Constraint-based modeling and kinetic analysis of the Smad dependent TGF-beta signaling pathway.

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Constraint-Based Modeling and Kinetic Analysis of the Smad Dependent TGF-b Signaling Pathway Zhike Zi1, Edda Klipp1,2* 1 Computational Systems Biology, Max Planck Institute for Molecular Genetics, Berlin, Germany, 2 Theoretical Biophysics, Humboldt University Berlin, Institute for Biology, Berlin, Germany Background. Investigation of dynamics and regulation of the TGF-b signaling pathway is central to the understanding of complex cellular processes such as growth, apoptosis, and differentiation. In this study, we aim at using systems biology approach to provide dynamic analysis on this pathway. Methodology/Principal Findings. We proposed a constraint-based modeling method to build a comprehensive mathematical model for the Smad dependent TGF-b signaling pathway by fitting the experimental data and incorporating the qualitative constraints from the experimental analysis. The performance of the model generated by constraint-based modeling method is significantly improved compared to the model obtained by only fitting the quantitative data. The model agrees well with the experimental analysis of TGF-b pathway, such as the time course of nuclear phosphorylated Smad, the subcellular location of Smad and signal response of Smad phosphorylation to different doses of TGF-b. Conclusions/Significance. The simulation results indicate that the signal response to TGF-b is regulated by the balance between clathrin dependent endocytosis and non-clathrin mediated endocytosis. This model is useful to be built upon as new precise experimental data are emerging. The constraint-based modeling method can also be applied to quantitative modeling of other signaling pathways. Citation: Zi Z, Klipp E (2007) Constraint-Based Modeling and Kinetic Analysis of the Smad Dependent TGF-b Signaling Pathway. PLoS ONE 2(9): e936. doi:10.1371/journal.pone.0000936 successfully interpret and predict cellular behavior [15]. Constraint-based modeling is an effective method to narrow the range of the possible parameter space for quantitative models. However, there is less attention to apply the constraint-based modeling for the quantitative analysis of signaling pathways. Here, we proposed a constraint-based modeling method to build a comprehensive mathematical model for the Smad-dependent TGF-b signaling pathway by fitting experimental data and incorporating the qualitative constraints from the experimental analysis. So far, several mathematical models have been proposed for the TGF-b signaling pathways. Vilar et al. proposed a concise model for the TGF-b receptor trafficking network [16]. On the other hand, Clarke et al. [17] and Melke et al. [18] proposed the models for the Smad nucleocytoplasmic shuttling and Smad phosphorylation response to the TGF-b signal without considering the receptor trafficking steps. In this study, we established a comprehensive mathematical model for the TGF-b signaling pathway, which includes the signal transduction, the receptor endocytosis, the Smad nucleocytoplasmic shuttling, and the ligand induced INTRODUCTION The transforming growth factor b (TGF-b) superfamily consists of TGF-bs, bone morphogenetic proteins (BMPs), activins and related proteins. These proteins regulate numerous cellular processes, such as cell proliferation, differentiation, apoptosis and specification of developmental fate [1,2]. TGF-b initiates signaling by forming a ligand-receptor complex with the type I and type II receptors at cell surface. The activated receptor complex propagates the signal inside by phosphorylating the receptorregulated Smad (R-Smad). Activated R-Smad then forms a heteromeric complex with common mediated Smad (Co-Smad), Smad4. These complexes accumulate in the nucleus and regulate gene expression in a cell-type-specific manner through interactions with transcription factors, coactivators and corepressors [3]. The nuclear Smad complexes are then dephosphorylated by Smad phosphatase [4]. Another important player is inhibitory Smad (ISmad), Smad7, which recruits Smurf to the TGF-b receptor complex to facilitate the ubiquitin dependent degradation of receptors [5]. Both R-Smad and Smad4 continuously shuttle between the cytoplasm and nucleus in uninduced cells and also in presence of TGF-b signal [6–8]. The receptors and activated ligand-receptor complex are internalized through two distinct endocytic routes, the clathrin-dependent endocytosis and the caveolar lipid-raft mediated endocytosis [9,10]. Figure 1 schematically depicts the Smad dependent TGF-b signaling pathways. Quantitative modeling studies of signaling pathways have been successfully applied to understand complex cellular processes [11– 14]. Traditionally, the quantitative models are validated by fitting western-blot data. Due to the complexity of the model and the quality of the data, over-fitting is a common problem for parameter estimation. When the model has many estimated parameters and the corresponding data is a few, the over-fitting problem might lead to some unwarranted conclusions because the parameter set in the model might be a special domain of possible parameter sets which can similarly fit the data well, but result in different predictions. On the other hand, genome-scale constraintbased models of metabolism have been constructed and used to PLoS ONE | www.plosone.org Academic Editor: Gustavo Stolovitzky, IBM Thomas J. Watson Research Center, United States of America Received March 2, 2007; Accepted September 6, 2007; Published September 26, 2007 Copyright: ß 2007 Zi, Klipp. This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Funding: Z. Zi is supported by PhD program of the IMPRS for Computational Biology and Scientific Computing. This work was supported by ENFIN, a Network of Excellence funded by the European Commission within its FP6 Programme, under the thematic area ‘‘Life sciences, genomics and biotechnology for health’’, contract number LSHG-CT-2005-518254. Competing Interests: The authors have declared that no competing interests exist. * To whom correspondence should be addressed. E-mail: klipp@molgen.mpg. de 1 September 2007 | Issue 9 | e936 Modeling of TGF-b Pathway Figure 1. Schematic representation of Smad dependent TGF-b signaling pathway. Detailed information about this pathway is described in the text. doi:10.1371/journal.pone.0000936.g001 negative feedback. The simulation analysis of the model agrees well with the experimental analysis of TGF-b pathway, such as the time course of nuclear phosphorylated Smad, the subcellular location of Smad, and Smad phosphorylation response to different concentrations of TGF-b. We employed the mathematical model to study the dynamic relationship between receptor trafficking at the cell surface and the activation of the phosphorylated Smad in the nucleus. The simulation results indicate that the signal response to TGF-b is regulated by the balance between clathrin dependent endocytosis and non-clathrin mediated endocytosis. distribution of receptors and ligand-receptor complex in different pools, such as membrane surface, clathrin-coated pit, early endosome and caveolar lipid-raft; (iv) the formation of activated receptor complex induced by TGF-b. In the module of Smad nucleocytoplasmic shuttling, the signal events we consider are (i) Smad nucleocytoplasmic shuttling; (ii) Smad complex formation; (iii) nuclear Smad complex dephosphorylation by nuclear phosphatase. In the module of I-Smad negative regulation, the negative feedback contributing to the ligand-induced degradation of the receptors by I-Smad is simplified and modeled as a black box from the nuclear phosphorylated Smad. We made the following assumptions for the model: MATERIALS AND METHODS Mathematical model of the Smad dependent TGF-b signaling pathway (1) Experimental analyses indicate that TGF-b receptor trafficking is not affected by TGF-b stimulation [9,10]. We assume that the corresponding internalization and recycling rates for type I receptor, type II receptor and activated ligand-receptors are the same. (2) Referring to the concise model of signal processing in the TGF-b ligand-receptor network [16], we assume that the rate of sequential formation of ligand-receptor complex is proportional to the amount of ligand, type I receptor and type II receptor. We proposed here a comprehensive model for Smad dependent TGF-b signaling pathway in mammalian cells, which includes three modules: receptor trafficking and signaling; Smad nucleocytoplasmic shuttling and signaling and I-Smad negative regulation. In the module of receptor trafficking, the model takes into account the following essential elements: (i) constitutive receptor synthesis and degradation; (ii) receptor and ligand-receptor complex trafficking by two distinct endocytic routes; (iii) the PLoS ONE | www.plosone.org 2 September 2007 | Issue 9 | e936 Modeling of TGF-b Pathway (3) The experimental data shown by Lin, et al. indicate that the variation of total amount of Smad is small [4]. We assume that the total amount of Smad is constant. Therefore, the production and degradation of Smad are not considered in this model. (4) Previous experimental analyses suggest that I-Smad/Smurf complex targets the lipid-raft-bound receptor for degradation which leads to the ligand-induced negative feedback [5,9]. We assume that the rate of ligand-induced degradation of receptors is proportional to the amount of nuclear phoshporylated Smad and the receptor complex in caveolar lipidraft. Smad2 kexp ½Smad2nuc Vnuc d½Smad2cyt  Smad2 ½Smad2cyt z ~{kimp Vcyt dt ð10Þ {kSmads Smad2 ½Smad2cyt Vcyt d½Smad2nuc  kimp Smad2 ~ {kexp ½Smad2nuc  dt Vnuc ð11Þ Smads zkdiss In order to compare with the published data, we used Smad2 denoting R-Smad. We used the law of mass-action to describe the rate of signal transduction steps. The time-dependent changes of the concentrations of the signaling proteins and protein complexes are determined by the following system of differential equations: {kSmads d½T1REE  T1R ~kiEE ½T1RSurf {krEE ½T1REE {kdeg ½T1REE  dt ð1Þ Smads zkdiss Complex ½Smad2cyt ½Smad4cyt ½LRCEE  Complex ½Smads Complexnuc  d½Smads Complexcyt  ~kSmads dt ð2Þ Complex ½Smad2cyt ½Smad4cyt  Smads Complex ½Smads ½LRCEE zkimp ð3Þ ð14Þ Complexcyt  d½Smads Complexnuc  ~ dt Smads kimp d½T2RSurf  ~vT2R {kiCave ½T2RSurf zkrCave ½T2RCave { dt kiEE ½T2RSurf zkrEE ½T2REE zkrCave ½LRCCave { ½Smads Complexnuc  Smad4 ½Smad4cyt Vcyt d½Smad4nuc  kimp Smad4 ~ {kexp ½Smad4nuc  dt Vnuc ð13Þ kLRC ½TGF b½T1RSurf ½T2RSurf  d½T1RCave  ~kiCave ½T1RSurf {krCave ½T1RCave  dt Complex Smad4 kexp ½Smad4nuc Vnuc d½Smad4cyt  Smad4 ~{kimp ½Smad4cyt z Vcyt dt ð12Þ d½T1RSurf  ~vT1R {kiCave ½T1RSurf zkrCave ½T1RCave { dt kiEE ½T1RSurf zkrEE ½T1REE zkrCave ½LRCCave { Complex ½Smad2cyt ½Smad4cyt ½LRCEE  ð4Þ Complex Smads {kdiss ½Smads Complexcyt Vcyt ð15Þ Vnuc Complex ½Smads Complexnuc  kLRC ½TGF b½T1RSurf ½T2RSurf  d½T2RCave  ~kiCave ½T2RSurf {krCave ½T2RCave  dt d½T2REE  T2R ~kiEE ½T2RSurf {krEE ½T2REE {kdeg ½T2REE  dt d½LRCSurf  ~kLRC ½TGF b½T1RSurf ½T2RSurf { dt d½TGF b ~(krCave ½LRCCave zkrEE ½T2REE { dt ð5Þ ð16Þ kLRC ½TGF b½T1Rsurf ½T2Rsurf )Vcyt =Vextra The model is composed of an ordinary differential equations system with 16 state variables and 20 parameters. The values and the corresponding biological meaning of the parameters are listed in Table 1. The initial conditions and the biological meaning of the variables are listed in Table 2. ð6Þ ð7Þ kiCave ½LRCSurf {kiEE ½LRCSurf  Derivation of the parameter values d½LRCCave  ~kiCave ½LRCSurf {krCave ½LRCCave { dt In order to keep the consistency of the parameter values, we derived the parameter values from experimental analysis in epithelial cells. In particularly, most of the data used in this study is from experimental analysis of HaCaT (Human keratinocyte cell line) cells. The rational guided the derivation of relative parameter values is described in the following: ð8Þ klid ½LRCCave ½Smads Complexnuc  d½LRCEE  ~kiEE ½LRCSurf {krEE ½LRCEE {kcd ½LRCEE  dt PLoS ONE | www.plosone.org N ð9Þ 3 Parameters for the volume ratio of different compartments: The model distinguishes the different compartments of extracellular medium, cytoplasm and nucleus where the September 2007 | Issue 9 | e936 . Modeling of TGF-b Pathway Table 1. Parameter values in the model . Parameter symbol Biological meaning Value vTIR type I receptor production rate constant 0.0103 nM/min estimated vT2R type II receptor production rate constant 0.02869 nM/min estimated kiEE internalization rate constant of receptor from cell surface to early endosome 0.33 min21 [9,16] krEE recycling rate constant of receptor from early endosome to cell surface 0.033 min21 [9,16] kiCave internalization rate constant of receptor from cell surface to caveolar lipid-raft 0.33 min21 [9,16] krCave recycling rate constant of receptor from caveolar lipid-raft to cell surface 0.03742 min21 estimated kcd constitutive degradation rate constant for ligand-receptor complex in early endosome 0.005 min21 kLRC ligand-receptor complex formation rate constant from TGF-b and receptors 2197 nM klid ligand induced degradation rate constant for ligand-receptor complex in caveolar lipid-raft 0.02609 min21 estimated T1R kdeg constitutive degradation rate constant for type I receptor in early endosome 0.005 min21 [21] T2R kdeg constitutive degradation rate constant for type II receptor in early endosome 0.025 min21 [21] kSmad2 imp nuclear import rate constant for Smad2 0.16 min21 [8] kSmad2 exp nuclear export rate constant for Smad2 1 min21 [8] kSmad4 imp nuclear import rate constant for Smad4 0.08 min21 [8] kSmad4 exp nuclear export rate constant for Smad4 0.5 min21 [8] kSmads_Complex formation rate constant for the phosphorylated Smad complex 6.8561025 nM22min21 estimated kSmads_Complex imp nuclear import rate constant for the phosphorylated Smad complex 0.16 min [8,22] kSmads_Complex diss dissociation rate constant for the nuclear phosphorylated Smad complex 0.1174 min21 estimated Vcyt/Vnuc ratio of cytoplasmic to nuclear volume 3.0 3.0 [8] Vcyt/Vextra ratio of cytoplasmic volume to the average extracellular medium volume per cell 0.001 0.001 [19,20] 22 Reference [9] min 21 21 estimated doi:10.1371/journal.pone.0000936.t001 respectively. A typical cell culture experiment would have a cell density of 1.06106 cells/ml. The average extracellular medium volume per cell (Vextra) is about 1.061029 Liter. Hence, the Vcyt volume ratio of cytoplasm to extracellular medium ( ) is Vextra set to a value of 0.001. signaling steps take place. The average cytoplasimc/nuclear Vcyt ) was measured as about 3 in reference [8]. volume ratio ( Vnuc The volume of HaCaT cell is estimated as about 1.4610212 Liter [19,20], therefore, we can derive the volume of cytoplasm and nucleus are 1.05610212 Liter and 3.5610213 Liter, . Unit Table 2. Initial conditions of state variables (proteins) in the model . Variable symbol Biological meaning Value of the initial condition T1Rsurf type I receptor at cell surface 0.237 T1RCave type I receptor in caveolar lipid-raft 2.092 2.06 T1REE type I receptor in early endosome T2Rsurf type II receptor at cell surface 0.202 T2RCave type II receptor in caveolar lipid-raft 1.778 T2REE type II receptor in early endosome 1.148 LRCSurf ligand-receptor complex at cell surface 0 LRCCave ligand-receptor complex in caveolar lipid-raft 0 LRCEE ligand-receptor complex in early endosome 0 Smad2cyt Smad2 in the cytoplasm 492.61 Smad2nuc Smad2 in the nucleus 236.45 1149.4 Smad4cyt Smad4 in the cytoplasm Smad4nuc Smad4 in the nucleus 551.72 Smads_Complexcyt phosphorylated Smad complex in the cytoplasm 0 Smads_Complexnuc phosphorylated Smad complex in the nucleus 0 TGFb TGF-b in the extracellular medium 0.08 nM for 2 ng/ml The initial conditions of the variables are set as the steady state concentration of the corresponding proteins in the uninduced cell which are derived from the parameter values described in Table 1. doi:10.1371/journal.pone.0000936.t002 PLoS ONE | www.plosone.org 4 September 2007 | Issue 9 | e936 Modeling of TGF-b Pathway N N N N Rate constant of receptor constitutive degradation: Pervious experimental data indicate that the type II receptor has a half-life of about 1 hr, whereas type I receptors are more stable, with a half-life of about 4–6 hr [21]. The receptors are constitutively degraded from early endosomes and about 50% percent of initial labeled receptors locate in early endosome [9]. Rescaling the degradation rate of the total receptors to the early endosome receptors results in constitutive degradation rate T2R constant of type I receptor (kT1R deg ) and type II receptor (k deg ) { ln 0:5 ) and 0.025 min21 with value of 0.005 min21 ( 300 min |0:5 { ln 0:5 ), respectively. On the other hand, Figure 3 of ( 60 min |0:5 reference [9] shows that only 30% of the initial labeled receptor complex remain in the cell after 8 h when the caveolar endocytosis is inhibited. Based on this information, we can derive the constitutive foram contidos fisicamente em decúbito lateral direito, e as agulhas posicionadas sobre os acupontos (ACs) coração 7 (C-7 – Shenmen), localizado entre o processo estiloide lateral e o osso cárpico acessório, exatamente na dobra da articulação úmero-rádio-ulnar, e pericárdio 6 (PC-6 – Neiguan), localizado entre os tendões do músculo flexor carporradial e do músculo flexor digital superficial (Fig. 1A, 1B e 1C), conforme descrito por Draehmpaehl e Zohmann (1997). Já para a segunda seção, os animais foram novamente posicionados em decúbito lateral direito, e as agulhas inseridas em acupontos falsos (AF), localizados no oitavo e no nono espaço intercostal esquerdo (Figura 1D), onde não há interferência de nenhum outro meridiano, conforme descrito por (Draehmpaehl e Zohmann, 1994). Independentemente da seção, não foi realizada estimulação manual das agulhas, e os acupontos permaneceram estimulados por um período de 30 minutos, respeitando-se o período mínimo de 10 a 20 minutos sugerido por Scott (2001) para que o acuponto possa promover um efeito observável. Figura 1. Localização dos acupontos C-7 (seta em A) e PC-6 (seta em B) no cão (Adaptado de Draehmpaehl e Zohmann, 1997). Em C, acupuntura em cão do experimento acuponto C-7 (seta azul) e acuponto PC-6 (seta laranja). Em D, acupuntura em cão do experimento em acuponto falso. Arquivo pessoal, 2014.  Previamente à aplicação das agulhas nos ACs, foi realizado um registro eletrocardiográfico (ECG) com dois minutos de duração e, após a inserção das agulhas nos ACs, o registro eletrocardiográfico se manteve durante os 30 minutos de acupuntura. Para a realização do eletrocardiograma, foi utilizado um aparelho de eletrocardiografia computadorizada (ECGPC – TEB®), respeitando-se o padrão de fixação de eletrodos descrito por Tilley (1992), com registro das derivações bipolares e unipolares aumentadas e calibração de 25mm/s e 1mV (N). Os dados do ECG foram interpretados de forma comparativa pré e pós-estimulação dos acupontos, sendo os dados pós-estimulação coletados e interpretados em intervalos de cinco minutos até o final da gravação (30 minutos). Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.68, n.1, p.252-256, 2016 253 Silva et al.  Para a análise da VFC, foi utilizada a fórmula disponível em Carareto et al. (2007). A normalidade dos dados obtidos foi verificada pelo teste de Shapiro-Wilk (P>0,05), seguida pelo teste ANOVA com pós-teste de Bonferroni para as variáveis paramétricas e pelo teste de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn (P<0,05) para as variáveis não paramétricas. Foi realizada análise descritiva para as variáveis qualitativas. No presente estudo, 90% dos animais apresentaram arritmia sinusal respiratória, demonstrando maior influência do sistema nervoso simpático, em todos os momentos do grupo ACs, enquanto no grupo AF esse ritmo cardíaco esteve presente em 100% dos animais, em todos os momentos. O ritmo sinusal foi encontrado apenas em 10% dos animais do grupo ACs, sugestivamente por se tratar da primeira exposição dos animais ao experimento, resultando em maior influência parassimpática sobre o sistema cardiovascular. Conforme demonstrado na Tab. 1, houve pequena e irrelevante diferença quando comparada a FC de todos os momentos do grupo ACs com os momentos do grupo AF, o que evidencia, portanto, a ineficácia da estimulação dos acupontos sobre esse parâmetro. Tabela 1. Frequência cardíaca (FC) e variabilidade da frequência cardíaca (VFC) obtidas com a realização dos acupontos verdadeiros (AV) C-7 e PC-6 e do acuponto falso (AF) em diferentes momentos do ECG, expressos em mediana (percentil 25% - percentil 75%) para a FC e média±desvio-padrão para a VFC Momentos FC (bpm) VFC AV AF AV AF 0 minuto 107 (92-130)a 112 (93-129)a 12,79±0,46ab 12,71±0,47b 5 minutos 90 (79-121)a 93 (82-115)a 13,08± 0,48ab 13,09± 0,49ab 10 minutos 94 (79-118)a 88 (70-123)a 13,01± 0,48ab 13,12± 0,53ab 15 minutos 96 (76-120)a 99 (81-115)a 13,04± 0,52ab 13,17± 0,51a 20 minutos 95 (79-120)a 95 (81-112)a 13,13± 0,51ab 13,07± 0,54ab 25 minutos 104 (83-115)a 89 (76-108)a 13,15± 0,45ab 13,17± 0,53a 30 minutos 87 (82-107)a 95 (81-117)a 13,18± 0,46ab 13,11± 0,56ab P = 0,0890 P = 0,0051 Para a FC, valores seguidos por letras distintas diferem entre si (P<0,05) ao teste de Dunn. Para a VFC, valores seguidos por letras distintas diferem entre si (P<0,05) ao teste de Bonferroni. Não foi observada diferença na VFC (Tab. 1) entre os grupos do ACs e AF, exceto quando comparado apenas o momento basal com os momentos 15 e 25 minutos do AF, contudo sem relevância clínica para o estudo. Sabidamente, VFC constitui uma medida simples e não invasiva que avalia os efeitos do sistema nervoso autônomo sobre o coração. Variações nessa variabilidade são normais e esperadas, indicando habilidade do coração em responder a múltiplos estímulos fisiológicos e ambientais. Em síntese, uma alta VFC representa boa adaptação, caracterizando um indivíduo saudável, com mecanismos autonômicos eficientes, enquanto a baixa VFC representa adaptação anormal e insuficiente do SNA (Carareto et al., 2007). Dentre as opções terapêuticas para o tratamento de anormalidades dos mecanismos autonômicos, a acupuntura vem se destacando em vários estudos em animais, entretanto em nenhum desses estudos se objetivou a avaliação do efeito da acupuntura em indivíduos saudáveis, conforme ocorreu no presente estudo, fator limitante à discussão mais aprofundada. Observam-se, na literatura, diversos estudos em que foram observados os efeitos da acupuntura sobre pacientes com diferentes distúrbios cardiovasculares. Syuu et al. (2001) relataram efeitos benéficos da estimulação do acuponto PC-6 em cães anestesiados e sob toracotomia. Nesse estudo, os autores descrevem reduções na pressão arterial média, volume diastólico final, frequência cardíaca, débito cardíaco e pressão sistólica final mediante estimulação do acuponto. O efeito cardiovascular da acupuntura sobre o acuponto PC-6 em cães também foi observado por Jingbi (2004) em modelo de experimental de infarto agudo do miocárdio. Nesse estudo, foi observado que a acupuntura proporcionou redução do segmento ST do eletrocardiograma, além de reduzir as áreas de infarto induzidas pela ligadura coronariana. Entretanto, esses dois 254 Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.68, n.1, p.252-256, 2016 Efeitos da acupuntura estudos diferem do presente pelo fato de as agulhas terem sido estimuladas eletricamente (eletroacupuntura), enquanto no presente estudo estas permaneceram em repouso. Cárdenas (2006) observou que a estimulação dos mesmos acupontos empregados no presente estudo em cavalos sob anestesia geral demonstrou efeitos positivos sobre a taquicardia ventricular induzida por infusão contínua de dopamina, nos quais a estimulação dos ACs C-7 e PC-6 promoveu diminuição do tempo da taquicardia ventricular, demonstrando, assim, a eficácia da estimulação desses acupontos em animais. Um estudo controlado em ratos demonstrou que a estimulação dos acupontos PC-5 e PC-6 reduziu significativamente a incidência de taquiarritmias induzidas experimentalmente pós-oclusão e reperfusão da artéria coronária esquerda (Lujan et al., 2007). Em humanos, a revisão de oito estudos utilizando acupuntura para o tratamento de arritmias cardíacas encontrou cerca de 87 a 100% que foram convertidos ao ritmo sinusal após a estimulação dos acupontos (Xie e Wedemeyer, 2012). estudo não se valeu da estimulação elétrica sobre os acupontos falsos ou verdadeiros (C-7 Shenmen e PC-6 Neiguan). Limitações a este estudo compreendem o fato de que a escolha dos acupontos explorados baseouse nas indicações terapêuticas descritas por Draehmpaehl e Zohmann (1994), em que o acuponto C-7 é indicado em casos de alterações funcionais do coração, e o acuponto PC-6 quando há dores miocárdicas. Ainda segundo os mesmos autores, essa forma de terapia alternativa objetiva normalizar funções orgânicas alteradas e, como no presente estudo foram utilizados animais hígidos, a acupuntura pode não ter promovido influência sobre a VFC nos cães que participaram do experimento. Limita-se, ainda, este estudo quando da observação das recomendações descritas por Scott (2001), quando ele destaca a necessidade de um ou dois tratamentos semanais durante quatro a seis semanas consecutivas, tempo em que se espera que possa haver a resposta desejada à terapia, fato não realizado no presente estudo. Finalmente, Kimura e Hara (2008) desenvolveram um estudo em que foram estudados os efeitos da eletroacupuntura sobre o ritmo do sistema nervoso autônomo em cães. Dentre outras análises, observaram o coeficiente de variação dos intervalos R-R (CVRR) do eletrocardiograma, o qual avalia o índice de atividade nervosa autônoma, de forma semelhante à VFC, a qual também se utiliza do intervalo R-R como unidade de medida. Seus entre os grupos (* p < 0,01). O principal critério de exclusão deste estudo foi idade superior a 74 anos. Um declínio da função neurocognitiva (descrito como podendo chegar a 9%) no período pós‑operatório é muito mais comum e esperado para idades acima daquela. A amostra avaliada neste estudo tinha idade média de 60 anos, que foi relacionada a menor efeito na função neurocognitiva no pós-operatório. Ao se relacionar idade com função cognitiva, apenas o Digit Span Test, que avalia velocidade de coordenação motora visual, mostrou diferença nos escores, que foram menores no Grupo 222. Neste estudo, alguns resultados do comprometimento cognitivo em pacientes submetidos a CRM com BCP diferiram daqueles relatados na literatura. A maioria dos testes neurocognitivos realizados mostrou aumento ou leve redução de escores entre o período pré-operatório e a alta hospitalar no Grupo 2, que foi submetido a mais sessões de fisioterapia. A avaliação da atenção e do sequenciamento alternado através do Trail Making Test, parte A, mostrou nos dois grupos um leve aumento do escore entre o período pré-operatório e a alta hospitalar. No entanto, na parte B do mesmo teste, ao contrário do Grupo 1, o Grupo 2 apresentou aumento do seu escore no mesmo período, sugerindo que a maior estimulação melhorou a função cognitiva. Resultado semelhante foi observado ao se avaliar a memória de curto prazo e a memória verbal imediata usando-se o Subteste de Substituição de Dígitos por Símbolos: o escore do Grupo 1 diminuiu enquanto o do Grupo 2 aumentou. Ao se avaliar a velocidade de coordenação motora visual e memória visual (Teste de Retenção Visual de Benton e Coding Test), observou‑se uma redução nos dois grupos, sendo maior no Grupo 1 (p < 0,01). Há relatos na literatura de que anormalidades neurocognitivas leves podem ocorrer após cirurgia cardíaca16. Para nossa surpresa, alguns testes mostraram aumento nos escores do grupo submetido a fisioterapia três vezes por dia. Até onde sabemos, este é o primeiro estudo a avaliar a influência de fisioterapia na função cognitiva. Na nossa prática clínica, observamos que tanto a função pulmonar quanto a neurocognitiva de pacientes submetidos a CRM evoluem melhor quando aqueles são submetidos a sessões de fisioterapia mais frequentes, enfatizando a interação dinâmica entre corpo e mente. Isso nos levou a planejar este projeto para melhor avaliar tal efeito. O tamanho da amostra foi a limitação mais importante deste estudo. No entanto, mesmo sem um número grande de pacientes e com um protocolo de fisioterapia relativamente simples23, nossos resultados confirmam a hipótese de que pacientes submetidos a maior número de sessões de fisioterapia por dia apresentam melhor recuperação cognitiva até a alta hospitalar. Sugerimos que uma maior intensidade de fisioterapia durante a hospitalização aumente o número de sinapses no sistema cortical aferente e melhore a comunicação neuronal, resultando em minimização ou mitigação dos distúrbios neurocognitivos causados pela cirurgia cardíaca. 396 Arq Bras Cardiol. 2014; 103(5):391-397 Cavalcante e cols. Fisioterapia após cirurgia de revascularização miocárdica Artigo Original Conclusão Como demonstrado neste estudo, a CRM com BCP leva a alterações das funções pulmonar e neurocognitiva no período pós-operatório, podendo comprometer a evolução clínica dos pacientes. A fisioterapia respiratória é uma maneira de minimizar o dano à função pulmonar nessa população. Para nossa surpresa, houve melhora das funções neurocognitivas no grupo submetido a maior número de sessões de fisioterapia respiratória por dia, com melhora de seus níveis peroperatórios, sugerindo que pacientes mais estimulados têm melhor desenvolvimento neurocognitivo. Faltam estudos correlacionando fisioterapia respiratória e função neurocognitiva no pós-operatório de cirurgia cardíaca. Nossos resultados encorajam estudos adicionais sobre esse tópico. Esta nova abordagem abre um caminho de investigação, não apenas para a possibilidade de redução do dano neuropsicológico secundário à cirurgia cardíaca com BCP, mas ainda como uma simples e prática estratégia para prevenir ou minimizar tais alterações. Contribuição dos autores Concepção e desenho da pesquisa: Cavalcante ES, Conforti CA, Carvalho ACC, Buffolo E, Luna Filho B; Obtenção de dados: Cavalcante ES, Magario R; Análise e interpretação dos dados: Cavalcante ES, Magario R, Luna Filho B; Análise estatística: Luna Filho B; Redação do manuscrito: Cavalcante ES, Cipriano Júnior G, Arena R, Luna Filho B; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual importante: Cavalcante ES, Conforti CA, Cipriano Júnior G, Carvalho ACC, Buffolo E, Luna Filho B. Potencial conflito de interesse Declaro não haver conflito de interesses pertinentes. Fontes de financiamento O presente estudo não teve fontes de financiamento externas. Vinculação acadêmica Este artigo é parte de Dissertação de Mestrado de Elder dos Santos Cavalcante pela UNIFESP - Escola Paulista de Medicina. Referências 1. van Harten AE, Scheeren, TW, Absalom AR. 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