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Identificação de hemoglobinas com corrida eletroforética semelhante à da hemoglobina S no Programa Estadual de Triagem Neonatal de Minas Gerais (PETN-MG)

Documento informativo

FERNANDA SILVA PIMENTEL IDENTIFICAÇÃO DE HEMOGLOBINAS COM CORRIDA ELETROFORÉTICA SEMELHANTE À DA HEMOGLOBINA S NO PROGRAMA ESTADUAL DE TRIAGEM NEONATAL DE MINAS GERAIS (PETN-MG) UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS FACULDADE DE MEDICINA BELO HORIZONTE 2010 FERNANDA SILVA PIMENTEL IDENTIFICAÇÃO DE HEMOGLOBINAS COM CORRIDA ELETROFORÉTICA SEMELHANTE À DA HEMOGLOBINA S NO PROGRAMA ESTADUAL DE TRIAGEM NEONATAL DE MINAS GERAIS (PETN-MG) Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais, Área de Concentração: Saúde da Criança e do Adolescente, como requisito para obtenção do título de Mestre. Orientador: Prof. Dr. Marcos Borato Viana Professor Titular do Departamento de Pediatria da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais ii UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS Reitor: Prof. Clélio Campolina Diniz Pró-Reitor de Pós-Graduação: Prof. Ricardo Santiago Gomez Pró-Reitor de Pesquisa: Prof. Renato de Lima dos Santos Diretor da Faculdade de Medicina: Prof. Francisco José Penna Coordenador do Centro de Pós-Graduação: Prof. Manoel Otávio da Costa Rocha Chefe do Departamento de Pediatria: Profa. Benigna Maria de Oliveira PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE ÁREA DE CONCENTRAÇÃO SAÚDE DA CRIANÇA E DO ADOLESCENTE Coordenador: Profa. Ana Cristina Simões e Silva Subcoordenador: Prof. Eduardo Araújo Oliveira Colegiado: Alexandre Rodrigues Ferreira Débora Márques de Miranda Ana Cristina Simões e Silva Benigna Maria de Oliveira Eduardo Araújo de Oliveira Sérgio Veloso Brant Pinheiro Ivani Novato Silva Juliana Gurgel Jorge Andrade Pinto Helena Maria Gonçalves Becker Marcos José Burle de Aguiar Roberta Maia de Castro Romanelli Maria Cândida Ferrarez Bouzada Viana Cláudia Regina Lindgren Suelen Rosa de Oliveira Izabel Vasconcelos Barros Poggiali iii FERNANDA SILVA PIMENTEL IDENTIFICAÇÃO DE HEMOGLOBINAS COM CORRIDA ELETROFORÉTICA SEMELHANTE À DA HEMOGLOBINA S NO PROGRAMA ESTADUAL DE TRIAGEM NEONATAL DE MINAS GERAIS (PETN-MG) BANCA EXAMINADORA Prof. Marcos Borato Viana Profa. Cláudia Regina Bonini Domingos Profa. Maria Christina Lopes Araújo Oliveira Belo Horizonte, 31 de maio de 2010 iv Dedico este trabalho Aos meus pais, Chris, Tiago, Maria Helena, e especialmente a Deus. v AGRADECIMENTOS A Deus, o maior mentor deste trabalho. Obrigada pela vida! Aos meus pais José Maria e Maria das Almas, pelo amor incondicional. Por me ensinarem o sentido da vida e o valor de uma boa educação. Vocês são exemplos de força e fé. A você Chris, não tenho palavras suficientes para agradecer o apoio incondicional em todos os momentos. Obrigada por me erguer nos momentos difíceis, por suportar minhas fraquezas e compreender a minha ausência. Te amo muito. À professora e amiga Maria Helena Ferraz, idealizadora deste projeto, por acreditar na minha capacidade e me inserir no caminho científico. Sua amizade, seu apoio e seu estímulo foram essenciais na concretização deste estudo e têm sido muito importantes no meu desempenho profissional. Ao meu orientador, professor Marcos Borato Viana, obrigada pela credibilidade, confiança e compreensão. Pela dedicação e comprometimento na realização deste trabalho. O senhor é um exemplo de competência e profissionalismo. A minha eterna admiração. Ao Tiago, filho muito amado. Nascido algumas horas após a minha aprovação na primeira etapa do mestrado. Obrigada por esperar a hora certa de nascer. Me desculpe pela ausência. Você é a razão do meu viver. Aos meus irmãos e cunhados obrigada pela amizade, pelas palavras de apoio e por torcerem por mim. À minha segunda família, Sousa Borges, obrigada pelo apoio a mim dado e pelo carinho e atenção dada ao meu filho e marido nos momentos de minha ausência. Às crianças, sujeitos desta pesquisa, e aos pais ou responsáveis, pela confiança e por tornarem possível a realização deste trabalho. À amiga Sandra Trad pela amizade, companheirismo, disponibilidade e por ouvir os meus desabafos nos momentos difíceis. A minha eterna gratidão. Ao Dr. José Nélio Januário, diretor Geral do Nupad, pelo apoio sem o qual este trabalho não poderia ter sido realizado. Ao meu coordenador Roberto Vagner Puglia, coordenador do Laboratório de Triagem Neonatal do Nupad, pelo apoio constante e pela compreensão. À Dra. Dora Mendez del Castillo, coordenadora do Laboratório de Genética e Biologia Molecular do Nupad e sua equipe, em especial a Nara, pela importante vi contribuição na realização dos exames de biologia molecular e por ceder informações indispensáveis para a realização deste trabalho. Ao “Nupad”, pelo apoio logístico da Central de Projetos. Pelo apoio da equipe do Serviço de Referência de Controle e Tratamento (SCT), da Informática e Informação, da Divulgação e Comunicação Social, do laboratório de Triagem Neonatal, da Central de Contatos, do Setor de documentação. Obrigada por contribuírem no desenvolvimento deste trabalho. À bibliotecária Maria Piedade, pelo apoio na normatização das referências e em levantamentos bibliográficos. Ao colega de pós-graduação André Belisário pela contribuição na realização dos exames moleculares e por ceder informações importantes relativas à PCR. Ao Carlos Perone pelos conhecimentos e contribuição. As colegas Nara, Marcilene, Bruna e Juliana Nunes, pelas dicas e pelo compartilhar. As minhas tias, primas, amigas de graduação, colegas de trabalho, em especial Leandro, e todos os demais amigos e familiares que mais próximos ou mais distantes estiveram presentes nesta etapa da minha vida. À equipe da Hematologia do Hospital das Clínicas, da Fundação Hemominas, das Unidades de Saúde (UBS) pelo apoio e auxílio. As acadêmicas de medicina, Vanessa Cirino, Isabela Moraes e Marcela Hooper pelas incansáveis tentativas de contato com as famílias, pela organização de planilhas, localização e análise de géis; em especial, à Marcela pelo constante apoio na execução deste trabalho. Ao acadêmico de medicina Pedro Carneiro pelo apoio na construção de planilhas. Desde a localização das famílias até a obtenção do resultado final deste trabalho, diversos profissionais despenderam esforços necessários à concretização deste estudo. A todos vocês muito obrigada!! vii RESUMO Introdução: A triagem neonatal é de suma importância para a identificação de crianças com HbS. A incidência da doença falciforme em MG é 1:1.400 recém-nascidos. Há pelo menos três hemoglobinas variantes de cadeia beta e quatro de alfa, cujos pontos isoelétricos são semelhantes ao da HbS, o que pode levar ao diagnóstico falso positivo para traço ou doença falciforme. Objetivos: a) diferenciar a HbS de outras variantes com propriedades semelhantes na IEF; b) sequenciar uma variante encontrada em duas crianças homozigotas c) avaliar a relevância clínica desta variante. Métodos: Foram estudadas 126 crianças que tiveram os resultados da triagem neonatal lidos como indeterminados. Confirmação pela IEF no sexto mês de vida mostrou uma variante com mobilidade da HbS. Foram colhidas novas amostras e os géis de IEF foram lidos em duplicata, por três observadores independentes. As variantes foram classificadas, de forma tentativa, como mais rápidas (+0,5 mm), indistinguíveis ou mais lentas (-0.5 mm) do que o controle Hb S. Foi realizada PCR alelo-específica para o gene S em todos os casos; PCR multiplex para as sete deleções da -talassemia foi realizada nas duas famílias com homozigose da Hb variante. Os genes da alfa-globina foram sequenciados em ambos os casos e o gene beta, no primeiro caso. NCBI NG_000006.1 foi a sequência de referência para o gene α. Resultados: 62 crianças foram inicialmente diagnosticadas pelo programa como sendo Hb AS, 62 AV e 2 VV (V = Hb "rara"). Das 756 leituras (126x3x2 = 756) das IEFs, as Hbs foram classificadas como sendo mais rápidas do que a S-controle em 56,7%, mais lentas em 5,4% e indistinguíveis em 35%. A concordância intraobservador variou entre 63,2% e 77,5%. A concordância tríplice interobservador foi de apenas 23,3%. Em 12 casos (9,5%) a PCR para o gene S foi positiva; o padrão de IEF foi mais rápido em 29% de leituras e indistinguíveis de S em 71%. Não havia parentesco conhecido entre as famílias das duas crianças homozigotas. Casamento consanguíneo estava presente em ambas as famílias. A IEF mostrou em ambas as crianças uma única banda com mobilidade da Hb S. A IEF dos pais mostrou o fenótipo AS. O teste de falcização e a PCR alelo-específica para S foram negativos. O sequenciamento do gene  na primeira família foi normal. A PCR multiplex para as deleções da -talassemia revelou que ambas as crianças eram -α3.7/-α3.7 e todos os pais αα/-α3.7. O sequenciamento do gene híbrido α3.7 revelou uma mutação no códon 78 (AAC> AAA; Asn> Lys; Hb Stanleyville-II), em homozigose para as crianças e em heterozigose para todos os pais. Foi detectada α3.7 do tipo I no gene híbrido: o crossingover ocorreu a 5 'do sítio de restrição da ApaI, no IVS-2, do gene primitivo α1. Ambas as crianças tinham anemia hipocrômica e leve microcitose, como esperado para pacientes com -α3.7 /-α3.7. Conclusões: A classificação proposta para Hb S-like por IEF é inadequada. Muitos variantes "indistinguíveis" por IEF foram confirmadas como Hb não-S. Algumas Hb S verdadeiras foram lidas como mais "rápida" do que a S-controle. Contudo a Hb S verdadeira nunca foi lida como mais "lenta" e, portanto, é uma boa pista para o diagnóstico diferencial. Métodos moleculares elucidarão as variantes "raras". Duas dessas crianças, tinham homozigose para a talassemia -α3.7 (tipo I) associada à Hb Stanleyville (α 78 Asn>Lys), no estado de homozigose (α2Staß2). Os pais foram heterozigotos para ambas as mutações. Microcitose e hipocromia refletem o quadro típico da α-talassemia-1. viii ABSTRACT Introduction: Newborn screening is crucial for the identification of children with HbS. The incidence of sickle cell disease in MG is 1:1,400. There are at least 3 beta and 4 alpha globin variants whose isoeletric focusing point is similar to that of HbS, which may lead to false positive diagnosis of sickle cell trait or disease. Objectives: a) to discriminate HbS from variants with similar IEF properties; b) to sequence a variant found in 2 homogygous children, c) to assess the clinical meaning of thos variant. Methods: 126 children who had newborn screening results read as indeterminate and confirmation IEF at age 6 months showing a variant with HbS mobility were studied. New samples were collected and IEF gels were independently read in duplicate by 3 observers. Variants were tentatively classified as faster (+0.5mm), indistinguishable or slower (-0.5mm) than a HbS-control. Allele-specific PCR for S-gene was done in all cases and multiplex PCR for 7 -thalassemia deletions were done in homozygous cases. Alpha-globin genes were sequenced in both cases and beta-gene, in the first case. NCBI NG_000006.1 was the reference sequence for the α gene. Results: 62 children were originally diagnosed by the program as AS; 62 AV, and 2 VV (V=”rare” Hb). From 756 readings (126x3x2=756) Hbs were classified as faster than control-S in 56.7%, slower in 5.4% and indistinguishable in 35%. The intra-observer agreements varied from 63.277.5%. Triple inter-observer agreement was only 23.3%. In 12 cases (9.5%) PCR Sgene was positive; blind IEF pattern was faster in 29% of readings and indistinguishable from S in 71%. Families of the two homozygous children were not related to each other. Consaguineous marriage was present in both families. IEF in both children yielded a single band with HbS mobility. Parents’ IEF looks like AS phenotype. Sickle preps and S allele-specific PCR were all negative. -gene sequencing in the first family was normal. Multiplex PCR for -thalassemia deletions disclosed that both children were α3.7/-α3.7 and all parents αα/-α3.7. Hybrid α3.7 gene sequencing showed mutation in codon 78 (AAC>AAA; Asn>Lys; Hb Stanleyville-II), homozygous for both children and heterozyzous for all parentes. Type I α3.7 hybrid gene was detected throughout: crossover had ocurred 5’ of Apa-I restriction site in IVS 2 of the primitive α1-gene. Both children had mild mycrocytic and hypochromic anemia, as expected for -α3.7/-α3.7 patients. Conclusions: The proposed IEF classification for S-like Hb is misleading. Many IEF “indistinguishable” variants were proved not being Hb S. Some true Hb S were read as “faster” than S. True Hb S, however, was never read as a “slower” Hb and thus is a good hint for the differential diagnosis. Molecular methods will elucidate the “rare” variants. In one of these both children had homozygous 3.7 thalassemia (type I) associated with Hb Stanleyville-II (78 Asn→Lys), in homozygous state (2Staß2). Parents were heterozygous for both mutations. Mycrocytosis and hypochromia represent the typical picture of -thalassemia-1. ix SUMÁRIO RESUMO. viii ABSTRACT . ix LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS . xiii LISTA DE QUADROS E TABELAS . xvi LISTA DE FIGURAS . xvii 1. INTRODUÇÃO . 1 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA . 2.1 A Triagem Neonatal para Hemoglobinopatias. 2.1.1 Métodos Laboratoriais Aplicados à Triagem Neonatal das Hemoglobinopatias. 2.1.1.1 Eletroforese por Focalização Isoelétrica (IEF). 2.1.1.2 Cromatografia Líquida de Alta Resolução (HPLC). 2.2 Hemoglobinopatias. 2.3 Hemoglobinas Variantes. 2.3.1 Hemoglobina S. 2.3.2 Hemoglobinas variantes semelhantes à HbS . 2.3.2.1 Hemoglobinas variantes de cadeia β semelhantes à Hb S. 2.3.2.2 Hemoglobinas variantes de cadeia α semelhantes à Hb S. 2.4 Alfa talassemia. 3 3 5 6 7 8 10 11 12 17 18 20 3. OBJETIVOS. 23 3.1 Objetivo Geral. 23 3.2 Objetivos Específicos. 23 4. MATERIAIS E MÉTODOS. 4.1 Tipo de estudo. 4.2 Considerações Éticas. 4.3 Financiamento. 4.4 Casuística. 24 24 24 24 24 x 4.5 O Programa Estadual de Triagem Neonatal para Doença Falciforme e Outras Hemoglobinopatias (PETN-MG) . 25 4.5.1 Metodologias utilizadas no Laboratório de Hemoglobinopatias do Nupad. 25 4.5.1.1 Princípios dos métodos utilizados no Laboratório de Hemoglobinopatias. 26 4.5.1.1.1 Cromatografia Líquida de Alta Resolução (HPLC) – Kit Variant TM Sickle Cell Short Program. 26 4.5.1.1.2 Eletroforese por Focalização Isoelétrica (IEF) Hemoglobin Test Kit. 27 4.5.2 Protocolos utilizados pelo PETN-MG para a liberação dos resultados das hemoglobinopatias. 28 4.5.2.1 Protocolo utilizado para a análise do resultado da HPLC. 28 4.5.2.2 Protocolo utilizado para a análise do resultado da IEF. 30 4.6 Metodologias utilizadas na pesquisa. 31 4.6.1 Coleta das amostras. 31 4.6.2 Realização da Eletroforese por Focalização Isoelétrica (IEF). 32 4.6.3 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) alelo-específica para a detecção da mutação que origina a Hb S (códon 6 do éxon 1, GAG>GTG). 33 4.6.4 Realização da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para o diagnóstico molecular de alfa-talassemia . 34 4.6.5 Sequenciamento dos genes da beta e alfa globina nas famílias de duas crianças homozigóticas para varied quite markedly with height, and that air masses aloft (∼200 m above the ground) could have an aerosol loading quite different to that measured on the ground (Rankin and Wolff, 2002). However, for the event described here, at least, it appears that the 4139 ACPD 7, 4127–4163, 2007 Multi-seasonal NOy budget in coastal Antarctica A. E. Jones et al. Title Page Abstract Introduction Conclusions References Tables Figures Back Close Full Screen / Esc Printer-friendly Version Interactive Discussion EGU source of surface snow nitrate was wet deposition and scrubbing, and the data are consistent with the nitrate source being p-NO−3 within the boundary layer. 4 Boundary layer trace gas versus snowpack sources of NOx A key question among polar atmospheric chemists concerns the role of polar snow5 packs as a source of trace gases to the overlying boundary layer. For those studying nitrogen chemistry, the interest lies in understanding the budget of NOx; we know that NOx is photochemically produced (Honrath et al., 1999; Jones et al, 2000) and then released (Jones et al., 2001; Wolff et al., 2002) from the snowpack, but the relative contribution compare to NOx production from trace gases in the background atmo10 sphere has not yet been assessed. The data gathered during CHABLIS allow us to constrain the dominant NOx production mechanisms, and by comparing these calculated production rates, to assess the relative importance of sources of boundary layer NOx, both in the air and from the snowpack. This approach also provides insight into which gas-phase species are dominating NOx production within the boundary layer. 15 4.1 Methodology We selected two 24-h periods, one in summer and one in spring, within which to calculate diurnally-averaged NOx (as either NO or NO2) production. The periods selected were 18 January 2005 and from noon of 28 September 2004 through to noon of 29 September 2004. The former period was the first day in the summer season when 20 high-resolution alkyl nitrate data were available to compliment the other high-resolution datasets. This was also a time when an NOy intensive was carried out, so that daily HNO3 measurements are available. During the latter period, an NOy measurement intensive was also conducted, giving, in addition, alkyl nitrate measurements every 6 h – the highest resolution alkyl nitrate data available for the spring period. 4140 ACPD 7, 4127–4163, 2007 Multi-seasonal NOy budget in coastal Antarctica A. E. Jones et al. Title Page Abstract Introduction Conclusions References Tables Figures Back Close Full Screen / Esc Printer-friendly Version Interactive Discussion EGU 4.1.1 Deriving gas-phase data NOx production rates were calculated every 3 h during these diurnal periods, giving 8 data points from which daily means could be calculated. Where possible (e.g. for HONO, PAN, summertime methyl and ethyl nitrates), input data were taken from an 5 hourly data merger carried out for all the CHABLIS data and the few missing data points were derived by linear interpolation. For the 6-hourly springtime methyl and ethyl nitrate mixing ratios, it was by default necessary to interpolate to achieve data at a 3-h frequency. These data were thus point-averages rather than hourly-averages, but as mixing ratios did not vary rapidly over the day, the uncertainty introduced by this 10 approach is limited. For HNO3, sampled over a longer timeframe, it was necessary to reconstruct higher resolution data. Summertime HNO3 was measured as a 24-hmean centred around 23:59 on both 17 January and 18 January. These two data points were averaged to derive a daily mean for 18 January. The diurnal variation was reconstructed by comparing with 6-hourly resolution HNO3 data measured previously 15 at Neumayer station (Jones et al., 1999). There, a diurnal cycle with amplitude 7.5 pptv was measured, centred around noon. This amplitude was applied to the 18 January mean to give a reasonable diurnal cycle. For the 28/29 September HNO3, the 6-hourlyresolution data were below the detection limit, so the daily mean for 27 September and 29 September were averaged to give a mean for the calculation period. This mean was 20 only 0.96 pptv, and, being so low, it was taken to be constant over the 24-h period of interest. Finally, several measured NOy species did not exceed 2 pptv throughout the year (e.g. NO3 and the higher alkyl nitrates), and they were ignored for this calculation. Similarly, output from the GEOS-Chem model suggested that HNO4 also remained well below this threshold throughout the year (M. Evans, personal communication) so 25 no account for HNO4 was taken here. 4141 ACPD 7, 4127–4163, 2007 Multi-seasonal NOy budget in coastal Antarctica A. E. Jones et al. Title Page Abstract Introduction Conclusions References Tables Figures Back Close Full Screen / Esc Printer-friendly Version Interactive Discussion EGU 4.1.2 Gas-phase kinetic data Gas-phase reaction rates were taken from Atkinson et al. (2004, 2006) and photolysis rates for each 3-h period were calculated using the on-line version of the radiative transfer model TUV (Madronich and Flocke, 1998). For these calculations, input parameters 5 included the total ozone column measured at Halley for these days, and an albedo of 0.9. Clear sky conditions were assumed, so photolysis rates will be overestimated, but the relative effect on all species will be comparable. In addition, OH concentrations were necessary for some kinetic calculations. On 18 January 2005, OH was measured by the FAGE (Fluorescence Assay by Gas Expansion) instrument (Bloss et al., 2007). 10 These data were included in the CHABLIS data merger, so that mean hourly OH concentrations were available for this period. No OH measurements were available for September, so OH was derived indirectly. Bloss et al. (2007) calculated a mid-month OH throughout the CHABLIS measurement period based on varying jO(1D) (from the TUV model). To derive a daily mean OH for 28/29 September, we averaged the mid15 month values for September and October, and found that (28/29 September)calculated = 0.561 (15 January)calculated. A diurnally-varying OH for 28/29 September was calculated from 0.561 * each 3-hourly measured January OH. Temperature data were taken from measured values. For PAN thermal decomposition, the upper limit was calculated according to –d[PAN]/dt = k[PAN]. 20 4.1.3 Calculating snowpack NOx emissions The rates with which NOx was emitted from the snowpack during the periods of interest were calculated in line with previous work by Wolff et al. (2002). In brief, spectral irradiance at 3-h intervals was calculated using the TUV model. These were converted to actinic flux as a function of depth according to output from a model designed to 25 simulate light propagation through snow (Grenfell, 1991). The actinic fluxes were then convoluted with the absorption cross-sections and the quantum yield to give J values. In this case, temperature-dependent quantum yields were used (Chu and Anastasio, 4142 ACPD 7, 4127–4163, 2007 Multi-seasonal NOy budget in coastal Antarctica A. E. Jones et al. Title Page Abstract Introduction Conclusions References Tables Figures Back Close Full Screen / Esc Printer-friendly Version Interactive Discussion EGU 2003) which were not available at the time of the Wolff et al., 2002 work. A temperature of –4 C was taken for 18 January, and of –20 C for 28/29 September. These were chosen by assuming that the top few cms of snow saw an average of the near surface (1 m) air temperature for the preceding 1–2 days. Finally, the nitrate concentration in snow 5 was derived using the average of the 0 cm, 5 cm and 10 cm snow nitrate concentration from the snowpit dug nearest to the date in question. This gave 73 ng/g for September and 157 ng/g for January. 4.2 Outcome The results for the gas-phase production rates are given in Table 3a. It is immedi10 ately evident that the contribution from HONO photolysis completely dominates NOx production for both periods, with rates of 6.20E+05 and 4.80E+04 molecs cm−3 s−1 for January and September respectively. This is no great surprise, given the very short lifetime of HONO to photolysis, and reflects a recycling of NOx through HONO (via NO + OH → HONO) rather than a pure source of NOx. Indeed, NOx, although generally 15 defined as NO + NO2, is sometimes expanded to include HONO as well. However, as discussed earlier, HONO also has a source from snowpack photochemistry (Zhou et al., 2001; Beine et al., 2002; Dibb et al., 2002) so as well as facilitating recycling, boundary layer HONO that has been released from the snowpack can act as a source of atmospheric NOx. With our data it is not possible to determine how much of the 20 NOx produced by HONO photolysis (or reaction with OH) is Plano Diretor do Município de Paraguaçu. Projeto de Lei n. 22/2005. Prefeitura Municipal de Paraguaçu, 82 f., [14], Il. Edição fac-similar. ______. Prefeitura Municipal de Paraguaçu; Conselho Municipal do Patrimônio Histórico de Paraguaçu/MG; Memória Arquitetura Ltda. O Patrimônio Cultural de Paraguaçu/MG. 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Identificação de hemoglobinas com corrida eletroforética semelhante à da hemoglobina S no Programa Estadual de Triagem Neonatal de Minas Gerais (PETN-MG)
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