th, 2003. 25. Lui JL. Depth of composite polymerization within simulated root canals using lighttransmitting posts. Oper dent 1994;19:165-8. 27 4 ARTIGOS CIENTÍFICOS 4.2 ARTIGO 2 28 Title: Influence of light transmission through fiber posts on the microhardness and bond strength Authors: Morgan LFSA, Gomes GM, Poletto LTA, Ferreira FM, Pinotti MB, Albuquerque RC. Abstract Introduction: The aim of this study was to investigate the influence of light transmission through fiber posts in microhardness (KHN) and bond strength (BS) from a dual cured resin cement. Methods: Five fiberglass posts of different types and manufacturers represent a test group for the analysis of KHN (N=5) and BS and their displacement under compressive loads (N = 8). For the analysis of KHN a metallic matrix was developed to simulate the positioning of the cement after the cementation process intra radicular posts. The resistance to displacement, which will provide data of BS was measured using bovine incisors. After cementation, cross sections of the root portion of teeth in space led to post 1mm discs that have been tested for BS. The values were statistically analyzed by ANOVA, followed by Tukey's (P
Expressão gênica diferencial em resposta aos efeitos da proteína anti-inflamatória Anexina A1 nas células epiteliais pigmentadas da retina humana
RECENT ACTIVITIES
Autor
Documento similar

Expressão gênica diferencial em resposta aos efeitos da proteína anti-inflamatória Anexina A1 nas células epiteliais pigmentadas da retina humana

Livre